معلومة

خصوصية نوكلياز إصبع الزنك


إذا أردت التأكد من أن ZFN يقطع في موضع معين فقط في الجينوم ، فكم عدد الوحدات الفرعية التي سأحتاجها لضمان ذلك؟

إذا كان الجينوم البشري حوالي 3 مليارات زوج أساسي ، فنحن بحاجة إلى تسلسل يتكون من 16 زوجًا أساسيًا لأن 4 ^ 16 تتجاوز 3 مليارات (إذا كانت أفكاري صحيحة). لكن بعد ذلك لا أفهم تمامًا كيف تدخل الوحدات الفرعية لـ ZFN في هذا.


يبلغ جينوم ثنائي الصبغيات البشري 6.5 مليار نقطة أساس ، لذلك تحتاج إلى إيجاد طول التسلسل الذي يحتمل حدوثه مرة واحدة فقط (بافتراض أن التسلسل عشوائي تمامًا):

4 دولارات ^ ن = 6.5 cdot10 ^ 9 دولار

$ n cdot log (4) = log (6.5) + 9 $

$ n = frac {log (6.5) +9} {log (4)} $

$ n حوالي 16.30 $

وفقًا لهذه المقالة ، يتعرف كل إصبع من ZFN على 3 نقاط أساس ، مما يعني أنك ستحتاج إلى $ frac {18} {3} = 6 دولارات للتعرف على موقع فريد بشكل احتمالي. ومن المثير للاهتمام أن المقالة تقول أيضًا:

يعد مطلب ثنائي الأبعاد ميزة كبيرة لهذا السبب: نظرًا لأن المونومر غير نشط ، لا يحدث الانقسام في مواقع الربط الفردية. يتم تجميع كاشف الانقسام عند الهدف فقط إذا كانت الأصابع تتمتع بخصوصية كافية ، والمتطلب المشترك لربط بروتينين يجلب الخصوصية الكلية إلى نطاق مفيد للغاية ؛ على سبيل المثال ، يحدد بروتينان من ثلاثة أصابع موقع 18 نقطة أساس ، وهو ما يكفي ، من حيث المبدأ ، لاختيار هدف واحد ، حتى في الجينوم المعقد.


التوافق الحيوي وهندسة الأسطح وتوصيل الأدوية والجينات والجزيئات الأخرى

4.32.1.2.2 نوكليازات إصبع الزنك

كانت نوكليازات إصبع الزنك (ZFNs) هي أول نظام بروتين رابط للحمض النووي القابل للبرمجة مستخدَم على نطاق واسع. 11 تتكون ZFNs من سلسلة من بروتينات إصبع الزنك مدمجة في نوكلياز بكتيري لإنتاج نظام قادر على عمل فواصل DNA مزدوجة الشريطة خاصة بالموقع لتمكين تحرير الجينات (الشكل 1 (أ)). توفر بروتينات إصبع الزنك استهدافًا خاصًا بالموقع حيث يتعرف كل منها على تسلسل الحمض النووي من 3 إلى 4 أزواج قاعدية. 6،12 في ZFNs ، يتم استخدام سلسلة من بروتينات أصابع الزنك للتعرف على موقع أطول وأكثر تحديدًا داخل الجينوم. نوكلياز شائع الاستخدام في تقنية ZFN ، مدمج في هذه السلسلة من بروتينات أصابع الزنك ، هو FokI ، والذي يجب أن يتناقص من أجل تقديم DSB. 13 لذلك يتم استخدام زوج من ZFNs معًا لاستهداف وقطع الحمض النووي 14 (الشكل 1 (أ)). كما هو موضح أعلاه ، يؤدي إدخال DSB إلى تنشيط مسار الاستجابة الأصلي لتلف الحمض النووي ، مما يتيح إجراء تعديلات جينية محددة بواسطة HDR. تم تطبيق 15،16 ZFNs بنجاح لتحرير الجينات في الخلايا الجذعية البشرية الجسدية 17 والخلايا الجذعية متعددة القدرات. 18 ZFNs ، مع ذلك ، تمتلك عيبًا متأصلًا. على وجه التحديد ، يعد تجميع مجالات إصبع الزنك الترادفية في سلسلة تقارب عالية أمرًا صعبًا. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت الإجراءات المعملية أنها تستغرق وقتًا طويلاً لأي عامل في المختبر ليس متخصصًا في ZFN ، مما أدى إلى قدر كبير من الجهد المطلوب لإنتاج تحرير فعال. تتمثل الميزة الأساسية لنظام ZFN في استخدام FokI ثنائي الأبعاد ، والذي يمكن أن يزيد من خصوصية استهداف الحمض النووي ويقلل من التأثيرات المستهدفة.


خلفية

فيروس الهربس البسيط من النوع الثاني كسبب لمرض التقرح التناسلي البشري

أنواع فيروسات الهربس البسيط الأول والثاني (HSV-1 و 2 ، على التوالي) ، مع فيروس الحماق النطاقي (جدري الماء) ، هم أعضاء في الهربس عائلة تصنيفية من الفيروسات [1]. يمكن أن تكون العدوى البشرية بهذه الفيروسات المدارية العصبية نشطة أو كامنة [1 ، 2]. العدوى النشطة بفيروس HSV-1 أو HSV-2 تؤدي إلى آفات تقرحية في الغشاء المخاطي للفم أو الأعضاء التناسلية ، على التوالي [3 ، 4] تكون العدوى الكامنة بهذه الأنواع الفيروسية بدون أعراض إلى حد كبير. تحدث عدوى HSV-2 الكامنة بشكل أساسي في الخلايا العصبية للعقد الجذرية العجزية. لذلك ، يمكن القول إن الطيف السريري لـ HSV-2 يشتمل على عدوى أولية نشطة ، متبوعة بالقرار وإنشاء مرحلة مدى الحياة من الكمون [4 ، 5]. تتميز عدوى HSV-2 الأولية بظهور بثور أو حويصلات على الفرج أو القضيب تنكسر لتترك آفات متقرحة ضحلة ومؤلمة [6 ، 7]. تلتئم هذه القرحات تلقائيًا في غضون 2-3 أسابيع ، على الرغم من أن الشفاء يمكن أن يكون بطيئًا جدًا في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة [7]. يتميز Latent-HSV-2 بنوبات متكررة من المرض الإكلينيكي (4-5 في السنة) ويمكن أن يرتبط الوضع السريري المتقطع بين حلقات إعادة التنشيط بإفراز الفيروس المعدي وانتقال HSV-2 في الإفرازات التناسلية. يختلف معدل حدوث عدوى HSV-2 المصحوبة بأعراض جغرافيًا ولكنه أعلى في الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية [8-10]. أصبحت الآفات التناسلية المرتبطة بعدوى فيروس الهربس البسيط -2 النشطة مصدر قلق خاص للصحة العامة ، حيث توجد أدلة تربطها بزيادة خطر اكتساب أو نقل فيروس نقص المناعة البشرية من النوع الأول (HIV-1) عن طريق الاتصال الجنسي [5-8) ]. لذلك ، فإن علاج فيروس الهربس البسيط من النوع 2 وأمراض تقرحات الأعضاء التناسلية الأخرى [9] هو إجراء مقبول عند التفكير في تقليل مخاطر انتقال فيروس العوز المناعي البشري -1 عن طريق الاتصال الجنسي واكتسابه [10-12].

