معلومة

كيف يمكنك تثبيت الإنزيمات في الكريات المصنوعة من السليلوز الجريزوفولفين؟

كيف يمكنك تثبيت الإنزيمات في الكريات المصنوعة من السليلوز الجريزوفولفين؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أرغب في صنع كريات تتكون أساسًا من ما يلي:

  • السليلوز الجريزوفولفين
  • السكروز
  • نشا الأرز
  • حمض الاسكوربيك
  • جلسيرين

و إنزيم كمكون نشط.

بالإضافة إلى ذلك ، هل من الضروري إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني أو غيرها من المثبتات لتظل نشاط الإنزيمات لمدة عام واحد على الأقل أو هل الحفاظ على البيئة الجافة كافٍ؟

يسمى الإنزيم الهستاميناز ويتم استخراجه من قشرة الكلى من خلال سلسلة من الطرد المركزي والترشيح والديالة. لكي نكون أكثر دقة ، فهو عبارة عن مستخلص بروتين سائل يحتوي على كميات صغيرة من هذا الإنزيم. لم يتم إضافة أي عازلة وما إلى ذلك إلى مستخلص البروتين حتى الآن. تتم عملية التنقية بأكملها عند 4 درجات مئوية. لا أعرف كم من الوقت يكون الإنزيم مستقرًا دون مزيد من التحضير. ربما لم يمض وقت طويل لأن بعض البروتياز يجب أن يبقى في التجانس الطبيعي من قشرة الكلى الخنازير. المكونات الأخرى من الكريات ذات جودة صيدلانية. الهدف من هذه التجربة هو إطعام الكريات للكلاب التي تعاني من مشاكل في الجهاز الهضمي. لهذا الغرض ، ستحصل الكريات على غلاف معوي للبقاء على قيد الحياة في البيئة الحمضية للمعدة.


كما يمكنك أن تخمن من تعليقي ، هناك ملف قطعة أرض من العوامل التي يجب مراعاتها عند التفكير في استقرار البروتين. هذا ما أنصحك به.

أولاً ، تأكد من أن مستخلصك موجود في مخزن مؤقت محايد ، مثل PBS أو HEPES أو شيء مشابه. هذا إجراء قياسي إلى حد ما عند العمل مع البروتينات. بعد ذلك ، نظرًا لأن هذا مستخلص الكلى ، فمن المحتمل أن يكون هناك كتل من البروتياز حوله ، لذلك أوصي بشدة بإضافة مثبطات البروتياز واسعة الطيف ، والحفاظ على المستخلص باردًا قدر الإمكان لمنع أي نشاط إنزيم. أود أيضًا إضافة BSA عند 10 ملغ / مل ، لتثبيت البروتينات ومنعها من الترسب أثناء التواجد في المحلول ، ولتقليل فرص أن أي بروتياز موجود سوف يهاجم الإنزيم الذي يهمك.

بمجرد أن يكون الحل الخاص بك مستقرًا ، سأقوم بتقسيمه وتجفيفه بالتجميد. البروتياز هو الأكثر نشاطًا في المحلول ، لذلك بمجرد أن يجف سوف يقلل نشاطه أكثر. يمكنك الآن إضافة المكونات الخاملة (السليلوز الجريزوفولفين ، وما إلى ذلك) ، وخلطها جيدًا ، والضغط على الأقراص ، وإضافة الغلاف المعوي. أخيرًا ، بمجرد إعداد كل شيء ، سأخزن المنتج النهائي في درجة حرارة باردة بقدر ما هو مناسب. مرة أخرى ، سوف يمنع هذا أي نشاط إنزيم ويمنع التدهور.

لا أعرف ما إذا كان لديك اختبار وظيفي لتحديد نشاط الإنزيم الذي تريده ، ولكن إذا لم تفعل ، فإنني أوصي بشدة بتطوير واحد إذا كان ذلك ممكنًا على الإطلاق. بهذه الطريقة ، يمكنك اختبار نشاط التحضير الطازج للمستخلص ومقارنته بمراحل مختلفة من المعالجة إلى أقراص ، وخاصة البضائع الجاهزة ، للتأكد من أنك لم تفقد الكثير من النشاط. سأختبر أيضًا الأجهزة اللوحية العشوائية على مدار العام للتأكد من أنها لم تفقد نشاطًا في التخزين ، وإلا فلن تتمكن من مقارنة نتائجك التجريبية.


التحلل البيولوجي للسليلوز النانوي من قبل اثنين من الاتحادات ذات الصلة بالبيئة.

تمت مقارنة التحلل البيولوجي للنانوسليلوز مقابل غير النانوسليلوز.

تم استخدام اتحادات مشتقة من الهاضم اللاهوائي مقابل الأراضي الرطبة.

يتحلل حمض الكبريتيك المتحلل بالماء بشكل أسرع من السليلوز الجريزوفولفين.

حدثت تحولات مجتمعية ميكروبية مميزة أثناء تحلل سليولوزين.

كان النانوسليلوز أكثر قابلية للتحلل البيولوجي ، ولكن من المحتمل أن يكون ذلك عبر مسارات مختلفة.


السليلوز الجريزوفولفين المميز المستخلص عن طريق التحلل المائي الحمضي والإنزيمي للذرة الرفيعة الحلوة

يستخدم السليلوز الجريزوفولفين (MCC) على نطاق واسع في صناعات الأدوية والأغذية ومستحضرات التجميل. في هذه الدراسة تمت دراسة طريقة الجمع باستخدام التحلل المائي لحمض الهيدروكلوريك وتنقية الانزيم الليفي لاستخراج MCC من الذرة الرفيعة الحلوة. تم استخدام منهجية سطح الاستجابة لتحسين حالة التحلل المائي لحمض الهيدروكلوريك وبالتالي زيادة إنتاجية MCC ومحتوى السليلوز (النقاء). تم تحديد الظروف المثلى للتحلل المائي لحمض الهيدروكلوريك على أنها تركيز حامض بنسبة 7.0٪ ، ونسبة سائلة إلى صلبة 17.3: 1 ، وزمن 90 دقيقة ، ودرجة حرارة 40 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف ، كان المحصول ومحتوى السليلوز في MCC المستخلص من الحمض 81.8٪ و 93.2٪ على التوالي. لتكرير الإنزيم لـ MCC المستخلص من الحمض ، كانت الظروف المثلى هي جرعة الإنزيم 4000 U / g الركيزة والوقت لمدة ساعتين ، حيث كان الناتج ومحتوى السليلوز و DP من MCC المكرر 80.03٪ و 99.80٪ و 287 على التوالي التي كانت قابلة للمقارنة مع MCC التجاري (Lowa ® PH101). تم استخدام المسح المجهري الإلكتروني ، حيود الأشعة السينية ، مطيافية الأشعة تحت الحمراء لنقل فورييه ، التحليل الحراري الوزني (TGA) ، و 13 C NMR لتوصيف MCC المكرر. أظهر MCC المكرر أشكالًا على شكل قضيب ، وكان له سلسلة من قمم الامتصاص المميزة والمجموعات الكيميائية المتعلقة بالسليلوز على غرار Lowa ® PH101. يعكس نمط حيود الأشعة السينية وطيف 13 C NMR أن مركز التحكم في المحرك المكرر يحتوي على بنية نموذجية من السليلوز الأول. أشارت TGA إلى أن MCC المكرر يتمتع باستقرار حراري جيد. أظهرت هذه الدراسة أن الذرة الرفيعة هي مادة خام محتملة منخفضة التكلفة لإنتاج MCC ، وأن طريقة استخلاص الإنزيم الحمضي المدمجة واعدة لاستخراج MCC عالي النقاء من الركيزة السليلوزية.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


مراجعة لتكنولوجيا المفاعلات الحيوية المستخدمة في التحلل المائي الأنزيمي للمواد السليلوزية

