معلومة

16.11: تسلسل الحمض النووي - علم الأحياء

16.11: تسلسل الحمض النووي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

حتى التسعينيات ، كان تسلسل الحمض النووي (قراءة تسلسل الحمض النووي) عملية مكلفة نسبيًا وطويلة. طور فريد سانجر طريقة التسلسل المستخدمة في مشروع تسلسل الجينوم البشري ، والذي يستخدم على نطاق واسع اليوم (الشكل 1).

قم بزيارة هذا الموقع لمشاهدة مقطع فيديو يشرح تقنية قراءة تسلسل الحمض النووي التي نتجت عن عمل سانجر.

تُعرف الطريقة باسم طريقة إنهاء سلسلة dideoxy. تعتمد طريقة التسلسل على استخدام عوامل إنهاء السلسلة ، ديديوكسينوكليوتيدات (ddNTPs). تختلف dideoxynucleotides ، أو ddNTPSs ، عن deoxynucleotides من خلال عدم وجود مجموعة 3 ′ OH مجانية على السكر المكون من خمسة كربون. إذا تمت إضافة ddNTP إلى حبلا DNA المتنامي ، فلن يتم تمديد السلسلة أكثر من ذلك لأن المجموعة المجانية 3 ′ OH اللازمة لإضافة نيوكليوتيد آخر غير متوفرة. باستخدام نسبة محددة سلفًا من ديوكسي ريبونوكليوتيدات إلى ديديوكسين نيوكليوتيدات ، من الممكن توليد أجزاء من الحمض النووي بأحجام مختلفة.

يتم تغيير طبيعة عينة الحمض النووي المراد ترتيب تسلسلها أو فصلها إلى شريطين عن طريق تسخينها إلى درجات حرارة عالية. ينقسم الحمض النووي إلى أربعة أنابيب يتم فيها إضافة مادة أولية وبوليميراز DNA وجميع النيوكليوتيدات الأربعة (A و T و G و C). بالإضافة إلى كل من الأنابيب الأربعة ، يتم إضافة كميات محدودة من واحد من أربعة ديديوكسينوكليوتيدات إلى كل أنبوب على التوالي. تم تصنيف الأنابيب على أنها A و T و G و C وفقًا لـ ddNTP المضافة. لأغراض الكشف ، يحمل كل من ديديوكسينوكليوتيدات أربعة تسمية فلورية مختلفة. يستمر استطالة السلسلة حتى يتم دمج نيوكليوتيد ثنائي أكسيد الفلورسنت ، وبعد ذلك لا يحدث مزيد من الاستطالة. بعد انتهاء التفاعل ، يتم إجراء التفريد. حتى الفرق في طول قاعدة واحدة يمكن اكتشافه. يتم قراءة التسلسل من ماسح ضوئي بالليزر. عن عمله على تسلسل الحمض النووي ، حصل سانجر على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1980.

كما سبق ذكره ، جل الكهربائي (الشكل 2) هي تقنية تستخدم لفصل أجزاء الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة. عادة ما يتكون الجل من مادة كيميائية تسمى الاغاروز. يضاف مسحوق Agarose إلى المخزن المؤقت ويتم تسخينه. بعد التبريد ، يُسكب محلول الجل في صينية الصب. بمجرد أن يصلب الجل ، يتم تحميل الحمض النووي على الجل ويتم تطبيق التيار الكهربائي. يحتوي الحمض النووي على شحنة سالبة صافية ويتحرك من القطب السالب باتجاه القطب الموجب. يتم تطبيق التيار الكهربائي لوقت كافٍ للسماح بفصل الحمض النووي وفقًا للحجم ؛ ستكون الشظايا الأصغر هي الأبعد عن البئر (حيث تم تحميل الحمض النووي) ، وستكون الأجزاء ذات الوزن الجزيئي الأثقل هي الأقرب إلى البئر. بمجرد فصل الحمض النووي ، يتم صبغ الجل بصبغة خاصة بالحمض النووي لمشاهدته.

أدى تسلسل جينوم سانجر إلى سباق لتسلسل الجينوم البشري بسرعة عالية وتكلفة منخفضة ، وغالبًا ما يشار إليها باسم 1000 دولار في تسلسل يوم واحد. تعرف على المزيد من خلال مشاهدة الرسوم المتحركة للتسلسل في السرعة هنا.