التحديات في الخيارات الحالية لعلاج أو منع اكتساب HSV-2

التدخلات الطبية الحيوية الحالية لعلاج HSV-2 قابلة للتطبيق فقط لتكرار جسيمات HSV-2 بنشاط [13]. هذا يحد من أهميتها السريرية في علاج الآفات التقرحية من HSV-2 فقط [14 ، 15] ، بدلاً من إزالة العدوى. على وجه التحديد ، فإن خيارات العلاج الكيميائي الحالية لعلاج HSV-2 تمنع فقط تكرار الفيروس بشكل نشط ، بينما لا يتأثر الفيروس الكامن. ومع ذلك ، فإن HSV-2 الكامن هو مصدر الحلقات المستقبلية من تقرحات الأعضاء التناسلية بعد إعادة التنشيط أثناء أو بعد نوبة من تثبيط المناعة الناجم عن نزلات البرد ، بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية أو العلاج الكيميائي ، من بين أمور أخرى [16 ، 17]. تمثل هذه الصورة للعدوى الكامنة مدى الحياة والتي يمكن إعادة تنشيطها تحديات فريدة للإدارة الطبية الحيوية لعدوى HSV-2 [18]. كانت هناك جهود كبيرة لتطوير لقاح فعال ضد فيروس الهربس البسيط -2 استنادًا إلى الأدلة الطبية الحيوية الموجودة ، وهي مستمرة [19 ، 20]. على وجه التحديد ، التجارب السريرية العشوائية للمرشحين السابقين للقاح HSV-2 ، والتي تشتمل على البروتينات السكرية المؤتلفة المكونة منفردة أو مزدوجة (gB2 و gD2) المصاغة في مواد مساعدة أو معبر عنها داخل النسخ المتماثل الحية غير المؤهلة (تعطيل دورة مفردة معدية - DISC ، ICP8 طفرة جينية ) أو النواقل الفيروسية المشتقة من HSV-2 المختصة بالنسخ (الطفرة الجينية ICP10) ، أظهرت فعالية جزئية فقط نحو الهدف النهائي المتمثل في الحماية من الانتقال الجنسي أو اكتساب HSV-2 [21-25].

- فيروسات HSV-2 ومفهوم تشريح الجينوم الفيروسي قبل التكامل (PRINT-vGSX)

مثل الأعضاء العامين الآخرين في alphaherpesviridae الفصيلة الفرعية ، HSV-2 عبارة عن فيروس كبير مغلف مع غلاف دهني خارجي مرصع بما لا يقل عن 10 بروتينات سكرية فيروسية ، وطبقة تيجان وسيطة تشتمل على 15 بروتينًا فيروسيًا على الأقل ، و nucleocapsid عشري السطوح يحتوي على جينوم DNA مزدوج الشريطة [26]. الجينوم المتسلسل الكامل لسلالة من HSV-2 ، HG52 (Dolan وآخرون.[27]) ، يكشف أن الحمض النووي الجيني HSV-2 منظم في منطقتين فريدتين من الحمض النووي مزدوج الشريطة (طويل 126 كيلو بايت وقصير 26 كيلو بايت قصير) يرمز لهما بـ Uإل و أنتس. يتم وضع هذه بين قوسين بواسطة تسلسلات متكررة مقلوبة (TRL-IRL و IRS-TRS) التي تسمح بسهولة بالأزمرة وإعادة اتحاد المنطقتين [27 ، 28]. يحتوي الجينوم بأكمله على محتوى G + C بنسبة 70.4 ٪ ، ويتألف من 84 إطار قراءة مفتوحًا ترميز ما يقرب من 74 بروتينًا يمكن تجميعها في ثلاث فئات: (1) الجينات المبكرة المبكرة (التي يعتمد نسخها على بروتين منشط مشفر فيروسيًا ، VP16 ، والذي يشفر بروتينات ألفا الفيروسية) (2) الجينات المبكرة (التي يتم تشغيلها بواسطة بروتينات α والتي تشارك منتجاتها (β البروتينات) في تكرار الحمض النووي) و (3) الجينات المتأخرة، ومنتجاتها (γ البروتينات) عبارة عن بروتينات هيكلية فيريون وبروتينات مطلوبة لتجميع جزيئات الفيروس وخروجها. ترتبط غالبية البروتينات السكرية للمغلف الفيروسي (gD) ارتباطًا مستضديًا بتلك الموجودة في HSV-1 ، في حين أن gG1 و gG2 خاصان بالنوع [27 ، 29]. هذه المجموعة من المنتجات الجينية العديدة ، وكثير منها لا غنى عنه لنمو الفيروس في المختبر، يكمن وراء الفوعة الفعالة التي طورها HSV-2 تجاه التهرب من دفاعات المضيف بما في ذلك منع موت الخلايا المبرمج في الخلية المضيفة المصابة ، وحصار مسارات تحريض وإنتاج مضاد للفيروسات ، والتنظيم السفلي لعرض مستضد HSV-2 في سياق النوع أنا معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) [30].