تعتبر السليولاز مكلفة ، وهو التحدي الرئيسي للتحلل المائي الأنزيمي للمواد السليلوزية لإنتاج الإيثانول الحيوي. للحصول على إنتاج فعال للسيليلاز ، تُفضل الفطريات على البكتيريا نظرًا لقدرتها على التخلل واستهلاك الركيزة متعدد الاستخدامات. بعض القيود في خطوة التحلل المائي الأنزيمي تمنع العملية من أن تكون مجدية اقتصاديًا. تم التحقيق في استراتيجيات مختلفة للتغلب على هذه القيود ، بما في ذلك الهندسة الوراثية ، وإعادة تدوير الإنزيمات ، والأحمال الصلبة العالية ، وتقنيات المعالجة المسبقة ، وتكميل السليولاز بالمواد المضافة ، وتطبيق المواد النانوية لتحسين الاستقرار الحراري ودرجة الحموضة في السليولاز. تم إجراء العديد من الدراسات في العديد من المفاعلات الحيوية بهدف الحصول على عوائد أعلى من الجلوكوز في خطوة التحلل المائي الأنزيمي. تشمل العوامل الرئيسية لتصميم مفاعل حيوي الخلط الفعال ، ونقل الكتلة الكافي ، وضغط القص المنخفض ، ومشاكل الرغوة المنخفضة ، والاستهلاك المنخفض للمياه والطاقة. في هذا السيناريو ، تمت مراجعة تكوينات المفاعلات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك المفاعل الحيوي للدبابات المقلبة ، والمفاعل الحيوي الأنبوبي الدوار الأفقي ، والمفاعل الحيوي للجسر الجوي ، والمفاعل الحيوي الغشائي ، والمفاعل الحيوي ذو الألواح الترددية ، والمفاعلات الحيوية للتخمير في الحالة الصلبة لإنتاج السليولاز بهدف التحقيق في العوامل الرئيسية لتصميم مفاعل حيوي .

مجردة رسومية

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


الملخص

تم استخدام تقنية قوالب الكتلة الحيوية التضحية لتحسين أداء الامتصاص للكريات القائمة على CaO والتي تم تحضيرها عبر طريقة البثق والتكوير. تم استخدام خمسة أنواع من مواد الكتلة الحيوية كقوالب: السليلوز الجريزوفولفين ، نشا الذرة ، قشر الأرز ، مسحوق سيسبانيا ، ومسحوق الليكوبوديوم. لقد وجد أن إضافة قوالب الكتلة الحيوية فعالة لتحسين ثاني أكسيد الكربون الدوري2 قدرة امتصاص الكريات المستندة إلى CaO. ومع ذلك ، هناك اتجاهان متعاكسان لتعزيز ثاني أكسيد الكربون2 لوحظ امتصاص مع زيادة إضافة الكتلة الحيوية. بالنسبة إلى السليلوز الجريزوفولفين ونشا الذرة وقشر الأرز ، فإن المزيد من كميات الإضافة ستؤدي إلى تحسين أفضل لثاني أكسيد الكربون2 أداء الامتصاص للكريات المستندة إلى CaO. ويعزى ذلك إلى البنية المجهرية المسامية المتولدة والكميات الكبيرة من الحبوب الصغيرة. ومع ذلك ، بالنسبة لمسحوق sesbania ومسحوق lycopodium ، فإن اتجاه تعزيز متناقص لـ CO2 تم العثور على أداء الامتصاص مع زيادة كمية الإضافة. ربما يرجع ذلك إلى التلبيد المتسارع للمادة الماصة بسبب وجود كميات مفرطة من العناصر المعدنية القلوية. علاوة على ذلك ، تمتلك جميع الكريات القائمة على الكتلة الحيوية والتي تحتوي على CaO قدرة عالية على مقاومة التآكل.


الشلل والخصائص الأنزيمية للغلوتامات ديكاربوكسيلاز من المكورات المعوية البرازية عن طريق الامتزاز التقارب على الكيتين المتجدد

إنزيم الغلوتامات ديكاربوكسيلاز (GAD ، EC 4.1.1.15) هو إنزيم مهم في التخليق الحيوي لحمض جاما أمينوبوتيريك و DL- تحليل حمض الغلوتاميك. في هذه الدراسة ، فإن المكورات المعوية البرازيةتم تجميد GAD الناجم عن طريق الكيتين المجدد (RC) عبر امتزاز محدد لمجال ربط السليلوز (CBD). كان المخزن المؤقت الأمثل للربط 20 مليمول / لتر محلول ملحي فوسفاتي (درجة الحموضة 8.0) ، وكانت سعة ربط RC 1.77 ± 0.11 مجم. cbd-جاد / ز RC تحت هذا الشرط. تمت التوصية بنسبة RC الرطب ومحلول الإنزيم الخام المستخدم في التثبيت إلى 3:50 (جم / مل). لتقييم تأثير تجميد RC على GAD ، تم التحقيق في خصائص تجميد GAD (RC-CBD-GAD). أشارت النتائج إلى أن RC-CBD-GAD كان مستقرًا نسبيًا عند الأس الهيدروجيني 4.4-5.6 ودرجة الحرارة - 20-40 درجة مئوية ، وكانت قيمة الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة المثلى للتفاعل 4.8 و 50 درجة مئوية على التوالي. عندما تم التفاعل مع 5 مليمول / لتر من الكواشف الكيميائية التالية على التوالي ، كان نشاط RC-CBD-GAD بالكاد يتأثر بـ EDTA و KCl و NaCl ، وتم تعطيله بشكل كبير بواسطة AgNO3، MnSO4، MgSO4، CuSO4، ZnSO4، FeCl2، FeCl3، AlCl3، كاكل2, والرصاص (CH3سجع)2. الظاهر كم و الخامسالأعلى كانت 28.35 ملي مول / لتر و 147.06 ميكرول / (جمRC-CBD-GADدقيقة) ، على التوالي. كان الوقت الأمثل لدفعة من التفاعل التحفيزي بدون تحكم خارجي في الأس الهيدروجيني ساعتين. في ظل وقت رد الفعل هذا ، كان لدى RC-CBD-GAD قابلية جيدة لإعادة الاستخدام مع عمر نصف يبلغ 23 دورة ، مما يشير إلى أنها كانت جذابة للغاية لصناعة GABA. باعتبارها حاملة جديدة وفعالة وخضراء لاتفاقية التنوع البيولوجي ، توفر RC طريقة بديلة لتجميد البروتين.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


المواد والأساليب

المواد

Gecarcoidea natalis (بوكوك 1888) و Discoplax hirtipes(Dana 1851) تم جمعها من الغابات المطيرة في الإقليم الأسترالي لجزيرة كريسماس بالمحيط الهندي وشحنها جوًا إلى سيدني حيث تم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية في 12 ساعة: 12 ساعة: دورة مظلمة. تم توفير مياه الصنبور للشرب وتم إطعام السرطانات بأوراق الشجر المتساقطة اللبخ macrophylla ديسف. السابقين بيرس. الأنواع الفرعية ماكروفيلا.

أساليب

تم أخذ عصير الجهاز الهضمي المستخدم في القياسات من أمامي حيوانات التجارب على النحو التالي. تم وضع السرطانات في الجانب البطني لأعلى على لوح من البوليسترين ، وتم إدخال أنبوب بوليثين دقيق في المعدة القلبية عبر الفم والمريء. تم استخدام إسفين بلاستيكي صغير لمنع الفك السفلي من قطع الأنبوب. يمكن جمع ما يصل إلى 2 مل من عصير الجهاز الهضمي البني الداكن عن طريق الشفط اللطيف باستخدام حقنة سعة 2 مل متصلة بالأنبوب. الإجراء لم يضر السرطانات. تم طرد السوائل عند 10000 ز لمدة 5 دقائق (لإزالة بقايا الطعام ، تم استخدام المادة الطافية للتحليلات.يمكن تخزين السائل في 4 درجات مئوية لعدة أيام دون فقدان نشاط الإنزيم.

قياس نشاط الانزيم

أنشطة السليولاز

تم قياس نشاط وأنشطة السليلاز الكلي β-1،4-glucosidase (cellobiase EC 3.2.1.21) و EG (EC 3.2.1.4) في العصير الهضمي المأخوذ من المعدة القلبية لـ Gecarcoidea natalis و Discoplax hirtipes باستخدام نسخ معدلة من أساليب Schulz et al. (1986) وهوجان وآخرون (1988). تم إجراء التفاعلات والحضانات عند 40 درجة مئوية في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل من إبندورف في خلاط حراري إيبندورف. سمح القياس عند 40 درجة مئوية بإجراء مقارنة مباشرة مع بيانات أنشطة السليلاز للافقاريات الأخرى. تم قياس قيم امتصاص العينات باستخدام مقياس الطيف الضوئي LKB Ultraspec II. يتم عرض أنشطة الإنزيمات لكل مل من عصير الجهاز الهضمي. لا يكون التعبير لكل مجم من البروتين مفيدًا في هذه الحالة حيث يتم استخدام العصير الخام نظرًا لأن الجزء الأكبر من البروتين لا يمثل الإنزيم المطلوب ، وهو متغير بدرجة كبيرة وقد يكون مصدره غذائيًا. من المحتمل أن يظل حجم السائل في المعى الأمامي ثابتًا نسبيًا. تم استخدام مخططات Hanes المستمدة من البيانات المتعلقة بنشاط السليلاز بتركيزات مختلفة من الركيزة لتحديد ما إذا كان نشاط الإنزيم يتبع حركية Michaelis-Menten. حيث تم إنشاء هذا ، المعلمات الحركية (كم, الخامسالأعلى) ثم تم حسابها من المؤامرات.