جينوم الإنسان البدائي: كيف نحن مرتبطون؟

تم نشر المسودة الأولى لتسلسل جينوم الإنسان البدائي بواسطة Richard E.Green et al. في 2010.[1] إنسان نياندرتال هم أقرب أسلاف البشر في الوقت الحاضر. كان من المعروف أنهم عاشوا في أوروبا وغرب آسيا قبل أن يختفوا من سجلات الحفريات منذ حوالي 30000 عام. درس فريق جرين ما يقرب من 40 ألف عام من بقايا أحافير تم اختيارها من مواقع في جميع أنحاء العالم. تم استخدام وسائل متطورة للغاية لإعداد العينات وتسلسل الحمض النووي بسبب الطبيعة الهشة للعظام والتلوث الجرثومي الشديد. في دراستهم ، تمكن العلماء من تسلسل حوالي أربعة مليارات زوج قاعدي. تمت مقارنة تسلسل الإنسان البدائي بتسلسل البشر الحاليين من جميع أنحاء العالم. بعد مقارنة التسلسلات ، وجد الباحثون أن جينوم الإنسان البدائي لديه تشابه أكبر بنسبة 2 إلى 3 في المائة مع الأشخاص الذين يعيشون خارج إفريقيا مقارنة بالناس في إفريقيا. بينما اقترحت النظريات الحالية أن جميع البشر الحاليين يمكن تتبعهم إلى مجموعة صغيرة من الأسلاف في إفريقيا ، فإن البيانات من جينوم الإنسان البدائي قد تتعارض مع هذا الرأي. اكتشف جرين وزملاؤه أيضًا شرائح الحمض النووي بين الناس في أوروبا وآسيا والتي تشبه تسلسل الإنسان البدائي أكثر من التسلسلات البشرية المعاصرة الأخرى. ملاحظة أخرى مثيرة للاهتمام هي أن إنسان نياندرتال مرتبط ارتباطًا وثيقًا بأشخاص من بابوا غينيا الجديدة كما هو الحال مع أولئك من الصين أو فرنسا. هذا مثير للدهشة لأن بقايا أحافير إنسان نياندرتال كانت موجودة فقط في أوروبا وغرب آسيا. على الأرجح ، حدث التبادل الجيني بين إنسان نياندرتال والإنسان الحديث حيث ظهر الإنسان الحديث من إفريقيا ، قبل تباعد الأوروبيين وشرق آسيا وبابوا غينيا الجديدة.

يبدو أن العديد من الجينات قد خضعت لتغييرات من إنسان نياندرتال خلال تطور البشر في الوقت الحاضر. تشارك هذه الجينات في بنية الجمجمة ، والتمثيل الغذائي ، وتشكل الجلد ، والتطور المعرفي. أحد الجينات ذات الأهمية الخاصة هو رونكس 2، والذي يختلف في البشر المعاصرين والنياندرتال. هذا الجين مسؤول عن العظم الجبهي البارز ، والقفص الصدري على شكل جرس ، والاختلافات السنية التي تظهر في إنسان نياندرتال. من المتوقع أن يحدث تغيير تطوري في رونكس 2 كان مهمًا في أصل الإنسان المعاصر ، وقد أثر ذلك على الجمجمة والجزء العلوي من الجسم.

شاهد حديث Svante Pääbo الذي يشرح أبحاث جينوم الإنسان البدائي في مؤتمر TED السنوي لعام 2011 (التكنولوجيا والترفيه والتصميم).

تم استبعاد عنصر YouTube من هذا الإصدار من النص. يمكنك مشاهدته على الإنترنت هنا: pb.libretexts.org/biom1/؟p=566