على أساس خطي مزدوج تقطعت بهم السبل (س) التركيب الجيني للحمض النووي لـ HSV-2 [27] وعمل الدفاعات البدائية المضادة للعاثية المتأصلة في البكتيريا ، ونظام تعديل التقييد (RM) ، وإمكانية مهاجمة وتعطيل أو استئصال الحمض النووي الجيني HSV-2 بشكل مباشر تم اقتراحه كتدخل طبي حيوي بديل جديد ضد فيروس الهربس البسيط -2 [31]. على وجه التحديد ، أظهرنا أن ملف الإشريكية القولونية إنزيم التقييد (REase) -EcoRII ، الذي يشق جينوم HSV-2 بأكثر من 800 ، هو مقدمة مثالية لاستئصال أجزاء من الجينومات المعدية (النسخ النشط) جسيمات HSV-2 أو تعطيل الحمض النووي الجيني الكامن لـ HSV-2 بشكل لا رجعة فيه من داخل الخلايا المصابة. لوحظ أن تسلسل مناظر خصوصية الموقع لـ EcoRII 5'-CCWGG-3 '(W = A أو T) منتشر داخل جينوم المضيف البشري وبالتالي مصدر سمية الجينوم المضيف. حصر هذا الاكتشاف النماذج العلاجية القائمة على HSV-2 / EcoRII على مبيدات الميكروبات فقط [32 ، 33] ، وسلط الضوء على متطلبات هندسة REases الاصطناعية (أو نوكلياز إصبع الزنك - ZFNs) [34-36] مع خصوصية فريدة لتسلسل الجينوم من HSV -2 كسلائف آمنة للاستكشاف العلاجي في الجسم الحي. جروس وآخرون.[37] ، حددت مؤخرًا نوكليازات موجبة محددة من HSV-1 محددة ، مما يدل على أن تعبيرها في الخلايا الليفية الكلوية للقرد الأخضر الأفريقي (COS-7) وخلايا BSR تمنع الإصابة بفيروس HSV-1 في تعدد العدوى المنخفضة والمتوسطة ( MOIs) ، مما أدى إلى انخفاض كبير في الحمل الفيروسي. علاوة على ذلك ، تُظهر الجينومات الفيروسية المتبقية معدلًا مرتفعًا من الطفرات (يصل إلى 16٪) في موقع انقسام النوكلياز ، بما يتوافق مع آلية عمل تعتمد على انقسام الجينوم الفيروسي. سلط هذا العمل الضوء على نوكليازات الضخامة (وأصابع الزنك) كفئة بديلة من العامل المضاد للفيروسات مع القدرة على معالجة الأشكال الفيروسية التكرارية والكامنة [37].

في هذا البحث ، يتم تحديد وتجميع ونمذجة في الجسم الحي يتم تقديم الإمكانات العلاجية لمصفوفات أصابع الزنك (ZFAs) و ZFNs والنواقل الفيروسية التي تحول النمط الجيني ZFN ، مع خصوصية فريدة لتسلسل جينوم HSV-2 ، لأول مرة.


مقارنة بين نوكليازات إصبع الزنك مقابل نوكليازات خاصة بكريسبر لتعديل الجينوم في موضع متلازمة ويسكوت ألدريتش

تعتبر حالات نقص المناعة الأولية ، بما في ذلك متلازمة Wiskott-Aldrich (WAS) ، هدفًا رئيسيًا لاستراتيجيات تحرير الجينوم باستخدام نوكليازات محددة (SNs) لأن عددًا صغيرًا من الخلايا الجذعية المكونة للدم المصححة يمكن أن تعالج المرضى. في هذا العمل ، قمنا بتصميم أنظمة CRISPR / Cas9 الخاصة بجينات WAS وقارننا كفاءتها وخصوصياتها مع نوكلياز إصبع الزنك المتجانسة وغير المتجانسة (ZFNs) ، باستخدام خلايا K-562 كنموذج خلوي ونواة أو تكامل. النواقل الفيروسية الناقصة (IDLVs) للتسليم. أظهرت CRISPR / Cas9 و ZFN SNs المختلفة كفاءة مماثلة عند استخدام nucleofection البلازميد للتسليم. ومع ذلك ، كانت IDLVs المزدوجة التي تعبر عن ZFNs أكثر كفاءة من IDLVs المزدوجة التي تعبر عن Cas9 وتوجيه RNA أو IDLVs الكل في واحد ، معبرة عن Cas9 وتوجيه RNA في نفس المتجه. كانت خصوصية ZFNs غير المتجانسة و CRISPR / Cas9 ، المقاسة بالزيادات في تكوين التركيز γ-H2AX في الخلايا المعدلة بواسطة WAS ، متشابهة لكليهما ، وكلاهما تفوق على ZFNs المتماثل بشكل مستقل عن نظام التسليم المستخدم. ومن المثير للاهتمام ، أننا نظهر أن توصيل SNs ، باستخدام IDLVs ، أكثر كفاءة وأقل سمية وراثية من nucleofection البلازميد. نعرض أيضًا السلوك المماثل لـ ZFNs غير المتجانسة و CRISPR / Cas9 لاستراتيجيات الضربة الجينية الموجهة نحو التماثل ، مع إدخال 88 و 83 ٪ من المتبرعين في موضع WAS ، على التوالي ، بينما عند استخدام ZFNs متجانسة فقط 45 ٪ من عمليات الإدخال كانوا على الهدف. باختصار ، تشير بياناتنا إلى أن CRISPR / Cas9 و ZFNs غير المتجانسة هما بديلان جيدان لمواصلة تطوير استراتيجيات العلاج الجيني القائمة على SN لـ WAS. ومع ذلك ، كان تسليم IDLV من ZFNs متغاير محدد WAS هو الخيار الأفضل لجميع الأنظمة مقارنة في هذه الدراسة.

الكلمات الدالة: CRISPR / Cas9 K562 متلازمة ويسكوت ألدريتش تحرير الجينوم ناقلات الفيروس البطيء التكاملي الناقص (IDLV) نوكلياز إصبع الزنك (ZFN).