β-1،4 جلوكوزيداز. تم قياس النشاط على أنه معدل إنتاج الجلوكوز من السيلوبيوز (Cat. No. C-7252 Sigma Chemical Corp.، St Louis، MO، USA). تم خلط عصير الجهاز الهضمي (25 ميكرولتر) مع 25 ميكرولتر من 0.1 مول لتر -1 محلول أسيتات (درجة الحموضة 5.5) و 50 ميكرولتر من 2.92 أو 14.61 أو 29.21 أو 58.4 ملي مول لتر -1 سيلوبيوز في نفس المخزن المؤقت ، وتم تحضين الخليط عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم إيقاف التفاعل بإضافة 25 ميكرولتر من 0.3 مول لتر -1 ثلاثي كلورو حمض أسيتيك ، وتم معادلة الحمض الزائد باستخدام 5 ميكرولتر من 2.5 مول لتر -1 كلفن.2كو3. تم تكوير البروتين المترسب بالطرد المركزي عند 10000 ز لمدة 10 دقائق. تم تحضير محلول فارغ (75 ميكرولتر بالإضافة إلى 25 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي) ومعيار (50 ميكرولتر من 7 مول لتر -1 جلوكوز في المخزن المؤقت + 25 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي + 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت) لكل عينة تم تحليلها. وقد مكن هذا من تصحيح امتصاص الخلفية بسبب العصارة الهضمية عند قياس الطول الموجي.

تم قياس تركيز الجلوكوز في 50 ميكرولتر (ناتاليس G.) أو 25 ميكرولتر (د. hirtipes) عينات من خليط الحضانة باستخدام مجموعة مقايسة الجلوكوز التجارية (Sigma Cat No. 510-A). تم تخفيف 50 ميكرولتر أو 25 ميكرولتر إلى إجمالي 100 ميكرولتر بالماء في أنبوب اختبار صغير سعة 1.5 ميكرولتر. بعد ذلك تمت إضافة 1 مل من كاشف اللون المزود مع المجموعة ، ودُفع الخليط على شكل دوامة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تمت قراءة امتصاص العينات عند 445 نانومتر.

يثبط جلوكونو دي لاكتون تنافسيًا بيتا -1،4 جلوكوزيداز (سكريفنر وسلايتور ، 1994 شيويل وسادانا ، 1981 سانتوس وتيرا ، 1985). تم أيضًا تحديد الثابت المثبط للجلوكونو- د -لاكتون على β-1،4-غلوكوزيداز عن طريق قياس نشاط-1،4-غلوكوزيداز في وجود 20 مليمول لتر -1 جلوكونو- د-لاكتون و0-58.43 مليمول لتر. -1 سيلوبيوز.

إندو-β-1،4 جلوكاناز. تم قياس النشاط على أنه معدل إنتاج السكريات المختزلة من الركيزة ، كربوكسي ميثيل السليلوز (Sigma Cat. No. C-5678). تم خلط عصير الجهاز الهضمي (20 ميكرولتر) مع 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت و 100 ميكرولتر من 0.1 و 0.5 و 1 و 2 ٪ (وزن / حجم) كربوكسي ميثيل السليلوز في نفس المخزن المؤقت. احتوت الفراغات على 20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي و 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، بينما احتوت المعايير على 20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي بالإضافة إلى 100 ميكرولتر من الجلوكوز (13 ملمول لتر -1) في المخزن المؤقت و 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت. كان المخزن المؤقت 0.1 مول لتر -1 محلول أسيتات ، درجة الحموضة 5.5 ، يحتوي على 30 مليمول لتر -1 من مثبط β-1،4-glucosidase glucono- d -lactone. تم تحضين العينات والمعايير والفراغات عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتوقف التفاعل بإضافة 25 ميكرولتر من 0.3 مول لتر -1 حمض الهيدروكلوريك. تم بعد ذلك معادلة الحمض الزائد بإضافة 5 ميكرولتر من 2.5 مول لتر -1 كلفن2كو3. تم قياس السكر المختزل المنتج أثناء الحضانة كمكافئات للجلوكوز بطريقة tetrazolium blue لـ Jue and Lipke (1985) باستخدام 5 مليمول لتر -1 جلوكوز كمعيار. تمت قراءة امتصاص العينات والمعايير والفراغات عند 660 نانومتر.

إجمالي نشاط السليلوز. تم قياس نشاط السليلاز الكلي كمعدل إنتاج الجلوكوز من السليلوز الجريزوفولفين (Sigmacell 20). تم خلط عصير الجهاز الهضمي (50 ميكرولتر) مع 100 ميكرولتر من 0.1 ، 0.5 ، 1 أو 2٪ (وزن / حجم) Sigmacell 20 (Sigma Cat. No. S3504) مكون في المخزن المؤقت. تم ضمان تعليق السليلوز عن طريق دوامة السليلوز المخزن على الفور قبل الماصات. احتوت الفراغات على عصير هضمي وعازل بينما احتوت المعايير على عصير هضمي ومخزن و 7 مليمول لتر -1 جلوكوز. كان المخزن المؤقت المستخدم 0.1 مول لتر -1 أسيتات ، ودرجة الحموضة 5.5. تم تحضين الخليط وتحريكه لمدة 60 دقيقة عند 40 درجة مئوية في خلاط حراري إيبندورف قبل إيقاف التفاعل بإضافة 25 ميكرولتر من 0.3 مول لتر -1 ثلاثي كلورو حمض أسيتيك. تمت معادلة الحمض الزائد باستخدام 5 ميكرولتر من 2.5 مول لتر -1 كلفن2كو3 قبل فحص الجلوكوز. تم طرد خليط الحضانة بالطرد المركزي (10000 ز لمدة 10 دقائق) وتحديد تركيز الجلوكوز في قسامة 25 ميكرولتر أو 50 ميكرولتر من المادة الطافية كما هو موصوف لـ β-1،4-glucosidase.

ال كم يتم إعطاء قيم EG ​​و CBH كخليط تفاعل mg الركيزة ml -1 لأن الركائز (كربوكسي ميثيل السليلوز والسليلوز) تتكون من بوليمرات كربوهيدرات متفاوتة الطول ولا تحتوي على كتلة جزيئية موحدة.

أنشطة Hemicellulase

أنشطة إنزيمات hemicellulase laminarinase [endo-β-1،3-glucanase (EC 3.2.1.39)] ، licheninase [endo-β-1،3 1،4 glucanase (EC 3.2.1.73)] ، xylanase [endo- تم قياس -1،4-xylanase (EC 3.2.1.8) و 1،4-β- d -xylan xylanhydrolase (EC 3.2.1.37)] في العصير الهضمي من د. hirtipes و ناتاليس G..

لاميناريناز. تم قياس نشاط Laminarinase على أنه إنتاج السكريات المختزلة من التحلل المائي لل laminarin (من لاميناريا ديجيتاتا سيجما كات. رقم L-9634). تم خلط عصير الجهاز الهضمي (20 ميكرولتر) مع 50 ميكرولتر من 1 ٪ (وزن / حجم) لامينارين و 130 ميكرولتر من 0.1 مول لتر - محلول أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.5. تم تشغيل الفراغات والمعايير في نفس الوقت. تتألف الفراغات من 20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي و 180 ميكرولتر من محلول الفحص ، بينما تتألف المعايير من 20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي ، و 100 ميكرولتر من 13 ملي مول لتر - جلوكوز و 80 ميكرولتر من محلول الفحص. تم تحضين العينات والفراغات والمعايير مع التحريك عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم إيقاف التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من 0.3 مول لتر -1 حمض الهيدروكلوريك وتعادل مع 10 ميكرولتر من 2.5 مول لتر -1 كلفن.2كو3. تم قياس السكريات المختزلة في قسامة 10 ميكرولتر كما هو موضح أعلاه.