تسلسل خلية واحدة

00: 00: 07.14 مرحبًا ، اسمي إريك تشاو ،
00: 00: 09.20 وأنا من جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو.
00: 00: 12.08 واليوم ، سأقدم لكم حديثًا عن تسلسل الخلية الواحدة.
00: 00: 15.28 إذن ، موجز مختصر.
00: 00: 18.00 سنغطي ماهية تسلسل الخلية المفردة
00: 00: 20.12 مع تركيز كبير على تسلسل الحمض النووي الريبي.
00: 00: 22.11 سنغطي الطرق القائمة على الألواح وطرق الموائع الدقيقة
00: 00: 25.07 طرق فهرسة اندماجية ،
00: 00: 27.21 ثم تحدث عن طرق تسلسل الخلية المفردة الأخرى التي لا تتعلق بـ.
00: 00: 30.28 تتعلق بالضرورة بـ RNA.
00: 00: 33.05 إذن ، السؤال المهم الذي يطرح نفسه هو ،
00: 00: 35.15 لماذا يتم إجراء تسلسل الخلية الواحدة؟
00: 00: 37.08 والتشابه الجيد لهذا هو تشبيه عصير الفاكهة.
00: 00: 40.17 لذلك ، لنفترض أنك تعمل على عينة دم ،
00: 00: 44.01 وتريد إلقاء نظرة على ملف تعريف تعبير.
00: 00: 47.08 ضمن عينة الدم تلك.
00: 00: 49.03 إذن ، الدم هو خليط معقد من العديد من أنواع الخلايا المختلفة.
00: 00: 52.03 لديك الخلايا البائية والخلايا التائية والضامة والعدلات ،
00: 00: 55.14 مشابه للعصير ، حيث لديك الكثير من أنواع الفاكهة المختلفة.
00: 00: 59.00 ولنفترض أنك مهتم حقًا بخصائص ، على سبيل المثال ،
00: 01: 02.11 حبة توت أو برتقال.
00: 01: 04.08 لكن بدلاً من تحليل التوت أو البرتقال ،
00: 01: 06.06 تقوم بخلطها مع الأناناس والموز وبعض الفراولة ،
00: 01: 09.20 امزجهم جميعًا معًا ،
00: 01: 11.12 وبعد ذلك هذا ما تتذوقه.
00: 01: 13.08 سيكون من الصعب جدًا معرفة ذلك
00: 01: 15.12 ما الأذواق التي تأتي من هذا التوت.
00: 01: 17.20 وهكذا ، نفس الشيء عندما تحاول التحليل
00: 01: 20.16 بيانات من خلية واحدة مقابل عينة مجمعة.
00: 01: 24.09 من المفيد حقًا أن تحصل على البيانات
00: 01: 27.05 تحديدًا من الخلايا الفردية ،
00: 01: 29.04 بدلاً من إجراء قياس شامل.
00: 01: 32.06 وشيء رائع حقًا يتعلق بتسلسل الخلية الواحدة
00: 01: 34.10 هو أنه من خلال البيانات التي يمكنك تحديدها
00: 01: 37.12 الكثير من أنواع الخلايا المختلفة.
00: 01: 39.03 وهكذا ، هذا تمثيل لـ a.
00: 01: 41.08 من مجموعة بيانات مأخوذة من عينة الدم.
00: 01: 44.17 وفي هذه الحالة ، عدة آلاف من الخلايا المفردة
00: 01: 47.20 تمت معالجتها معًا على التوازي.
00: 01: 51.02 كل من تلك المؤشرات. نصوص خلية مفردة فردية
00: 01: 54.15 تم تسلسلها وتحليلها.
00: 01: 56.13 ويمكنك اكتشاف ما يصل ، كما تعلم ،
00: 01: 58.23 العشرين ألف جين المختلفة الموجودة في الجينوم البشري.
00: 02: 02.08 ولذا ، من الصعب حقًا تصوير البيانات
00: 02: 04.18 بأبعاد 20000 مختلفة ،
00: 02: 06.19 لذا فإن إحدى الطرق الشائعة هي تقليص ذلك
00: 02: 09.17 في بعدين باستخدام تقليل الأبعاد.
00: 02: 12.00 وهناك العديد من الطرق المختلفة ،
00: 02: 13.23 الذي لن نتمكن من تجاوزه اليوم ،
00: 02: 15.13 لكنك ستنتهي بمخطط يشبه هذا ،
00: 02: 17.09 حيث تمثل كل نقطة صغيرة خلية واحدة ،
00: 02: 19.20 وهذه النقاط مجمعة ،
00: 02: 22.03 والخلايا المتجمعة بالقرب من بعضها البعض
00: 02: 25.04 أكثر تشابهًا مع بعضها البعض.
00: 02: 26.27 وهكذا ، ستنتهي بهذه المجموعات
00: 02: 28.26 لتجمعات الخلايا المختلفة الممثلة
00: 02: 31.18 في هذه المؤامرة.
00: 02: 33.24 وبالتالي ، هذا بحد ذاته ليس مفيدًا.
00: 02: 35.24 يمكنك معرفة أن لديك أنواعًا مختلفة من الخلايا هناك ،
00: 02: 37.14 لكن ليس لديك فكرة عن ماهيتهم.