الملخص

يعد نقل جينات مستقبلات الخلايا التائية عالية النشوة (TCR) المعزولة من الخلايا الليمفاوية النادرة الخاصة بالورم إلى الخلايا التائية متعددة النسيلة استراتيجية جذابة للعلاج المناعي للسرطان. ومع ذلك ، يؤدي نقل الجينات TCR إلى التنافس على التعبير السطحي والاقتران غير المناسب بين سلاسل TCR الخارجية والداخلية ، مما يؤدي إلى نشاط دون المستوى الأمثل وخصائص مستضد غير متوقعة ضارة محتملة من TCRs الناتجة. لقد صممنا نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) التي عززت تعطيل جينات TCR β و Î-chain الذاتية. تفتقر الخلايا الليمفاوية المعالجة بـ ZFNs إلى التعبير السطحي لـ CD3-TCR وتوسعت مع إضافة إنترلوكين 7 (IL-7) و IL-15. بعد نقل الفيروسة البطيئة لمستضد TCR الخاص بمستضد ورم ويلمز 1 (WT1) ، عبرت هذه الخلايا التي تم تحريرها بواسطة TCR عن TCR الجديد عند مستويات عالية ، وتم توسيعها بسهولة إلى ما يقرب من النقاء وكانت متفوقة في التعرف على المستضد المحدد مقارنةً بالمتبرع المتطابق وغير المعدل الخلايا المنقولة TCR. على عكس الخلايا المنقولة بواسطة TCR غير المعدلة ، لم تتوسط الخلايا الليمفاوية المعدلة بواسطة TCR التفاعل غير المستهدف مع الحفاظ على نشاطها المضاد للورم في الجسم الحي ، مما يدل على أن التحرير الكامل لخصوصية الخلايا التائية يولد الخلايا الليمفاوية الخاصة بالورم مع ملفات تعريف محسنة للسلامة الحيوية.


اكتشاف أصابع الزنك وتطبيقاتها في تنظيم الجينات ومعالجة الجينوم

تم تقديم سرد لاكتشاف Cys الكلاسيكية2له2 إصبع الزنك ، الناشئة عن تفسير الدراسات البيوكيميائية على تفاعل Xenopus عامل نسخ البروتين IIIA مع 5S RNA ، والدراسات الهيكلية على هيكلها وتفاعلها مع DNA. الإصبع هو مجال قائم بذاته يتم تثبيته بواسطة أيون الزنك المرتبط بزوج من السيستين وزوج من الهيستيدينات ، وبواسطة قلب مسعور داخلي. لم يُظهر هذا الاكتشاف طية بروتينية جديدة فحسب ، بل أظهر أيضًا مبدأ جديدًا للتعرف على الحمض النووي. في حين أن بروتينات ربط الحمض النووي الأخرى تستفيد عمومًا من التناظر المزدوج للحلزون المزدوج ، يمكن ربط أصابع الزنك خطيًا بالترادف للتعرف على تسلسلات الحمض النووي ذات الأطوال المتفاوتة. يوفر هذا التصميم المعياري عددًا كبيرًا من الاحتمالات التجميعية للتعرف المحدد على الحمض النووي (أو RNA). لذلك ليس من المستغرب أن يكون إصبع الزنك منتشرًا في الطبيعة ، بما في ذلك 3٪ من جينات الجينوم البشري.


تطوير مجالات أصابع الزنك للتعرف على تسلسل الحمض النووي لعائلة 5'-CNN-3 واستخدامها في بناء عوامل النسخ الاصطناعية

تم إحراز تقدم كبير في السنوات الأخيرة في تصميم عوامل النسخ للتنظيم الموجه للجينات الذاتية. على الرغم من أن العديد من الاستراتيجيات تتضمن طرق اختيار يجب تطبيقها على كل تسلسل مستهدف جديد ، فقد طورنا منهجًا يعتمد على ربط نطاقات أصابع الزنك المحددة مسبقًا التي يتعرف كل منها على تسلسل الحمض النووي المكون من ثلاثة أزواج لإنشاء عوامل نسخ اصطناعية ترتبط بالتسلسل المرغوب . يمكن تجميع هذه المجالات للتعرف على تسلسل الحمض النووي الفريد المكون من 18 زوجًا بخصوصية عالية. نحن هنا نبلغ عن تطوير وتوصيف مجالات أصابع الزنك التي ترتبط بـ 15 موقعًا فرعيًا من 16 5'-CNN-3 '. تم إنشاء هذه المجالات من خلال مجموعة من اختيار عرض الملتهمة ، والطفرات الموجهة للموقع ، وتصميم دي نوفو. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذه المجالات لتوليد بروتين محدد للغاية مكون من ستة أصابع يستهدف محفز ERBB-2. عند اندماج هذا البروتين في المجالات التنظيمية ، كان قادرًا على تنظيم التعبير عن جين ERBB-2 الداخلي صعودًا وهبوطًا. مع إضافة هذه المجموعة من نطاقات أصابع الزنك المحددة مسبقًا ، يمكن الآن استهداف معظم التسلسلات التي تحتوي على 5'-CNN-3'- و 5'-GNN-3'- و 5'-ANN-3'بسرعة للجينات الموجهة تنظيم وانقسام نوكلياز.


المواد والأساليب

تجارب ميكروأري المرتبطة بالبروتين

يتم تقديم تسلسل تصميمي PBM "all-10-mer" على http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/. تم وصف تفاصيل تصميم واستخدام PBMs في مكان آخر (41 ، 47 ، 49 ، 50). يتم سرد البلازميدات في الجدول التكميلي S1. تم استنساخ ZFAs على هيئة شظايا SacI-BamHI إلى pTH5325 ، وهو ناقل تعبير GST معدّل يحركه T7 (انظر الوثيقة التكميلية للبيانات التكميلية). باختصار ، استخدمنا 150 نانوغرام من DNA البلازميد في 25 ميكرولتر في المختبر تفاعل النسخ / الترجمة باستخدام مجموعة PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit (New England BioLabs) مع مثبط RNase و 50 ميكرومتر من أسيتات الزنك. بعد الحضانة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، تمت إضافة 12.5 ميكرولتر من الخليط إلى 137.5 ميكرولتر من محلول ربط البروتين لمزيج نهائي من PBS / 2 ٪ حليب منزوع الدسم / 0.2 مجم لكل مل BSA / 50 ميكرومتر من أسيتات الزنك / 0.1 ٪ توين -20. تمت إضافة هذا الخليط إلى مجموعة تم حظرها مسبقًا باستخدام PBS / 2٪ لبن منزوع الدسم وغسلها مرة واحدة باستخدام PBS / 0.1٪ توين -20 ومرة ​​واحدة باستخدام PBS / 0.01٪ Triton-X 100. بعد حضانة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، تم غسل المصفوفة مرة واحدة باستخدام PBS / 0.5٪ Tween-20/50 μM acetate zinc acetate ومرة ​​واحدة باستخدام PBS / 0.01٪ Triton-X 100/50 μM zinc acetate. تمت إضافة الجسم المضاد المضاد لـ GST المسمى Cy5 ، وتم تخفيفه في PBS / 2 ٪ حليب منزوع الدسم / 50 ميكرومتر من أسيتات الزنك. بعد الحضانة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ، تم غسل الصفيف ثلاث مرات باستخدام PBS / 0.05 ٪ Tween-20/50 ميكرومتر من خلات الزنك ومرة ​​واحدة باستخدام PBS / 50 ميكرومتر من خلات الزنك. تم بعد ذلك تصوير المصفوفة باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري Agilent بدقة 2 ميكرومتر.