Licheninase. تم قياس نشاط إنزيم licheninase من خلال إنتاج السكريات المختزلة من التحلل المائي لليشينين (من Cetraria Islandica سيجما كات. رقم L-6133). تم خلط عصير الجهاز الهضمي (20 ميكرولتر) مع 100 ميكرولتر من 0.1 ٪ (وزن / حجم) من الليشينين و 80 ميكرولتر من 0.1 مول لتر - محلول أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.5. لتصحيح امتصاص الخلفية لعصير الجهاز الهضمي ، تم تشغيل الفراغات والمعايير في نفس الوقت. شكل عصير الجهاز الهضمي (20 ميكرولتر) و 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمقايسة الفراغ بينما شكّل المعيار 20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي بالإضافة إلى 100 ميكرولتر من 13 ملمول لتر جلوكوز و 80 ميكرولتر من محلول الفحص المعياري. تم تحضين العينات والفراغات والمعايير مع التحريك عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم إيقاف التفاعل مع 50 ميكرولتر من 0.3 مول لتر -1 حمض الهيدروكلوريك ثم تمت معادلة الخليط باستخدام 10 ميكرولتر من 2.5 مول لتر -1 كلفن.2كو3. تم قياس السكريات المختزلة في عينة 10 ميكرولتر كما هو موضح أعلاه.

زيلانيز. تم قياس نشاط Xylanase على أنه إنتاج السكريات المختزلة من التحلل المائي لـ xylan (من خشب البتولا ، بيتولاسيجما كات. رقم X-0502). تم تحضين عصير الجهاز الهضمي (20 ميكرولتر) مع 100 ميكرولتر من 1 ٪ (وزن / حجم) زيلان و 80 ميكرولتر من 0.1 مول لتر - محلول أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.5. تم تشغيل الفراغات (20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي و 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت) والمعايير (20 ميكرولتر من عصير الجهاز الهضمي ، و 100 ميكرولتر من 13 ملي مول لتر -1 جلوكوز و 80 ميكرولتر من محلول الفحص) في نفس الوقت. تم تحضين العينات والفراغات والمعايير مع التحريك عند 40 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد هذه الفترة ، توقف التفاعل عن طريق ترسيب البروتين بـ 50 ميكرولتر من 0.3 مول لتر -1 حمض الهيدروكلوريك وتم تحييده بإضافة 10 ميكرولتر من 2.5 مول لتر -1 كلفن.2كو3. تم قياس السكريات المختزلة في عينة سعة 10 ميكرولتر من خليط التفاعل هذا كما هو موصوف أعلاه.

تم قياس أنشطة β-1،4-glucosidase و EG والسليولاز الكلي على مدى درجة الحموضة 4-9. تم استخدام محلول الأسيتات للحفاظ على قيم الأس الهيدروجيني من 4 و 5.5 ، وتم استخدام محلول Tris لقيم الأس الهيدروجيني الأعلى من 7-9. تم قياس الأس الهيدروجيني لسائل القناة الهضمية اللاهوائية عند 25 درجة مئوية باستخدام عينات مسحوبة حديثًا من السائل من المعي الأمامي ومقياس إشعاع G299a شعري مسرى وعداد إشعاع PHM 73 متر (مقياس إشعاع ، كوبنهاغن ، الدنمارك).

بروتين

تم قياس تركيزات البروتين في عينات عصير الجهاز الهضمي باستخدام مجموعة فحص البروتين BioRad ومعيار γ-globulin البقري (BioRad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

إحصائيات

مقارنات إحصائية (ANCOVA و ANOVA أحادي الاتجاه وثنائي الاتجاه مع Tukey's HSD آخر مخصص الاختبارات) باستخدام حزمة الحوسبة الإحصائية Systat 7 (Systat Software Inc.، Richmond، CA، USA) لحساب الاحتمالات الإحصائية.


مقدمة

يمثل الوقود الحيوي واحدًا من العديد من بدائل الطاقة المتجددة المهمة للوقود الأحفوري مع إمكانية تقليل التأثيرات البشرية على تغير المناخ. يستمد الوقود الحيوي السليلوزي الطاقة من الروابط الكيميائية المخزنة بواسطة النباتات على شكل سليلوز ، وبوليمر جلوكوز ، ومكون هيكلي أساسي لجدران الخلايا النباتية (Somerville et al. ، 2004). يمكن إنتاج الكتلة الحيوية الغنية بالسليولوز بمدخلات أقل من محاصيل الجيل الأول من الوقود الحيوي ، مثل الذرة الغنية بالنشا ، ومع ذلك ، يصعب تحطيم السليلوز (دينان ، 2014). بمجرد إزالة بلمرة السليلوز إلى جلوكوز ، يمكن تحويل السكر ميكروبيًا أو كيميائيًا إلى وقود ومواد كيميائية مثل الإيثانول أو البوتانول أو بدائل البنزين ووقود الطائرات والديزل الأخرى.

في حين أن السليلوز وفير ، فإن الوصول إلى السكر بداخله يمثل تحديًا. لتحلل الكتلة الحيوية كيميائيًا ، تعمل العديد من الإنزيمات بالتنسيق ، وأكثرها وفرة هو إنزيم السليولاز Cel7A (باين وآخرون ، 2015). تزيل إنزيمات Cel7A cellobiohydrolase بلمرة السليلوز إلى وحدة التكرار الأساسية المكونة من جزيئين جلوكوز - السليلوبيوز. تعاني هذه الإنزيمات من تثبيط بواسطة هذا المنتج ، والذي يظل باقياً في المواقع النشطة للأنزيمات وبالتالي يؤخر دوراتها التحفيزية (Silveira and Skaf ، 2015). يتراكم السيلوبيوز على مدار التفاعل ما لم تتم إزالته بواسطة إنزيم مثل β-glucosidase ، والذي يشق السيلوبيوز وينتج جزيئين من الجلوكوز (Payne et al. ، 2015). يواجه Cel7A تثبيطًا مختلطًا بواسطة السيلوبيوز ، يمكن للجزيء أن يتنافس بشكل تنافسي مع سلسلة السليلوز للربط في مواقع ربط الركيزة بالإضافة إلى تثبيط الإنزيم بشكل غير تنافسي عن طريق تأخير الحركة العملية كنتيجة للاستمرار في موقع ربط المنتج (Jalak et al . ، 2012 Payne et al. ، 2015). تظهر القياسات على السليلوز البلوري أن Cel7A يفقد نصف نشاطه في وجود تركيزات السيلوبيوز بترتيب 2.6 ملي مولار (Teugjas and Väljamäe ، 2013) إلى 19 ملي مولار (مورفي وآخرون ، 2013). يعتبر تثبيط المنتج أمرًا شائنًا بشكل خاص في التحويل الأنزيمي للكتلة الحيوية اللجنوسيليلوزية إلى الجلوكوز تحت أحمال الركيزة العالية المطلوبة للتصنيع التجاري للوقود الحيوي ، ويمثل عائقًا أمام تحقيق إنتاجية عالية من المنتجات اللازمة لعملية فعالة (Bu et al. ، 2012 Payne et آل ، 2015). لسوء الحظ ، فإن معالجة هذه المشكلة باستخدام إنزيم β-glucosidase الذي يخفف تثبيط المنتج وحده ليس حلاً شاملاً. نشاط بيتا جلوكوزيداز محدود بسبب تثبيط المنتج الخاص به من الجلوكوز ، وكذلك عن طريق حمض الجلوكونيك (الناتج عن نشاط عديد السكاريد أحادي الأكسجين (LPMO)) (Payne et al. ، 2015).