00: 02: 39.07 لكن يمكنك البحث في البيانات.
00: 02: 41.15 و. على سبيل المثال ، إذا كان بإمكانك الدخول في كل مجموعة من هذه المجموعات والسؤال ،
00: 02: 43.06 ما هي النصوص التي تميز ،
00: 02: 45.23 لنفترض أن هذه الكتلة في الجزء العلوي من هذا العنقود المجاور لها ؟،
00: 02: 48.12 وأنت تفعل هذا للجينات المختلفة ،
00: 02: 50.17 يمكنك استخدام هذه المعلومات لتصنيفها
00: 02: 52.28 المجموعات المختلفة وحددها.
00: 02: 55.15 لذلك ، على سبيل المثال ، باللون الأزرق لديك الخلايا البائية
00: 02: 57.28 باللون الأحمر ، لقد قمت بتنشيط خلايا CD8 T.
00: 03: 00.28 لديك خلايا شجيرية بهذا اللون الأرجواني
00: 03: 03.15 حيدات CD4 باللون الأخضر
00: 03: 05.11 خلايا NK باللون الرمادي.
00: 03: 07.25 والقائمة تطول وتطول.
00: 03: 09.24 يمكنك تحديد العديد من أنواع الخلايا المختلفة
00: 03: 11.25 من خلال النظر في ملفات تعريف النسخ
00: 03: 14.04 داخل كل من هذه المجموعات.
00: 03: 16.17 وهكذا ، إذا شاهدت بعض مقاطع فيديو قياس التدفق الخلوي على iBiology ،
00: 03: 20.14 ستلاحظ أنه يمكنك الحصول على نفس المعلومات
00: 03: 22.14 من قياس التدفق الخلوي ،
00: 03: 24.07 فلماذا يتم إجراء تسلسل الخلية الواحدة؟
00: 03: 26.01 وأحد أسباب ذلك هو أنه يمكن تقسيم هذه المجموعات بشكل أكبر
00: 03: 29.22 وتحليلها بواسطة تلك الجينات.
00: 03: 31.14 وهكذا ، مرة أخرى ، يمكننا إجراء قياسات
00: 03: 33.22 على ما يصل إلى 20000 من الجينات المعبر عنها تفاضليًا
00: 03: 36.04 الموجودة. التي قد تكون موجودة في العينات ،
00: 03: 38.20 بينما باستخدام قياس التدفق الخلوي وقياس الكتلة الخلوية ،
00: 03: 40.20 قد تكون مقيدًا ببضع عشرات من العلامات ،
00: 03: 42.11 وهذا كل شيء.
00: 03: 43.26 وهكذا ، على سبيل المثال ، إذا قمنا بتفكيك هذه المجموعة ،
00: 03: 45.27 وتجاهل باقي المجموعات ،
00: 03: 47.25 وقم فقط بتحليل هذه المجموعة
00: 03: 49.23 وحاول التفريق بين هذا أكثر قليلاً ،
00: 03: 52.15 وقم بتكبير وإعادة تجميع البيانات ،
00: 03: 54.17 يمكننا أخذ تلك المجموعة الخضراء ، وإعادة تجميعها للحصول على فصل أفضل ،
00: 03: 57.27 ثم اسأل ، ما هي الجينات التي تفصل بينهما؟
00: 04: 00.28 ويمكنك متابعة هذه العملية بشكل متكرر.
00: 04: 03.21 لذلك ، إذا حددت مجموعة مثيرة للاهتمام ،
00: 04: 05.11 يمكنك البحث لأسفل لمعرفة ما إذا كان توقيع التعبير الجيني
00: 04: 08.17 خاص بمجموعة فرعية داخل عنقود.
00: 04: 11.11 وهذه حقًا قوة تسلسل الخلية الواحدة ،
00: 04: 13.27 هو أنك تحصل على قراءات عالية الأبعاد للبيانات
00: 04: 16.24 التي لا يمكنك الحصول عليها بالطرق الأخرى.
00: 04: 20.04 وبالتالي ، إخراج طرق تسلسل الخلية المفردة
00: 04: 21.26 حقًا زاد بشكل ملحوظ
00: 04: 23.26 خلال العقد الماضي.
00: 04: 25.12 لذا ، في البداية ، كانت الدراسة الأولى في عام 2009
00: 04: 27.20 حيث تسلسلوا خلية واحدة ،
00: 04: 30.02 وكان هذا كل شيء.
00: 04: 31.18 وعلى مر السنين ، يمكنك أن ترى أن هناك زيادة أسية
00: 04: 33.22 في عدد الخلايا التي تمت معالجتها في دراسات مختلفة ،
00: 04: 37.25 مع تمثيل كل من هذه الدوائر
00: 04: 39.24 منشور مختلف وعدد الخلايا التي تم تحليلها.
00: 04: 42.19 وهكذا ، سنبدأ في النظر إلى التقنيات المستخدمة ،
00: 04: 45.09 كما تعلمون. اه. كما تعلم ، بعد خمس سنوات.
منذ 00: 04: 48.18 وما قبله ،
00: 04: 51.03 حلل حقًا الخلايا الفردية
00: 04: 53.05 بفرزهم في آبار منفصلة من صفيحة ،
00: 04: 54.26 إعداد مكتبات من كل خلية من تلك الخلايا الفردية ،