تحليل بيانات ميكروأري

تم قياس شدة بقعة الصورة باستخدام برنامج ImaGene (BioDiscovery). لتقدير التفضيل النسبي لكل 8 مير ، تم حساب درجتين مختلفتين: ض- تم حساب الدرجة من متوسط ​​شدة الإشارة عبر 16 أو 32 نقطة تحتوي على كل 8 ميره-score '(للتخصيب) هو تباين في المنطقة الواقعة تحت منحنى ROC (41) ويستخدم هنا لأنه قابل للتكرار بدرجة كبيرة ويسهل المقارنة بين التجارب المنفصلة. تم اختبار كل ZFA على مجموعتين مختلفتين من المصفوفات الدقيقة العالمية (المعينة ME و HK). ه- تمت مناقشة بيانات الدرجات في النص ومع ذلك ، كلاهما ض- و ه- يتم توفير بيانات الدرجات في البيانات التكميلية عبر الإنترنت على الموقع http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/. تم إيداع بيانات Microarray في GEO (رقم الانضمام GSE25723).


TALENs و ZFNs

يوجد في العالم الآن تقنيتان رئيسيتان للتحرير المستهدف للجينوم: نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) و نوكليازات المستجيب TAL (TALENs). من حيث المبدأ ، فإن هذه التقنيات قادرة على استهداف أي موقع تقريبًا في الجينوم وتعديل الحمض النووي الموجود هناك. لقد بدأت هذه بالفعل في إحداث ثورة في البحث والطب ، ويبدو أن إمكاناتها هائلة خلال السنوات القادمة ، لذلك جلست لألف رأسي حول كيفية عملها.

استهداف الجينات ، على الرغم من كونه جديدًا إلى حد ما ، إلا أنه ليس & # 8217t كما جديد مثل ZFNs أو TALENs. في أواخر الثمانينيات ، اكتشف كابتشي وإيفانز وسميثيز أن العملية الخلوية لإعادة التركيب المتماثل يمكن اختطافها لاستبدال الحمض النووي الجيني بتسلسل جديد من الاهتمام. إعادة التركيب المتماثل - حيث تتبادل الإنزيمات قطعتين متشابهتين من الحمض النووي لبعضهما البعض & # 8211 آلية أصلية لجميع الكائنات الحية. تستخدمه البكتيريا لتبادل الجينات المفيدة مع بعضنا البعض نحن الحيوانات نستخدمها لتقاطع أزواج الكروموسومات الخاصة بنا أثناء الانقسام الاختزالي ، وهو أمر مهم لأنه يسمح للانتقاء الطبيعي بالعمل على الجينات الفردية بدلاً من الكروموسومات الكاملة. وإلا فإن الجين النافع حقًا لا يمكنه أبدًا الاستمتاع بالاختيار الإيجابي إذا صادف أنه مجرد جين سيء حقًا. على أي حال ، اكتشف Cappechi و Evans و Smithie أنه إذا كان بإمكانك فقط إنشاء DNA متماثل (أي مشابه ، غير متطابق) لجين موجود في كائن حي والحصول على هذا الحمض النووي في نواة الخلية & # 8211 الأمر الذي يتطلب Electroporation للنفاذ إلى غشاء الخلية & # 8211 كان هناك بعض الاحتمال أنه سيعيد الاتحاد ودمج في جينوم الخلية & # 8217s. من خلال تطبيق هذا على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر وإعادة دمج الإصدارات الطافرة غير الوظيفية من الجينات في جينوم الفأر لتحل محل الجينات العاملة ، اخترعوا الفأر المغلوب ، وهو إنجاز فازهم بجائزة نوبل لعام 2007.

كان هذا الإنجاز أساسًا لجميع الجينات العكسية تقريبًا (أي إنشاء نمط وراثي ، ودراسة النمط الظاهري الناتج) منذ ذلك الحين. لكن مجرد عبور أصابعك على أمل إعادة توحيد الحمض النووي المتماثل هو عملية غير فعالة إلى حد ما & # 8211 فقط جزء صغير جدًا من الخلايا يحصل على إعادة تركيب ناجح.

هذه العملية غير فعالة جزئيًا لأن إعادة التركيب المتماثل تتطلب أن يخضع الحمض النووي أولاً لكسر مزدوج الشريطة في موقع ذي صلة ، ومن ثم يتعين على آليات الإصلاح إصلاح هذا الانكسار عن طريق دمج الحمض النووي الجديد (بدلاً من القديم) في النهاية المكسورة . لذا إذا كنت ستجلس وتبحث عن طرق لمحاولة تسريع هذه العملية ، فقد تصطدم بفكرة قطع الحمض النووي الجيني أولاً ، لإنشاء كسر مزدوج الخيط.

لدى علم الأحياء آلية كهذه لإنشاء فواصل مزدوجة الشريطة: إنزيمات التقييد. طورت بعض أنواع البكتيريا هذه الإنزيمات لتقطيع الحمض النووي للعاثيات الغازية (الفيروسات التي تصيب البكتيريا). تقوم البكتيريا بميثيل تلك التسلسلات الخاصة بهم ملك الحمض النووي لمنع النيران الصديقة. باهر. لعقود حتى الآن ، قمنا نحن البشر باختطاف هذه الآلية لجميع أنواع بروتوكولات البيولوجيا. إذا فكرت في الوراء ، قد تتذكر أنه في الأيام التي سبقت التسلسل ، استخدمناها لأخذ بصمات الحمض النووي في الطب الشرعي واختبارات الأبوة. تحتوي إنزيمات التقييد على دقة نوكليوتيد واحدة في خصوصية الارتباط الخاصة بها ، لذلك يمكن أن يكون SNP هو الفرق بين وجود موقع تقييد وعدم وجود موقع تقييد. لذلك إذا قمت بتعريض شخصين مختلفين & # 8217s DNA لنفس إنزيم التقييد ، فسوف يقطعهما في أماكن مختلفة ، مما ينتج عنه شظايا ذات أطوال مختلفة. ظهرت هذه الاختلافات في الأطوال ، والتي تسمى تعدد أشكال طول جزء التقييد أو RFLPs ، بشكل بارز في تجربة OJ.