الإنزيمات هي واحدة من أغلى مكونات عملية الوقود الحيوي السليلوزي البيوكيميائية (Klein-Marcuschamer et al. ، 2012). لذلك ، قد يؤدي تحسين كفاءة Cel7A عن طريق تخفيف تثبيط المنتج إلى انخفاض متطلبات الإنزيم للعملية وبالتالي إلى وقود متجدد أرخص وأكثر تنافسية من حيث التكلفة مع الوقود الأحفوري. تحقيقا لهذه الغاية ، قامت العديد من المجموعات البحثية بالتحقيق في طرق لجعل إنزيمات Cel7A أقل عرضة لتثبيط السيلوبيوز. كانت الإستراتيجية السائدة للتخفيف من تثبيط المنتج هي اضطراب ارتباط السيلوبيوز في الموقع النشط للإنزيم عن طريق الطفرات الموجهة للموقع للبقايا الأكثر مسؤولية عن هذا التفاعل (Hanson et al. ، 2014 Payne et al. ، 2015 Silveira and Skaf ، 2015). الطفرات في Trichoderma reesei (هيبوكريا جيكورينا) Cel7A (آريقال إن بقايا Cel7A) R251 و R394 أدت إلى تقليل تثبيط المنتج (Hanson et al. ، 2014). خمسة أضعاف آرتم العثور على Cel7A mutant (E223S / A224H / L225V / T226A / D262G) المصمم في عام 2001 لتغيير درجة الحموضة المثلى بشكل مماثل لتخفيف تثبيط السيلوبيوز وتقليل نشاط السليولاز الكلي (Becker et al. ، 2001). في الآونة الأخيرة ، وجدت دراسات طفرة النقطة الحسابية في نفس الإنزيم أن البقايا الطافرة R251 أو D259 أو D262 أو W376 أو Y381 إلى ألانين أضعفت بشكل كبير الارتباط المحسوب للسيلوبيوز في الإنزيم (Bu et al. ، 2011 Payne et al. ، 2015) ). ومع ذلك ، بالنسبة للعديد من هذه المخلفات ، لم يتم إثبات أي دليل تجريبي يؤكد ذلك.

تحققت عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD) الحديثة التي أجراها Silveira و Skaf حسابيًا في تأثيرات طفرات Cel7A المختلفة على ارتباط السيلوبيوز ، بالإضافة إلى أي اضطرابات هيكلية مستحثة للإنزيم (Silveira and Skaf ، 2015). بنيت هذه المحاكاة على حسابات سابقة (Bu et al. ، 2011) وتشير معًا إلى عدد قليل من الطفرات التي يُتوقع أن تعطل تقارب ارتباط الخلية السيلوبيوز (Silveira and Skaf ، 2015). كان الهدف من دراستنا هو إنتاج متغير Cel7A مع تثبيط منخفض للسيلوبيوز. قمنا بتوليد طفرات تجريبية تم تحديدها بواسطة محاكاة MD (Silveira and Skaf ، 2015) وقمنا بتقييم قدرتها على تحلل السليلوز الجريزوفولفين في وجود السليلوز.


خلفية

يعتمد التطور الطبيعي للنبات بشكل حاسم على التفاعلات بين المكونات المختلفة لجدار الخلية النباتية. تحدد هذه البنية الديناميكية البنية المورفولوجية للنبات وهي مسؤولة عن شكل الخلية والالتصاق الخلوي وتماسك الأعضاء [1]. يتم بدء جدران الخلايا النباتية عن طريق تخليق وإفراز وتعديل وتشابك مكونات الجدار الفردية - السليلوز ، والهيميسليلوز ، والبكتين ، والبروتينات السكرية الغنية بالهيدروكسي برولين - ويتم تصنيعها من خلال العمل المنسق لعدد لا يحصى من الجليكوزيل ترانسفيرازات. إن فهم الآليات الأساسية التي ينطوي عليها تجميع شبكة عديد السكاريد المعقدة وتوضيح أدوارها البيولوجية ليس مهمة تافهة [2] ، ولا يزال حتى الآن هدفًا رئيسيًا للعلماء المهتمين بمعالجة بنية جدار الخلية النباتية لفهمها بشكل أفضل. الوظائف والسماح بالاستغلال التجاري.

أحد الأنظمة النموذجية التي تكتسب اعترافًا متزايدًا وأهميتها لدراسة تفاعلات عديد السكاريد لجدار الخلية هو طبقة البشرة بطبقة بذور الأرابيدوبسيس (SCE) ، والتي يشار إليها أيضًا باسم خلايا الأمين الصمغي (MSC) [1]. يعد SCE نظامًا نموذجيًا ممتازًا لفهم الأساس الجيني للتخليق الحيوي لجدار الخلية وإفرازه وتجميعه وتعديله [3 ، 4] لأنه يمكن استخراج كميات كبيرة من عديدات السكاريد الموجودة في جدار الخلية بسهولة وتحليلها في إطار زمني قصير. بين 5 و 8 أيام بعد التخليق (DPA) ، يتم إفراز كميات كبيرة من البكتين إلى الفضاء الساتلي عند تقاطع الجدران الأولية المماسية والشعاعية الخارجية ، مما يشكل جيبًا على شكل دونات من الصمغ حول عمود السيتوبلازم [4] . ثم تقوم خلايا البشرة بتركيب جدار ثانوي على شكل بركان (9 إلى 11 DPA) يسمى الكولوميلا ، والذي يبرز من خلال مركز جيب الصمغ ويتصل بالجدار الأساسي. عندما تشرب البذور الجافة الناضجة الماء ، يؤدي تمدد الصمغ السريع إلى تمزق SCE العرضي لإطلاق الصمغ الغني بالسكاريد المنظم في طبقتين متميزتين: طبقة خارجية غير لاصقة قابلة للذوبان في الماء وطبقة داخلية ملتصقة تظل ملتصقة بإحكام سطح معطف البذور. يتكون صمغ نبات الأرابيدوبسيس بشكل أساسي من Rhamnogalacturonan-1 (RG-I) ، بكميات صغيرة من Homogalacturonan (HG) ، السليلوز ، و Arabinoxylan الموجودة في الطبقة الداخلية [3 ، 5]. تم إجراء عدة محاولات لفهم الأدوار الوظيفية للجليكوزيل ترانسفيرازات المشاركة في التركيب الحيوي لجدار الخلية وإفرازها وإيصال بوليمرات الصمغ من خلال تحليل طفرات الصمغ. في السنوات الأخيرة ، تم تحديد وتوصيف الطفرات الجينية التي تفتقر إلى الإنزيمات الوظيفية اللازمة للتخليق الحيوي للصمغ والبثق ، لكن العديد من الآخرين ينتظرون إجراء تحقيق وظيفي.

حدد العمل حتى الآن العديد من الجينات / البروتينات المشاركة في التخليق الحيوي للصمغ ، بما في ذلك بروتين أرابينوجالاكتان الشبيه بالفاسيكلين (AGP) المسمى SALT OVERLY SENSITIVE 5 (SOS5) و GALT2 و GALT5 ، وهما جلاكتوزيل ترانسفيراز مسؤولان عن بدء الارتباط بالجليكوزيل لمستقبلات AGPs. مثل الكيناز الذي يسمى FEI2 الفردي وكذلك المسوخات عالية المستوى المقابلة لهذه الجينات / البروتينات تتميز بإعادة تقسيم البكتين الصمغي والغياب الملحوظ للأشعة السليلوزية ، بينما يظل تلطيخ السليلوز المنتشر كما هو [6]. نظرًا لأن SOS5 ، المعروف أيضًا باسم FLA4 ، هو AGP الوحيد المميز الذي تم الإبلاغ عن مشاركته في التخليق الحيوي للصمغ ، فإن مساهمة شقوق الجليكان SOS5 وربما AGPs الأخرى في تكوين الصمغ بعيد عن الاكتمال ويقدم لغزًا يستحق التفكك.

AGPs هي عائلة من البروتينات السكرية الغنية بالهيدروكسيبرولين والتي يتم ربطها على نطاق واسع بالجليكوزيلات مع النوع الثاني AGs التي ترتبط تساهميًا ببقايا الهيدروكسي برولين في العمود الفقري لبروتين AGP [7 ، 8]. يتكون النوع الفردي من النوع II AG glycan من العمود الفقري β-1،3-galactan مع فروع β -1،6-galactosyl المزينة بمخلفات الأرابينوسيل وغالبًا مع مخلفات السكر الثانوية الأخرى ، مثل حمض الجلوكورونيك (GlcA) ، الرامنوز ( Rha) ، و Fuc [8 ، 9]. على الرغم من أن دورها الدقيق في تكوين الصمغ لا يزال غير واضح ، فإن تفاعل AGPs مع عديد السكاريد الجداري ، ومشاركتها في شلالات الإشارات داخل الخلايا ، وتأثيرها على مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية معروفة [8 ، 10]. وتجدر الإشارة إلى أن تعقيد شبكة بوليمر جدار الخلية فيما يتعلق بـ AGPs ربما يكون أفضل توضيح له من خلال اكتشاف أن AGPs تشكل روابط تساهمية لكل من RG-I و arabinoxylan [10].