00: 04: 57.19 ثم تسلسلها.
00: 04: 59.29 كانت الطريقة الأكثر شيوعًا هي تقنية SMART-seq القائمة على الألواح.
00: 05: 03.03 وفي هذه التقنية تستخدم مقياس التدفق الخلوي ،
00: 05: 05.16 وتقوم بفرز الخلايا التي تهمك ،
00: 05: 07.09 خلية واحدة في كل بئر من صفيحة 96 أو 384 بئر.
00: 05: 10.17 أنت تختبر تلك الخلية ، ثم تفعل ذلك
00: 05: 13.01 رد فعل نسخ عكسي باستخدام إعداد مكتبة على غرار SMART-seq.
00: 05: 16.13 وبطريقة إعداد المكتبة هذه ،
00: 05: 18.21 لديك قلة dT
00: 05: 21.09 الذي سيبدأ تفاعل النسخ العكسي
00: 05: 23.13 من mRNAs التي هي عديد الأدينيلات.
00: 05: 26.23 هذا oligo-dT له مقبض في النهاية.
00: 05: 29.08 وأثناء عملية النسخ العكسي ،
00: 05: 31.12 يتم تصنيع الحمض النووي باستخدام الحمض النووي الريبي (RNA) كنموذج [قالب].
00: 05: 35.20 وفي النهاية ، مع بعض النسخ العكسية ،
00: 05: 38.15 سيضيفون قاعدتين من قواعد C.
00: 05: 40.12 ويتم استخدام قواعد C هذه جنبًا إلى جنب
00: 05: 43.02 بقلة تبديل القالب
00: 05: 45.06 الذي يحتوي على G في النهاية.
00: 05: 46.21 إذن ، هذا النموذج الأوليغو ، في الأعلى ،
00: 05: 49.08 يتهجين على هذه C غير المصنّعة
00: 05: 52.01 التي تمت إضافتها ،
00: 05: 53.20 والنسخة العكسية قادرة على استخدام هذا النموذج الأولي
00: 05: 55.18 كقالب لمزيد من البلمرة.
00: 06: 00.08 وفي النهاية ، ينتهي بك الأمر مع cDNA
00: 06: 02.15 يحتوي على مقابض PCR على كلا الطرفين.
00: 06: 06.03 هذه تخضع لتضخيم
00: 06: 08.02 حتى تحصل على العديد والعديد من النسخ من كل (كدنا) ،
00: 06: 10.23 ثم ينتقل هذا إلى تحضير العينة.
00: 06: 13.27 طريقة تحضير مكتبة DNA لإكمالها
00: 06: 17.01 عملية إعداد المكتبة.
00: 06: 18.18 وهذا موضح هنا.
00: 06: 20.11 والأكثر شيوعًا هو طريقة تحضير مكتبة Nextera DNA هذه ،
00: 06: 23.03 حيث يمكنك تضخيم cDNA الخاص بك هنا
00: 06: 26.05 سوف يقوم Nextera transposase بتفتيت ذلك cDNA إلى أجزاء أصغر
00: 06: 30.15 أضف مهايئات جزئية من Illumina
00: 06: 32.09 وبعد ذلك ، من خلال PCR ،
00: 06: 34.01 تقوم بتضخيم هذه المادة
00: 06: 36.00 وأكمل عملية إعداد المكتبة.
00: 06: 38.24 وهكذا ، بهذه الطرق ،
00: 06: 41.12 يمكنك معالجة بضع مئات ،
00: 06: 43.08 ربما بضعة آلاف من العينات
00: 06: 45.18 مع الكثير من العمل ،
00: 06: 47.19 لأنك تقوم بمعالجة كل خلية
00: 06: 49.28 في أنبوب منفصل لبئر صفيحة.
00: 06: 51.23 وهكذا ، يتطلب هذا الكثير من الماصات ،
00: 06: 53.11 الكثير من العمل اليدوي ،
00: 06: 54.28 وكانت باهظة الثمن إلى حد ما ،
00: 06: 56.26 لأنك تقوم أساسًا بعمل عينة منفصلة.
00: 06: 58.25 تحضير عينة مكتبة DNA لكل خلية.
00: 07: 00.16 وهكذا ، قبل بضع سنوات ،
00: 07: 02.12 كانت هناك بعض الطرق التي ظهرت بالتوازي مع هذه العملية ،
00: 07: 05.18 الاستفادة من التقنيات المختلفة
00: 07: 07.29 الذي سننتقل إليه بعد ذلك.
00: 07: 09.21 وأول طريقة سنغطيها هي طريقة DropSeq.
00: 07: 11.09 إذن ، هذه طريقة تستخدم الموائع الدقيقة أو بشكل أساسي.
00: 07: 16.17 طرقًا مختلفة لإنشاء قطرات صغيرة جدًا جدًا
00: 07: 20.15 والقيام بالبيولوجيا الجزيئية داخل تلك القطرات.
00: 07: 24.10 وبهذه الطريقة لديك شريحة ،
00: 07: 26.13 حيث يكون لديك خرز يتدفق من الجانب الأيسر ،
00: 07: 28.25 ستتدفق الخلايا من هذا التقاطع الأول ،
00: 07: 32.11 وهكذا سوف يختلطون معًا.
00: 07: 34.08 في التقاطع التالي ، يوجد زيت يتدفق إلى الداخل.