تكمن مشكلة إنزيمات التقييد في أن تسلسل التعرف عليها قصير حقًا ، وبالتالي فإن أي إنزيم تقييد معين سيقطع مئات أو آلاف الأماكن في الجينوم. على سبيل المثال ، مواقع التعرف على الإنزيمات المقيدة لـ EcoRI و SamI & # 8217:

فقط ستة قواعد لكل منهما. ما كان مطلوبًا ، بدلاً من ذلك ، هو إنزيم تقييد يتعرف على تسلسل أطول بكثير & # 8211 طويل بما يكفي ليكون فريدًا في موضع واحد في الجينوم بأكمله.

Meganucleases هي تلك فقط. على الرغم من البادئة ، فإنهم لا يتعرفون على تسلسل 1 مليون زوج أساسي ، فقط تسلسل زوج أساسي 12-40 ، ولكن في كثير من الحالات يكون هذا كافياً بالفعل لامتلاك موقع واحد فقط للتعرف على الجينوم في كائن حي بكامله & # 8217s . لذلك إذا كان موقع الجينوم الذي تريد استهدافه فقط يحدث لتحمل التسلسل الذي تم التعرف عليه من قبل meganuclease معروف ، ثم أنت & # 8217re في العمل. ولكن هناك 4 18/2 من 18 تسلسلًا محتملاً من 18 زوجًا أساسيًا قد ترغب في استهدافها ، ولن تتعثر فقط على 4 18/2 مختلفة ضخمة من نوكلياز للقيام بهذه المهمة. لقد حاول الناس استخدام شاشات الطفرات العشوائية لتوليد نوكليازات ضخمة جديدة ، مع بعض النجاح ، لكننا ما زلنا بعيدين عن القدرة على الاستهداف فقط أي تسلسل ممكن.

لقد أثبتت Meganucleases فائدتها ويمكنك شرائها من Cellectis اليوم & # 8211 هم & # 8217re بأي حال من الأحوال خارج الصورة. لكنهم لم يحدثوا ثورة في العلم أبدًا لأنهم كانوا & # 8217t قابلة للبرمجة بدرجة كافية. لا يمكنك تصميمها من الألف إلى الياء للقيام بالمزايدة الخاصة بك.

أدخل السيستئين2له2 بروتين أصابع الزنك. هذه هي بروتينات مرتبطة بالتسلسل المرتبط بالحمض النووي تعمل كعوامل نسخ ، أي تنظم التعبير الجيني عن طريق الارتباط الانتقائي بمحفزات الجينات. يوجد بها الكثير من الأنواع ، بما في ذلك نحن البشر (يرمز الجين EGR1 إلى عامل نسخ إصبع الزنك). ولكن في حين أن لدينا الآلاف من عوامل النسخ التي ليست أكثر & # 8216 قابلة لإعادة البرمجة & # 8217 من نوكلياز ضخم ، فإن جمال إصبع الزنك هو أنه & # 8217s معياري. يحتوي كل إصبع من الزنك على مجالين إلى أربعة مجالات ، كل منها به حلزون α واحد يلائم الأخدود الرئيسي للحلزون المزدوج للحمض النووي ويرتبط بشكل انتقائي بتسلسل أزواج من 3 قواعد.

تحتوي أصابع الزنك الأكثر استخدامًا على ثلاثة & # 8216 أصابع & # 8217 (مجالات ربط الحمض النووي) ، مما يعني أنك & # 8217 حصلت على خصوصية من 9 قواعد. ثم يتم استخدام بروتينات إصبع الزنك في أزواج ، مما يمنحك خصوصية من 18 قاعدة. هذا يكفي لاستهداف أي تسلسل تريده بشكل فريد تقريبًا.

أصابع الزنك وحدها تربط الحمض النووي. لذا ، إذا كان كل ما عليك فعله هو تصميم بروتين لربط المحفز بشكل انتقائي لتنشيط الجين ، فستنتهي هنا. ولكن إذا كنت ترغب في استخدامها لإنشاء فواصل مستهدفة في الحمض النووي ، فأنت بحاجة إلى مقص لاستخدامها. من الطبيعي أنك & # 8217d تبحث حولك بحثًا عن بروتين آخر لكسر الحمض النووي أو مجال من البروتين الذي يمكنك دمجه مع أصابع الزنك. تتمتع جميع إنزيمات التقييد بقدرة على شق الحمض النووي ، لكنك تعرف مدى تعقيد عملية طي البروتين: معظمها لديها القدرة على شق الحمض النووي جميعها مرتبطة بقدرة ربط الحمض النووي ، ويمكنك & # 8217t فصل الاثنين تمامًا. لكن إنزيم تقييد FokI ، المعزول بواسطة Sugisaki & amp Kanazawa 1981 ، يحتوي فقط على ما تحتاجه: مجال انقسام الحمض النووي الذي لا يحتوي على خصوصية تسلسل على الإطلاق ويمكن أن يعمل بشكل منفصل تمامًا عن مجال ربط الحمض النووي للإنزيم & # 8217s.

الآن تصور اثنين من بروتينات إصبع الزنك ، كل منهما بثلاثة أصابع بإجمالي 18 زوجًا أساسيًا من الخصوصية ، مرتبطين أعلى وأسفل موقع الاهتمام ، وكل منهما مدمج في مجال انقسام الحمض النووي FokI واحد بينهما. هذا & # 8217s نوكلياز إصبع الزنك. لقد تمكن الناس حتى من جعل مجال انشقاق FokI على كل بروتين مختلفًا بعض الشيء ويكونون قادرين على شق الحمض النووي فقط عند غير المتجانسة (مزيج من نطاقي FokI المختلفين) بدلاً من homodimersلتقليل التأثيرات غير المستهدفة. يمكنك أيضًا الانتقال لفترة أطول للحصول على مزيد من الخصوصية: ZFNs المخصصة من CompoZr ، التي تبيعها Sigma-Aldrich بموجب ترخيص تجاري وحيد لبيع ZFNs ، تتعرف على قواعد 24 & # 8211 36. (بالمناسبة ، على الرغم من أن ZFNs حاصلة على براءة اختراع ، فلا يزال بإمكانك قانونًا إنشاء بروتوكولات خاصة بك ، ويوفر Zinc Finger Consortium بروتوكولات مفتوحة المصدر لتجميع ZFNs بالإضافة إلى برامج لتصميمها.)

