We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
لقد أجريت مؤخرًا عمليات تحويل shRNA وكنت آمل في الحصول على بعض النصائح حول سبب عدم رؤية أي ضربة قاضية عبر لطخة ويسترن
لقد قمت بنقل العدوى بواسطة خطوط خلايا سرطان الثدي MDAMB468 باستخدام shRNA ضد PTEN من ناقل pLKO.1 lentiviral. لقد اخترت للخلايا المنقولة باستخدام 1ug / ml puromycin لمدة 6 أيام تقريبًا. خلال هذا الوقت كان هناك عدد قليل جدًا من موت الخلايا بين الخلايا مقارنة بلوحة التحكم (الخلايا غير المنقولة مع 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين) ، مما يشير إلى أن تعداء العدوى كانت ناجحة.
بعد 6 أيام حصاد خلاياي من أجل استخلاص البروتين والحمض النووي الريبي. لقد أجريت اختبارًا غربيًا أمس لتقييم الضربة القاضية ، لكنني لاحظت أنه لم يكن هناك أي اختلافات (إن وجدت!) مقارنةً بالتحكم في shGFP. لم أقم بإجراء qpcr حتى الآن لكنني أخطط لهذا الأسبوع.
كنت أتساءل عما إذا كان أي شخص قد واجه شيئًا مشابهًا ، خاصة عند العمل مع PTEN؟ هل يمكن أن تكون الخلايا بحاجة إلى أن يتم اختيارها لفترة أطول (أي أكثر من أسبوع) قبل تقييم ضربة قاضية للبروتين؟
شكرا!
أفترض أنك قمت بنقل البلازميد بشكل مباشر ولا ينتج عنه فيروسات. إذا كنت تريد محولات مستقرة ، فقد ترغب في تربيتها الفرعية والحفاظ عليها لفترة أطول قليلاً. ذلك لأن كفاءة تكامل البلازميدات في الجينوم لا يمكن أن تكون عالية - أقل من 0.1٪ من السكان يحصلون على مقاومة ثابتة من خلال الاندماج في الجينوم. بعد 6 أيام ، ظلت الخلايا سليمة في حالتك. هذا يعني أنك قد تحصل على كفاءة تعداء جيدة وبعد عدة مرات من الانقسام الخلوي ، تم تخفيف البلازميدات وقد تكون التأثيرات منخفضة حتى إذا حافظت الخلايا على المقاومة ضد البوروميسين.
إذا كان التعبير العابر (KD) يعمل في تجربتك ، فقد ترغب في التحقق من مستوى التعبير لهدفك في اليوم 2 أو 3. إذا كنت تفضل خطوط الخلايا المستقرة ، فيمكنك زيادة تركيز البوروميسين ، وإذا وافقت ، يمكنك التقاط مستعمرات مفردة بعد موت الخلايا التي لا تحتوي على البلازميدات في الجينوم. من بين هذه المستعمرات ، يحتوي البعض على نسخ بلازميد أكثر ، والبعض الآخر أقل. يمكنك اختيار الخلايا الأقل تعبيرًا عن أهدافك وكذلك التعبير عن الخلايا بشكل معتدل إذا كنت تريد ذلك. لأنك قد ترغب في رؤية تبعية مستوى التعبير.
بالنسبة لبعض الخلايا ، يتم استخدام 5ug / ml Puromycine وفقًا لهذا الارتباط.
انت على حق تماما. في هذا الشيء وهو فكرة ممتازة. وهي على استعداد لدعمكم.
دعها تقول ذلك - بطريقة خاطئة.
أنت تسمح للخطأ. اكتب لي في PM ، وسوف نتعامل معها.
هناك موقع عن الموضوع الذي يثير اهتمامك.
في رأيي أنك مخطئ. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سنتحدث.