00: 07: 36.18 وهذا الزيت يسبب هذه المرحلة المائية
00: 07: 39.17 للقرص وتشكيل مستحلب.
00: 07: 42.02 وبسبب طريقة عمل النظام ،
00: 07: 45.06 ينتهي بك الأمر مع وجود الكثير من القطرات في النهاية.
00: 07: 48.14 ستكون معظم هذه القطرات فارغة.
00: 07: 50.12 ستحتوي بعض القطرات على خرزة
00: 07: 52.00 ستحتوي بعض القطرات على خلية
00: 07: 53.26 وسيحتوي جزء صغير على خرزة وخلية معًا.
00: 07: 57.04 وهذا مصور هنا.
00: 07: 58.18 ومرة ​​أخرى ، هذه أقلية صغيرة من القطرات
00: 08: 01.28 ستحتوي على خلية واحدة وحبة واحدة.
00: 08: 06.14 ما يميز هذه الخرزات هو ذلك
00: 08: 07.00 لكل من هذه الخرزات الكثير
00: 08: 09.11 oligos oligo-dT المشفرة على السطح.
00: 08: 11.27 سيسمح لها ذلك بالتقاط الحمض النووي الريبي
00: 08: 13.27 التي تأتي من كل خلية مغلفة بشكل مشترك.
00: 08: 16.05 ومرة ​​أخرى ، كل واحدة من هذه الخرزات
00: 08: 18.07 له رمز شريطي مختلف عن جميع الخرزات الأخرى.
00: 08: 21.07 وهكذا ، ما يحدث هو أن تحصل على أسر
00: 08: 23.14 من الحمض النووي الريبي على الخرز.
00: 08: 25.04 بعد ذلك ، تقوم بهدم الخرزات
00: 08: 27.09 من الحل ،
00: 08: 28.26 وتقوم بعمل رد فعل نسخ عكسي ،
00: 08: 31.01 مرة أخرى مع عملية تبديل القوالب هذه.
00: 08: 32.23 وفي هذه المرحلة ،
00: 08: 34.17 جميع محتويات كل خلية ملتصقة بحبة واحدة ،
00: 08: 37.24 وجميع تلك cDNAs لها نفس الشيء
00: 08: 41.06 رمز شريطي لأنهما متصلان بالخرز نفسه
00: 08: 43.13 ومرة ​​أخرى ، تحتوي هذه الحبة على العديد من oligo-dT
00: 08: 45.23 مع نفس الرمز الشريطي هناك.
00: 08: 48.20 يمكنك تضخيم (كدنا) ،
00: 08: 50.04 تمامًا كما ناقشنا من قبل ،
00: 08: 51.28 باستخدام PCR.
00: 08: 53.13 وبعد ذلك يمكنك تحضير مكتبة تسلسل الحمض النووي
00: 08: 55.18 والتي سوف تسلسل نهايات كل هذه النصوص.
00: 08: 58.27 ولأننا وضعنا علامة على كل من هذه النصوص
00: 09: 01.14 مع رمز شريطي يتوافق مع خلية ،
00: 09: 05.00 بشكل أساسي تمكنا من المعالجة
00: 09: 07.28 العديد والعديد من الخلايا على التوازي في أنبوبين.
00: 09: 11.03 وبهذه الطريقة ، يمكنك تسلسل الآلاف ، وحتى عشرات الآلاف ،
00: 09: 14.21 من العينات أو الخلايا في عينة واحدة ،
00: 09: 17.21 باستخدام أنبوبين فقط.
00: 09: 19.15 لذا ، لن تحتاج ،
00: 09: 21.13 تعلمون ، 30000 بئر مختلفة ،
00: 09: 22.27 والذي سيكون شاقًا للغاية ولوجستيًا.
00: 09: 24.25 يكاد يكون من المستحيل القيام به.
00: 09: 27.08 إذن ، كان هذا جهدًا تجاريًا جاء من أه.
00: 09: 30.21 التي خرجت من معمل أكاديمي.
00: 09: 33.18 وإحدى المشكلات في هذه الطريقة هي أنه ،
00: 09: 36.13 مرة أخرى ، معظم هذه القطرات لا تحتوي على شيء.
00: 09: 39.00 وجزء صغير فقط من تلك القطرات
00: 09: 41.17 تحتوي على خلية واحدة وحبة واحدة.
00: 09: 42.27 والسبب في ذلك هو
00: 09: 45.01 تلك الخلايا والخرز بشكل عشوائي
00: 09: 47.05 يتم تغليفها في تلك القطرات.
00: 09: 49.09 وهكذا ، يبدو شيئًا كهذا ،
00: 09: 51.13 حيث قد يكون لديك الكثير من الأقسام الفارغة ،
00: 09: 53.22 باللون الرمادي ،
00: 09: 55.02 ثم لديك كسر به
00: 09: 57.22 حبة واحدة أو خلية واحدة.
00: 09: 59.04 وبعد ذلك ، بسبب تلك الطبيعة العشوائية ،
00: 10: 01.04 بالرغم من عدم وجود معظم الآبار أو القطيرات
00: 10: 05.07 مليئة بخلية أو حبة ،
00: 10: 06.28 لديك بعض القطرات
00: 10: 09.12 تحتوي على خرزتين أو أكثر ،
00: 10: 11.16 أو خليتين أو أكثر.