تم تمييز ثلاثة غلوكورونوزيل ترانسفيرازات (GLCATs) و GLCAT14A و GLCAT14B و GLCAT14C وظيفيًا ووجد أنها تنقل بقايا GlcA إلى AGPs [11] ، بينما تم الإبلاغ أيضًا عن اشتراك اثنين من GLCATs إضافيين (GLCAT14D و GLCAT14E) في غلوكورونيد AGPs [12]. هنا ، نقدم دليلًا على أن اثنين من GLCATs (GLCAT14A و GLCAT14C) ينتميان إلى عائلة GT14 في نظام تصنيف الإنزيمات النشطة للكربوهيدرات (CAZy) (http://www.cazy.org [13]) مهمان للغاية في تكوين مصفوفة الصمغ في أرابيدوبسيس.


بعض التعديلات على بلورات السليلوز النانوية لمستحلبات بيكرينغ الوظيفية

بلورات السليلوز النانوية (CNCs) عبارة عن جزيئات غروانية سالبة الشحنة معروفة جيدًا بتكوين مستحلبات بيكرينغ خالية من الفاعل بالسطح مستقرة للغاية. يمكن أن تختلف هذه الجسيمات في كثافة شحنة السطح اعتمادًا على تحضيرها عن طريق التحلل المائي الحمضي أو تطبيق المعالجات اللاحقة. تم تحضير CNCs بثلاث كثافات مختلفة لشحنة السطح تقابل 0.08 و 0.16 و 0.64 e نانومتر −2 ، على التوالي. قد تؤدي المعالجة اللاحقة أيضًا إلى زيادة كثافة الشحن السطحي. بدائل الأكسدة المعروفة TEMPO بوساطة C6- مجموعات الهيدروكسيل بواسطة C6- مجموعات كربوكسيل على السطح. لقد أبلغنا أن هذه CNC المعدلة المختلفة تؤدي إلى مستحلبات زيت في الماء مستقرة. قد يكون CNC المؤكسد TEMPO أساسًا لمزيد من التعديلات. من الواضح أنها يمكن أن تؤدي ، على سبيل المثال ، إلى استخدام CNC مسعور بطريقة بسيطة باستخدام أملاح الأمونيوم الرباعية التي تسمح بإنتاج مستحلبات معكوسة من الماء في الزيت. يختلف عن تعديل CNC قبل الاستحلاب ، يمكن إجراء التعديل على القطرات بعد الاستحلاب. تسمح هذه الطريقة بإعداد الكبسولات الوظيفية وفقًا لعملية طبقة تلو طبقة. As a result, it is demonstrated here the large range of use of these biobased rod-like nanoparticles, extending therefore their potential use to highly sophisticated formulations.

This article is part of the themed issue ‘Soft interfacial materials: from fundamentals to formulation’.

1 المقدمة

Emulsion stabilization is conventionally achieved by the addition of amphiphilic surfactants to reduce interfacial tension. However, it is now well established that surfactant-free dispersions can be stabilized by dispersed solid particles to form the so-called Pickering emulsions [1–4] for which colloidal-size particles may be irreversibly anchored at the oil–water interface. Pickering emulsions typically require an interfacial solid material that exhibits an affinity for the two phases of the emulsion [3,5] and present the double advantage of being extremely stable and requiring a very small quantity of particles. Research efforts are currently focused on the development of environmentally friendly renewable materials [6–8]. Cellulose constitutes the most abundant renewable polymer resource available today. Therefore, solid cellulosic particles with their low carbon footprint and low density are of particular interest for various applications such as composites, cosmetics, pharmaceutics or medical implants.

As a chemical raw material, cellulose has been used in the form of fibres or derivatives for nearly 150 years for a wide spectrum of products and materials in daily life. In the 1950s, it was demonstrated that cellulose fibres are composed of microfibrils that can be defibrillated and produce long semi-crystalline wires constituted of crystalline rod-like residues alternating with less ordered amorphous domains. The solid crystalline part may be recovered from preferential hydrolysis of the amorphous regions of cellulose fibres. This hydrolysis leads to highly crystalline solid rod-like particles known as cellulose nanocrystals (CNCs) [9,10]. In the materials science community, CNCs have reached a high level of attention that does not appear to be diminishing. These biopolymeric assemblies warrant such attention not only because of their inherent biodegradability, renewability and sustainability, in addition to their abundance, but also because of their impressive physical and chemical properties.

Nanocrystals of various dimensions can be obtained depending on the source. The most common sources include, among others, cellulose fibres from cotton, ramie, hemp, flax, hardwood and cotton linter pulp, microcrystalline cellulose, bacterial cellulose and tunicates [11–13]. The CNCs generally used are obtained from wood and cotton through sulfuric acid hydrolysis. This hydrolysis results in charged nanoparticles with a length of approximately 160–200 nm and a cross section of approximately 7–25 nm, making them natural anisotropic rods that can be used as platforms for various modifications. This platform can appear under various more or less sulfated forms depending on the hydrolysis condition. It may even be totally desulfated which leads to more aggregated systems as revealed by visual opacification of the suspension [14,15].

CNCs have recently been used as emulsion stabilizers by taking advantage of their self-assembling ability at the oil–water interface, similar to particle-stabilized Pickering systems [16,17]. They thus lead to the formation of ultrastable and monodispersed oil-in-water emulsions. Depending on the biological source, CNCs can form crystals with various aspect ratios, up to several micrometres long, but with a section that is always around 10–30 nm. They all present the ability to stabilize oil-in-water emulsions [13]. However, depending on the morphology and the quantity of nanocrystals involved, they can be used to prepare either individual droplets or three-dimensional networks with interconnected droplets, as well as emulsions of varying coverage, thereby modulating the porosity of the interface and visco-elasticity of the emulsion. CNC is a crystalline colloid it is then a perfectly ordered solid particle with well-defined faces. The stabilization at the interface is attributed to the less hydrophilic crystalline plane of the crystal. This plane is of minor importance in terms of surface area as it is located at the corner of the cellulosic crystals. Defined as (2 0 0) crystalline plane for cotton Iβ allomorph, it is considered flat, exposing at the surface a repetition of the CH groups of the glucosyl moieties without hydroxyl functions [17,18]. Neutron scattering experiments showed clearly that rigid nanoparticles can be densely adsorbed at the oil–water interface without deforming it at the nanoscale confirming the postulate that interactions involve only the crystal surface and oil, the particle residing in water only [19]. Above these dimension variations, CNCs are versatile solid platforms for significant chemical reaction by covalent and non-covalent surface modification as reported in several reviews [20,21].

This work focuses on the modulation of the surface chemistry of CNCs and their chemical transformations for emulsion processing. It shows that their amphiphilic character is maintained after various modifications. Several ways are illustrated for CNC stabilized emulsions providing versatile surfactant-free functional emulsions in order to control the droplet dispersion in formulations.

2. Experimental procedure

(a) Sample preparation

Sulfated cotton CNCs were prepared from Whatman filters (grade 20 Chr), based on a previous process using sulfuric acid hydrolysis at two concentrations (58 or 64%) and different conditions. The slightly sulfated CNC-S was hydrolysed with 58% H2وبالتالي4 and kept at 65°C under stirring for 20 min. The medium sulfated CNC-M and the highly sulfated CNC-H samples were hydrolysed with 58% and 64% H2وبالتالي4, respectively, and kept under stirring at 70°C for 20–30 min. After hydrolysis, the prepared suspensions were systematically washed by centrifugation, dialysed to neutrality against Milli-Q water, and deionized using mixed bed resin (TMD-8). The final dispersions were sonicated for 10 min (ultrasonic Qsonica Q700 Misonix, Inc., NY, USA), filtered and stored at 4°C.

TEMPO-mediated oxidation of CNCs was performed using 4-acetamido-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinidyloxy radical (TEMPO) as a catalyst, according to the method described by Saito وآخرون. [22]. The CNCs were suspended in water containing TEMPO (0.075 mmol g −1 of cellulose) and sodium bromide (1.25 mmol g −1 of cellulose). The TEMPO oxidation was started by adding the desired amount of sodium hypochlorite solution (3.6 mmol g −1 of cellulose) and was continued at room temperature while stirring. The pH was kept at 10 by adding sodium hydroxide. The TEMPO-oxidized CNCs were subsequently thoroughly washed with water by centrifugation, dialysis and filtration.