تصميم أصابع الزنك لاستهداف تسلسل DNA معين ليس مثاليًا أو أنيقًا تمامًا كما قد تأمل: جرب Googling & # 8216zinc code & # 8217 ولاحظ ما إذا كان لديك أي حظ أفضل مني. كنت أتمنى الحصول على جدول جميل يوضح تسلسل الأحماض الأمينية في حلزون ألفا الذي يتوافق مع ثلاثة توائم قاعدة الحمض النووي. يبدو أنه & # 8217s ليس بهذه البساطة لأن الأصابع تتفاعل مع بعضها البعض وتغير خصائص الطي لبعضها البعض & # 8217s: & # 8220 في كل من ZFPs متعددة الأصابع الطبيعية والمصممة & # 8230 الأصابع الفردية لا تعمل دائمًا كوحدات معيارية تمامًا & # 8221 [هيرت 2003]. لذلك لا يزال هناك القليل من التجربة والخطأ ويمكنك & # 8217t دائمًا استهداف التسلسل الدقيق الذي تريده وقد تحتاج إلى تسوية موقع آخر بعيدًا عن موقعك المثالي.

على الرغم من ذلك ، أثبتت أصابع الزنك أنها ثورية جدًا. والأكثر شهرة أنهم لعبوا دورًا في أحد أروع التطورات البيولوجية في حياتنا حتى الآن: العلاج الجيني للخلايا الجذعية لفيروس نقص المناعة البشرية. بحلول منتصف التسعينيات ، كان لدى الناس فكرة أن فيروس نقص المناعة البشرية يحتاج إلى بروتين CD4 (الموجود في خلايا CD4 + T) كمستقبل من أجل إصابة الخلايا. قام Samson 1996a بتمييز الجين CCR5 ، والذي سرعان ما تبين أنه a مستقبل مشترك بالنسبة لفيروس نقص المناعة البشرية & # 8211 ، يحتاج الفيروس إلى الارتباط أولاً بـ CD4 ثم بـ CCR5 من أجل الدخول إلى الخلايا التائية. اكتشف Samson 1996b أليل CCR5 حيث يتم تعطيل منتج الجين تمامًا عن طريق حذف الإطارات 32 نقطة في البوصة (يسمى الآن أليل CCR5Δ32). هذا الأليل له تردد حوالي 10 ٪ في الأوروبيين (غير مرئي في مجموعات سكانية أخرى) وخلص شمشون إلى أنه يجب أن يمنح مقاومة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية حيث لم يتم العثور على أي شخص مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية متماثل الزيجوت لهذا الأليل في 723 حالة من حالات فيروس نقص المناعة البشرية وحتى استنفاد الزيجوت متغايرة الزيجوت بمقدار حوالي 35٪. لذلك يبدو أن حذف CCR5 من الجينوم هو طريق علاجي محتمل لفيروس نقص المناعة البشرية. بحلول عام 2010 ، تمكنت عدة مجموعات من إثبات جدوى استخدام ZFNs في الفئران لتعطيل CCR5 وإنتاج مقاومة فيروس نقص المناعة البشرية. استخدم Perez 2008 ZFNs لتعطيل CCR5 في خلايا CD4 + T البشرية ، مما أدى إلى تعطيل حوالي 50 ٪ من أليلات CCR5 ، ثم زرع هذه الخلايا في فئران NOG التي تعاني من نقص المناعة وأظهر أن الفئران مع خلايا CD4 + المعطلة CCR5 أنتجت فيروسًا أقل وحافظت على مستوى أعلى. تعداد خلايا CD4 + (كلا مؤشري شدة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية) من الفئران الضابطة التي تلقت خلايا CD4 + غير معدلة. انتقل هذا النهج سريعًا إلى تجربة سريرية لا تزال جارية (انظر أيضًا هذه المقدمة المُعززة ذاتيًا ولكن المكتوبة جيدًا للتجربة السريرية التي أجرتها Sangamo ، الشركة التي تحمل براءة اختراع ZFNs). هناك طريقة أخرى ، بدلاً من زرع خلايا CD4 + المعدلة ، لتعديل الخلايا الجذعية التي تنتج خلايا CD4 + ، وبالتالي إنشاء إمداد دائم من الخلايا المقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية. قام هولت 2010 بهذا بالضبط باستخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم (المكونة للدم) من دم الحبل السري البشري ، والتي تم نقلها باستخدام ZFNs بهدف تعطيل CCR5 وزرعها في الفئران. قتل فيروس نقص المناعة البشرية بسرعة معظم الخلايا غير المتقطعة تاركًا مجموعة من الخلايا المتجانسة CCR5 غير قادرة على الإصابة. نهج هولت & # 8217s & # 8211 باستخدام الخلايا الجذعية & # 8211 يشبه حالة الشخص الوحيد الذي (نعتقد) شفي تمامًا من فيروس نقص المناعة البشرية. أبلغ Allers 2011 عن مريض مصاب بسرطان الدم مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية تلقى عملية زرع نخاع عظم من متبرع مطابق كان متماثل الزيجوت CCR5-32 ويبدو أن المريض الآن لم يعد مصابًا بفيروس نقص المناعة البشرية بعد الآن. لم يقم أحد بعد بهذا النوع من الزرع مع خلايا معدلة من ZFN للمريض ، ولكن هذا قد يكون التالي. (هذا النوع من الإجراءات يقتصر على المرضى الذين يعانون بالفعل من سرطان الدم الذي يهدد الحياة بالإضافة إلى فيروس نقص المناعة البشرية ، على الرغم من أن عمليات زرع نخاع العظام تنطوي على مخاطر كبيرة).