00: 10: 13.23 وهكذا ، يمكنك فعل شيء ما
00: 10: 15.12 حيث يتم زيادة تركيز الخلايا والخرز
00: 10: 17.15 بحيث تحصل على المزيد من القطرات المنفردة.
00: 10: 20.11 قطرات تحتوي على خلية واحدة أو حبة واحدة ،
00: 10: 22.19 لكن معدل مضاعفك يزيد كثيرًا.
00: 10: 25.09 وليس هناك طريقة حقًا لتمييز هذا عن بيانات التسلسل.
00: 10: 29.01 لذلك ، هذا هو السبب ،
00: 10: 30.23 باستخدام تقنية DropSeq هذه ،
00: 10: 32.11 كل من الخلايا والخرز
00: 10: 34.14 يتم تحميلها بتركيز منخفض -
00: 10: 36.17 لتجنب تلك المضاعفات.
00: 10: 38.17 لذلك ، بعد عام أو عامين تقريبًا من ظهور DropSeq ،
00: 10: 42.01 10X Genomics ، شركة تجارية ،
00: 10: 44.08 جاء بطريقة مشابهة جدًا.
00: 10: 46.24 إذا ألقيت نظرة عليه ، فإنه يبدو متشابهًا للغاية.
00: 10: 48.26 لديك خرزات مشفرة تتدفق من الجانب
00: 10: 51.16 تدخل الخلايا والكواشف
00: 10: 53.05 ثم يختلط هؤلاء
00: 10: 55.08 ثم يدخل الزيت لتوليد مستحلب.
00: 10: 57.08 لكن يمكنك أن ترى ، في هذه الصورة ،
00: 11: 00.00 تحتوي معظم هذه القطرات على حبة ،
00: 11: 01.24 وذلك لأنهم قادرون على الهندسة
00: 11: 03.28 كل من جهاز الموائع الدقيقة الخاص بهم وهذه الخرزات
00: 11: 06.12 بحيث ، كما تعلم ، أكثر من 90٪ من القطرات
00: 11: 08.02 تحتوي على خرزة واحدة وخرزة واحدة فقط.
00: 11: 10.26 وبالتالي ، أدى هذا إلى زيادة الكفاءة كثيرًا ،
00: 11: 13.24 لأنهم ليسوا مضطرين لتحميل الخرز
00: 11: 15.17 بتركيز منخفض.
00: 11: 17.07 هناك اختلاف آخر في هذه التقنية وهو أنه
00: 11: 19.13 داخل هذه القطرات ليس لديك مجرد التقاط ،
00: 11: 21.17 لكنك تخضع أيضًا لنسخ عكسي
00: 11: 23.07 داخل هذه القطرات ،
00: 11: 24.22 وهو اختلاف واحد آخر.
00: 11: 26.29 إذن ، في نهاية تفاعل النسخ العكسي هذا ،
00: 11: 29.26 تكسر المستحلب ،
00: 11: 31.15 تأخذ cDNA وتقوم بتضخيمها
00: 11: 33.18 في أنبوب واحد ،
00: 11: 35.06 وبعد ذلك تنشئ مكتبة التسلسل الخاصة بك ،
00: 11: 36.23 مرة أخرى ، في أنبوب واحد ،
00: 11: 38.09 وبعد ذلك يمكنك تسلسل هذا على جهاز التسلسل.
00: 11: 40.27 واعتمادًا على عدد الخلايا التي تقوم بتحميلها في النظام الأساسي ،
00: 11: 44.13 يمكنك تسلسل ما يصل إلى 25000 خلية
00: 11: 47.01 في كل من ممرات هذه الشريحة.
00: 11: 49.25 وهذه الشريحة بها 8 ممرات هناك ،
00: 11: 51.25 لذا يحتمل ، في شريحة واحدة ،
00: 11: 53.23 يمكنك معالجة 200000 خلية.
00: 11: 55.17 وهذه العملية على الرقاقة في الواقع تستغرق 15 دقيقة فقط.
00: 11: 58.27 تستغرق أجزاء المصب هنا حوالي نصف يوم ،
00: 12: 02.00 ولكن هذا مثير للإعجاب جدًا
00: 12: 03.27 بشكل أساسي في يوم واحد طويل ،
00: 12: 06.03 يمكنك معالجة 200000 خلية في وقت واحد -
00: 12: 08.24 أو أكثر إذا قمت بتشغيل عدة فيشات.
00: 12: 12.14 إذن ، هناك طريقة أخرى لموازنة هذه العملية
00: 12: 15.16 لإنشاء مكتبات تسلسل خلية واحدة
00: 12: 17.16 هو استخدام ميكروويلز.
00: 12: 19.00 لذا ، بدلاً من استخدام مستحلب
00: 12: 20.29 لفصل الخلايا عن بعضها البعض ،
00: 12: 22.14 لديك مجموعة صغيرة جدًا من الآبار.
00: 12: 26.00 لذلك ، قد يكون كل من هذه الآبار فقط
00: 12: 28.10 يتراوح قطرها بين بضع عشرات إلى بضع مئات من الميكرونات.
00: 12: 33.20 وهكذا ، هناك نوعان من المنصات مفتوحة المصدر وأيضًا منصات تجارية
00: 12: 36.28 تفعل ذلك ، مثل SeqWell و Celsee و
00: 12: 39.21 والآخر من BD.
00: 12: 42.25 وبشكل أساسي ، طريقة عمل هذه هي أن لديك مصفوفة ميكروويل هذه ،