Hydrophobic surface modification of CNCs was done with quaternary ammonium salts. The pH of the CNC suspension (0.1 wt%) was adjusted to 10 using NaOH aqueous solution in order to have the carboxyl groups on the surface of the CNCs fully dissociated. The CNC suspension was then added dropwise into desired amount of stearyltrimethylammonium chloride solution (0.1 wt%). The suspension was kept at 60°C for 3 h, and stirred at room temperature overnight. The suspension was then dialysed against Milli-Q water to remove NaCl formed during the adsorption and unbound quaternary ammonium salts. The final suspension was freeze dried and redispersed in toluene using an ultrasonic treatment for 1 min. The suspensions were then centrifuged for 10 min at 20 000ز to remove possible aggregated excess of quaternary ammonium salts. The resulting pellet was easily redispersed in the desired amount of organic solvent with an ultrasonic treatment.

(b) Characterization of the cellulose nanocrystals

Conductometric titrations were performed to determine the surface charge density according to Kalashnikova وآخرون. [17] with a few modifications. Titration was performed on a total of 10 ml of a cellulose suspension at 10 g l −1 in water for CNC sulfated and neutrals, and in 5 mM HCl for CNC-TEMPO, with freshly prepared NaOH. Sulfate groups being only positioned at the surface, results in millimole per gram were calculated from dimensions obtained by microscopies and given as an average amount of elementary charge per square nanometre (e nm −2 ).

Dimensions were determined by image analysis. For transmission electron microscopy (TEM), the suspensions were sonicated just before deposition on a substrate of a freshly glow-discharged carbon-coated copper grid and negatively stained with phosphotungstic acid at 1%w/v adjusted to pH 6. The grids were observed with a Jeol JEM 1230 TEM at 80 kV. For atomic force microscopy (AFM), a drop of CNC suspension freshly sonicated and filtered at 0.1 g l −1 was deposited on freshly cleaved mica covered with a positive polyelectrolyte (poly(allylamine hydrochloride), PAH). The sample dried under ambient conditions was analysed using tapping mode AFM (Innova AFM, Bruker, Santa Barbara, CA, USA).

Transmission wide-angle X-ray scattering (WAXS) diffractograms of samples lyophilized and dried in a desiccator were recorded with a Bruker D8 Discover diffractometer (Madison, WI, USA) using Cu Kα1 radiation (λCu Kα1=1.5405 Å) produced by a sealed tube at 40 kV and 40 mA. The average dimension of the crystal perpendicular to the diffracting planes with hkl Miller indices, Dhkl, was evaluated using Scherrer’s expression from the width at half-height of intensity.

(c) Emulsion preparation

Oil-in-water (o/w) emulsions were prepared using hexadecane as oil phase and a 20/80 oil/aqueous phase ratio. Practically, emulsions were sonicated with an ultrasonic device with a dipping titanium probe close to the surface (pulsed 2 W ml −1 applied power). The emulsions were all visualized after dilution by light microscopy (BX51 Olympus). Average droplet diameter was measured by image analysis using I mage J software and compared with the drop size distribution determined by laser light diffraction using a Malvern 2000 granulometer equipped with a HeNe laser (Malvern Instruments, UK). The diameter was expressed as surface mean diameter د(3,2) (the Sauter diameter). Similar results were obtained via granulometer and I mage J analysis. Inverse water-in-oil (w/o) emulsions were prepared at a 20/80 water/hexadecane ratio mixed using an ultrasonic device.

Scanning electron microscopy (SEM) images were prepared as previously described [13] from 20/80 styrene/water emulsions obtained by sonication and degassed with nitrogen before polymerization. The resulting beads were washed by repeated centrifugation to reduce the amount of artefactual small droplets appearing during curing. Dried beads were metalized with platinum and visualized with a JEOL 6400F instrument (IMN-Nantes).

3. النتائج والمناقشة

(a) Cellulose nanocrystals modulated in surface charge density

When mixing an aqueous suspension of colloidal CNCs and an oil phase, an ultrastable Pickering emulsion is produced. CNCs are known to serve as platform for several modifications but it is not possible to predict whether or not they might still allow preparing stable emulsions once modified. Basically, CNCs are obtained by acid hydrolysis using sulfuric acid. According to the hydrolysis parameters (mainly concentration in acid, reaction temperature and time), various degrees of substitution might be reached where the hydroxyl groups exposed at the surface are replaced by sulfate ester groups. The surface-modified samples are generally characterized by conductometric titration for the resulting surface charge density. Samples with different sulfate charge densities were prepared and characterized. As a result, three samples were prepared, a slightly sulfated one (CNC-S), one with medium substitution degree (CNC-M) and a third one highly substituted (CNC-H). They were characterized for their surface charge, size and crystallinity (table 1). Some aggregations were observed for CNC-S as illustrated in figure 1, but no clear size variation was noticed for the different samples. The three CNC samples had length of 156±53 nm and width of 16±8 nm giving a similar aspect ratio around 10 (mainly from 7 to 14) whatever the acidic treatment. Since the sulfate charges are known to be responsible for crystal destructuration, these post-hydrolysis treatments were followed by WAXS to evaluate an eventual variation at a crystal level. WAXS diagrams showed a high crystallinity of 85±3% for the three samples. As a result, the various treatments maintained the same crystalline organization.

Table 1. Characteristics of CNCs with three surface charge densities. Crystalline plane dimensions and crystallinity for the elementary unit as determined by WAXS, according to the Miller index maximum and the dimensions of the nanoparticles as determined by AFM.

Figure 1. TEM images of (أ) slightly, (ب) medium and (ج) highly charged CNCs.

These three CNCs were tested for their ability to stabilize emulsions. As a result, in pure water, repulsion between the charged CNC prevented a sufficient surface density of CNC to stabilize the oil–water emulsions instead coalescence occurs and the oil and water phases separate. However adding salt, the different samples were all able to efficiently stabilize o/w emulsions with same drop diameters for more than a year (figure 2). The diameter decreased with مص at low CNC concentration in accordance with the limited coalescence process. The drop diameter is then controlled by the amount of CNC available to stabilize the interface. This domain is followed by stabilization of the diameter values at higher مص. When the same values are plotted as 1/د عكس مص, a linear behaviour appears at low مص and a deviation arises at a critical concentration of 7 mg ml −1 of hexadecane [19]. This change indicates a coverage variation that is possibly due to the limited flexibility of the particles hindering the decrease in radius of curvature and thereby in drop diameter. It results in a denser coverage of the drops.

Figure 2. Mean د[3,2] Sauter diameter with the concentration of particles given in milligrams of CNC per millilitre of hexadecane, the dispersed phase, for the three charged CNCs at a 30/70 hexadecane/water ratio.

Styrene-in-water emulsions with 0.05 M NaCl were prepared with CNCs bearing various surface charge densities and polymerized. SEM images of the resulting beads are shown in figure 3. Some artefactual small droplets arising during polymerization are visible. However, the average size and size distribution of the larger beads is similar to the hexadecane-in-water emulsions allowing comparison. These images confirmed the identical organization at the surface of the individual droplets, showing the CNC curved along the droplets creating a dense armoured layer in all cases.

Figure 3. Scanning electron microscope images of polymerized PS/W Pickering emulsion droplets stabilized by slightly sulfated CNC-S (أ,د), medium sulfated CNC-M (ب,ه) and highly sulfated CNC-H (ج,F).

Based on the previous WAXS results, four characteristic planes of cellulose I, namely (1-10), (110), (102/012) and (200) [11,17,23] were identified. We proposed that the process of stabilization involves this crystalline regular organization of CNCs forming a faceted surface. The (2 0 0) edge planes do not bear charges since they are only composed of CH groups, maintaining the more hydrophobic surface available for interface stabilization [18]. It indicates similar exposure of the crystalline planes, regardless of the charge density. The present results illustrate the low susceptibility of surface charge modulation of CNCs on their ability to adsorb at the interface. It differs from the tendency to aggregation generally observed at low surface charge density such as that illustrated in figure 1, important aggregation seems not to occur on a two-dimensional organization just varying the amount of charges. It appears then possible to modify the surface chemistry of CNCs and subsequently of droplets, without changing any other interfacial parameter.