نمت جميع نوكليازات إصبع الزنك في هذه المرحلة ، بعد أن وصلت بالفعل إلى تجربة سريرية. لكن كل الضجة الآن تدور حول بديل جديد غير مختبَر نسبيًا ولكنه واعد جدًا: نوكليازات المستجيب الشبيه بمنشط النسخ ، أو TALENs.

مثل ZFNs ومعظم الأشياء الرائعة الأخرى في علم الأحياء ، لم يخترع البشر & # 8217t TALENs من الصفر & # 8211 بدلاً من ذلك اختطفنا الأدوات البيولوجية من كائن حي عالي التخصص الذي تطور ليفعل ما نريد القيام به. TALENs ، تستفيد من بروتينات ربط الحمض النووي من زانثوموناس جنس البكتيريا. زانثوموناس are plant pathogens that produce proteins to specifically bind to and up- or down-regulate promoter sequences in host genes important to the disease process – much like a transcription activator would. Hence the “transcription activator-like” part of the name. The central region of the TAL protein is made up of 17 to 18 repeats of the same 34 amino acid unit, with amino acids 12 and 13 of each unit determining what single DNA nucleotide it binds to. And unlike ZFNs, these units are pretty much completely modular and spell out an almost-unambiguous code for the targeted DNA sequence. Here’s the beautiful elegant table you’ve been waiting for:

Amino acids 12 & 13 DNA letter targeted
NI أ
عالية الدقة ج
NN G or A
NK جي
NG تي

So with, say, 17 repeats = 17*34 = 578 amino acids plus the non-repeating C- and N-terminal sequences of a TAL, you can uniquely target a 17 base pair DNA sequence. Use two TALs and you can recognize 34 bases put FokI DNA-cleaving domains in between them, and you’ve got a TALEN.

The process for synthesizing TALENs – creating your custom amino acid sequence to bind the DNA sequence of interest, adding FokI, and so on – is not exactly trivial. For a 20-page protocol on how to make your own, see Sanjana 2012, and for some open source resources to help you design it, see Cornell University’s TALE-NT tools. Or you can buy a custom-designed one from Cellectis, which holds the exclusive commercial license on TALENs, for $5000.

TALENs are quite new at this point but have already been used in some cool applications. Ding 2013 reports on using them to make isogenic models of human disease – pairs of cell lines that are (theoretically) identical except for the single site of a disease-causing genetic mutation. (This is what we at Prion Alliance have proposed to do for FFI using ZFNs in our Rare Disease Challenge proposal). In practice, the cell lines didn’t turn out quite identical: the TALENs exhibited minimal off-target effects, but simply growing cells in culture leads to the gradual accumulation of mutations here and there (just as aging leads to gradual accumulation of somatic mutations in cells in your body).

Durai 2005, writing about ZFNs, says that making a double-stranded DNA break at an appropriate location can increase the efficiency of homologous recombination by 50,000-fold. But even with highly site-specific ZFNs or TALENs there is still no one ‘at the wheel’ making sure the ZFNs/TALENs and the new homologous DNA all end up at the right place at the right time and that DNA repair mechanisms stitch the chromosome back together in the way you want. So after you’ve used your ZFNs/TALENs you have to do sequencing to see what fraction of the cells got successful integration of the edits you were trying to make. In practice it will be some small-ish fraction of cells (say, anywhere from 1.6% to 34% in a recent report by Ding 2013) and so you’ll select those for your further experiments and cull the rest.

That’s one reason why these technologies are still a long ways from allowing us to perform gene therapy in every cell of an adult human. But in the immediate term, these will be amazing tools for research, letting us create new models of human diseases. In the slightly longer term, there is also the possibility that they’ll play a role in making it possible to transplant modified versions of your own cells back into your body, like they did in HIV. While that’s harder to do with brain than blood, Stem Cells Inc has already brought human neural stem cell transplants to the clinical development stage, so don’t rule it out.

update 2013-01-22: I just learned that the folks behind the Ding 2013 paper are sharing their plasmids through addgene.org as a public resource to help other researchers build their own TALENs. مذهل! Also another quick update: if you watched the Nature Biotechnology video on Youtube at the top of this post, you should be aware that this graphic at 1:24 is not really accurate:

The above graphic depicts the template for homology-directed repair (HDR) as being of the same length as the piece of DNA that was cut out of the original genome. In fact, HDR depends upon homology between the new piece of DNA and the existing, uncut parts of the genome, so the introduced piece of DNA on top that you are trying to knock into the genome would need to extend وراء - فى الجانب الاخر the points of the cut. So it should look something more like this:

Although, while qualitatively more correct, even this graphic does not depict properly the الطول of homology required for HDR. For ZFNs, apparently the new template DNA can be just

100b longer than the cut site on each side. That’s a big improvement over conventional knock-in without ZFNs/TALENs, which requires several kb of homology on each side of the desired mutation.

update 2013-01-22 #2: The question arose today as to whether TALENs, like ZFNs, could be designed to only function as heterodimers so as to reduce off-target effects. The answer is yes: Cade 2012 uses ‘obligate heterodimer’ TALENs in zebrafish and compares the results to homodimeric TALENs. Predictably, the ‘obligate heterodimer’ TALENs have fewer off-target effects.

update 2013-01-22 #3: We also had a discussion about costs for TALENs. As mentioned above, Cellectis sells custom-designed TALENs for $5000 a pair. Buying the requisite kit from addgene will run you just $300, plus several days of labor (assuming you know what you’re doing!) And although U.S. patent application EP2510096A2 looks to preclude anyone but Cellectis from selling TALENs commercially, research institutions do produce them internally as a service to research groups within the institution. I’m told that the ‘all-in’ price for getting TALEN-modified cell lines runs about $14,000. That includes design and assembly of TALENs, screening for cells that take up the TALEN plasmids, then screening for successfully modified cells and unmodified wild-type cells.

update 2013-06-07: Sigh – outdated no sooner than it was posted! حاليا the hot new genome-editing technology is CRISPR, see e.g. Cong 2013. Also a colleague pointed out that the screenshot from that YouTube video above is inaccurate in another way – most of the time you don’t need to make اثنين double-stranded breaks, just one, in order to get homology-directed repair to kick in.

About Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel is on a lifelong quest to prevent prion disease. He is a scientist based at the Broad Institute of MIT and Harvard.


In vitro selection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للاهتمام الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.