(b) Surface modification of cellulose nanocrystal for functional droplets

These CNCs might then further be used as a platform for subsequent modifications. As previously described, the sulfuric acid used for the preparation results in sulfate moieties at the surface of the CNCs. Hydroxyl groups have low reactivity, and sulfate groups might be used for chemical modification but they are unfortunately rather labile, being, in particular, readily removed under mild alkaline conditions. Oxidation of the CNCs, whether sulfated or not, with TEMPO results in high anionic surface charges with high densities (1.7 glucose units nm −2 ) arising from dissociated C6-carboxyl groups formed on the surface [24,25]. The use of this technique has been the subject of a number of studies since the first reports of De Nooy وآخرون. in the 1990s, who showed that only the hydroxymethyl groups of polysaccharides were oxidized, whereas the secondary hydroxyls remained unaffected (figure 4).

Figure 4. Schematic of a two-step modification of CNCs.

When submitting the TEMPO-mediated oxidized CNC with an oil phase to emulsification, it appeared clearly that such carboxylated CNC kept stabilizing efficiently oil–water interfaces. Figure 5 shows an example of emulsions stabilized with both unmodified and TEMPO-oxidized CNCs at 5 g l −1 in the aqueous phase in the presence of NaCl to reduce repulsions between the CNCs, with a 20/80 (oil/water) ratio. The average diameter increased from 5 μm for sulfated CNCs to 15 μm using TEMPO-oxidized CNCs. Such modified CNCs are not aggregated due to the highly charged surface, the reason is then attributed to unadsorbed CNCs maintained in suspension in the continuous phase. However, a stable emulsion was prepared. TEMPO oxidation improves chemical modification of cellulose through the presence of carboxylate groups. This opportunity to produce highly functionalized droplets reveals that a much larger range of functional emulsions might be reached as one could be inspired by examples of modification described in several issues dealing with more or less sophisticated modifications [21,26,27].

Figure 5. Compared Sauter diameter distribution, optical microscopy images and photographs of 80/20 hexadecane/water (v/v) emulsions stabilized by unmodified and TEMPO-oxidized CNCs.

A major relevant point is that CNC is a hydrophilic particle. Equivalently to the Bancroft rule for surfactant-stabilized emulsions, the continuous phase for Pickering emulsions is the one in which the particles are preferentially dispersed. This means that CNCs are able to stabilize direct o/w emulsions while predominantly hydrophobic particles should be used to stabilize reverse w/o emulsions allowing compatibility with apolar organic media. Several studies have developed such modifications [28–30] mainly solvent based or using harmful systems, which limit the extension of these finding to industrial scale-up. Efforts to reach an environmentally friendly procedure are needed. A surface modification performed in aqueous solution is more acceptable. For instance, modification using quaternary ammonium salts bearing long alkyl, phenyl, glycidyl and diallyl groups via adsorption was developed based on TEMPO-oxidized CNCs [31]. In this study, hydrophobically modified CNCs were prepared by exchanging the counterions of the Na carboxylate groups of TEMPO-oxidized CNCs with quaternary alkylammonium groups. The successful ionic exchange was proved (i) by the presence of a new peak at 1480 cm −1 in Fourier transform infrared spectra (not shown) corresponding to the trimethyl groups of the quaternary ammonium and (ii) by the dispersability of the modified CNCs in toluene and hexadecane. As illustrated in figure 4, stearyltrimethylammonium chloride was used to graft alkyl chains on CNCs bearing carboxylic acid groups on the surface. The w/o emulsions were prepared using Milli-Q water and 2–4 g l −1 modified CNC dispersed in hexadecane. It resulted in stable inverse emulsions (figure 6) showing that simple hydrophobic modification enables the formation of inverse w/o emulsions.

Figure 6. Water-in-hexadecane emulsion stabilized hydrophobically by CNCs modified by quaternary alkylammonium groups. (نسخة ملونة على الإنترنت.)

As a result, CNC proves to be a versatile nanorod with a large range of various surface modifications. The various modifications obtained here indifferently from native CNC with various surface charge densities, after TEMPO oxidation leading to a highly carboxylated CNC, or hydrophobically modified using acceptable processes, can be used to produce w/o or o/w emulsions and various kinds of functional droplets.

(c) Multilayer drop preparation

It appears then of interest to check if such emulsion would be preserved if modification is carried out directly on the droplet. Coming back to the pristine unmodified sulfated CNCs, negative charges are exposed to the surrounding area. Because these emulsions are highly stable, they can be dropped in a different solution and recovered by centrifugation. Another way of modifying the chemistry consists then of modulating the surface using electrostatic interactions as used in layer-by-layer systems. The change from a negative to a positive surface was carried out by mixing the emulsion with a positively charged polymer, in order to add an extra layer using PAH. The strong association between these two oppositely charged polymers results in the entropy gain resulting from the release of counterions and water molecules. As a result, it is possible to rinse the emulsion by simple repeated centrifugations and keep an isolated positively charged bead. Figure 7 shows SEM images of droplets with a negative monolayer of sulfated CNCs, before (figure 7أ) and after coating with PAH (figure 7ب). These images revealed a very different surface with jammed CNCs, confirming that PAH was deposited on the surface.

Figure 7. SEM images of polymerized PS/W emulsions stabilized by sulfated CNC (أ,د), after addition of a hydrosoluble positive polyelectrolyte (PAH) (ب,ه), and after a second deposition of CNC following a layer-by-layer process (ج,F).

CNCs appear then of great interest as a rigid armour to stabilize droplets that might be functionalized at the surface on demand with non-surface-active agents. It is possible to change the surface chemistry in a second step with multi-layered systems. To check the modification of the surface chemistry and validate the ability to make multi-layered shells, an additional negatively charged layer of alginate previously stained with fluorescent die was used. As shown on the optical microscope with fluorescence detection (figure 8), when the sample is illuminated with a fluorescent light, stained alginate is revealed on the surface of the droplets.

Figure 8. Optical fluorescence microscopy after deposition of a PAH/stained alginate bilayer evidencing a multi-layered shell.

The surface of the capsules was reinforced by adding another layer of CNC. الشكل 7ج shows that CNCs are again appearing clearly on SEM images and the absence of visible droplets by optical fluorescence microscopy showed that the negatively charged alginate did not associate anymore.

These results reveal that such Pickering emulsions constitute good substrates for capsule preparation. It means that taking into account the high stability of CNCs at the oil–water interface, not only modified CNCs can be used to produce functional emulsions, but also post-modifications can be carried out for surface adapted to the required formulation revealing the high versatility of these biobased Pickering emulsions. CNCs appear then as highly relevant particles to process a large range of highly stable surfactant-free functional emulsions.

4. الخلاصة

CNCs are highly versatile nanorods able to stabilize a large range of long-term Pickering emulsions. They appear as platforms for preparation of biobased functional colloidal particles. It is shown that besides the surface charge density variation, a lot of different modifications such as carboxylation might be carried out maintaining the ability of CNCs to stabilize oil–water interfaces. Hydrophobically modified CNCs allow stabilizing w/o emulsions that might also improve the processability and performances of nanocellulose-based materials in apolar media. It is finally illustrated that the high stability of such CNC stabilized emulsion also allows modification of preformed emulsions with an extra layer leading to capsules according to a layer-by-layer process. The different routes described in the present article (figure 9) aim at paving the way for innovative complex formulations and materials in very different targeted applications.

Figure 9. Schematic of the various emulsions based on pristine or modified CNC. (نسخة ملونة على الإنترنت.)

تضارب المصالح

We declare we have no competing interests.

التمويل

D.S. gratefully acknowledges the financial support of INRA and INRA Transfert (Verniscell project). This work has been also funded by the local council programme MATIERES and is a contribution to the Labex Serenade (no. ANR-11-LABX-0064) funded by the ‘Investissements d’Avenir’ French Government programme of the French National Research Agency (ANR) through the A*MIDEX project (no. ANR-11-IDEX-0001-02).


شاهد الفيديو: الأحياء إثرائي - صف 10 - طريقة عمل الانزيم (قد 2022).


تعليقات:

  1. Phelps

    لقد نسيت أن أذكرك.

  2. Tamar

    تماما أشارككم رأيك. الفكر ممتازة، وأتفق معك.

  3. Mautaxe

    أعتقد أنك مخطئ. أنا متأكد. دعنا نناقش.

  4. Vogal

    في رأيي ، هم مخطئون. أنا قادر على إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، يتحدث إليك.

  5. Gardanris

    حق! يذهب!

  6. Brooke

    هذا الفكر العظيم سوف يأتي في متناول يدي.



اكتب رسالة