00: 12: 46.21 ويمكن أن يكون هناك الآلاف ، عشرات الآلاف ،
00: 12: 48.23 أو حتى مئات الآلاف من الآبار على شريحة.
00: 12: 50.15 تضع حبات DNA ذات الرمز الشريطي
00: 12: 53.20 - في هذه الحالة ، هذه ملونة باللون الأزرق.
00: 12: 55.00 وهذه الخرزات مصممة هندسيًا
00: 12: 57.06 بحيث تحصل في معظم الأوقات على حبة واحدة فقط في البئر.
00: 13: 00.04 يغطون نوعًا ما هذه المجموعة من الميكروويلات.
00: 13: 02.23 وبعد ذلك تقوم بتطبيق الخلايا الخاصة بك في الأعلى.
00: 13: 05.05 في هذه الحالة ، في هذا المثال من Celsee ،
00: 13: 07.06 تم تمييز هذه الخلايا باللون الأحمر حتى تتمكن من رؤيتها.
00: 13: 10.01 ومرة ​​أخرى ، في معظم هذه الآبار ،
00: 13: 11.26 لديك حبة زرقاء اللون موجودة.
00: 13: 14.10 وبعد ذلك ستستقر الخلايا في الآبار.
00: 13: 17.18 ثم تمر بعملية التحلل
00: 13: 20.02 وجميع التفاعلات الأنزيمية
00: 13: 22.24 لتمييز الحمض النووي الريبي من كل من تلك الخلايا
00: 13: 25.10 برمز شريطي فريد ،
00: 13: 26.21 وانتقل خلال عملية إعداد المكتبة هذه لإنشاء الخلايا.
00: 13: 29.08 إذن ، ما هو. لإنشاء نماذج مكتبات.
00: 13: 33.00 ومع بعض هذه الطرق ، لديهم آبار ، مرة أخرى ،
00: 13: 36.04 التي بها مئات الآلاف من الآبار ،
00: 13: 37.26 وربما مليون بئر أو أكثر ، على شريحة
00: 13: 40.13 بحيث يمكنك معالجة العديد والعديد من العينات.
00: 13: 42.29 لذلك ، خلال العام الماضي ،
00: 13: 45.21 خرجت ورقة بها
00: 13: 47.29 أكثر من مليون خلية تمت معالجتها في الدراسة.
00: 13: 49.15 وهذه [الورقة] في الواقع
00: 13: 52.05 تستخدم طريقة تسمى الفهرسة التوافقية ،
00: 13: 54.07 الذي سأنتقل إليه بعد ذلك.
00: 13: 56.03 وهكذا ، مع الفهرسة التوافقية ،
00: 13: 58.05 ما يحدث هو أنك تفعل الكثير من ردود الفعل في الموقع ،
00: 14: 01.02 مما يعني أنك تستخدم خلية كمقصورة.
00: 14: 04.07 وأنت لا تعمل مع خلايا فردية
00: 14: 06.28 في أي لحظة ،
00: 14: 08.14 لكنك تقوم بجولات متعددة من التشفير الشريطي
00: 14: 10.21 والخلط
00: 14: 13.29 بحيث يمكنك إنشاء هذه الرموز الشريطية التوافقية
00: 14: 15.15 سيسمح لك بإنشاء بيانات خلية واحدة.
00: 14: 21.16 وهذه طريقة من معمل أكاديمي
00:14: 24.10 في جامعة واشنطن
00: 14: 26.04 يستخدم طريقة فهرسة اندماجية.
00: 14: 28.02 والطريقة التي يعمل بها هذا هو أن لديك خلايا ثابتة على اليمين
00: 14: 31.28 - إذن ، هذه خلايا ثابتة ومنفصلة
00: 14: 34.02 بحيث يمكن أن تتدفق الكواشف داخل وخارج الخلايا.
00: 14: 36.18 ربما تفرز بضع عشرات من الخلايا
00: 14: 39.02 في كل بئر من هذه اللوحة المكونة من 96 بئراً.
00: 14: 40.18 لذا ، فأنت لا تتعامل مع خلايا مفردة.
00: 14: 41.29 لا تزال هناك خلايا متعددة في كل بئر من اللوحة.
00: 14: 44.24 تخضع لرد فعل نسخ عكسي
00: 14: 47.10 باستخدام الرمز الشريطي oligo-dT.
00: 14: 48.28 إذن ، في كل من هذه الآبار ،
00: 14: 50.12 لديك نوع oligo-dT مختلف من الرموز الشريطية.
00: 14: 53.05 لذلك ، كل الخلايا داخل كل بئر
00: 14: 55.03 سيكون لها نفس الرمز الشريطي في هذه الخطوة ، حسنًا؟
00: 14: 57.03 وهذا ما تم تصويره من خلال هذه الألوان هنا.
00: 14: 59.15 لذلك ، لنفترض أنك وضعت.
00: 15: 01.05 تم سحبها من ثلاث آبار ،
00: 15: 03.01 وهكذا ، كما تعلم ،
00: 15: 04.28 العديد من الخلايا ذات اللون الأخضر أو ​​الأزرق أو الأحمر.
00: 15: 07.14 تقوم بدمج هذه الخلايا معًا أو خلطها معًا ،
00: 15: 09.23 وتقوم بإعادة توزيعهم عشوائيًا
00: 15: 12.12 في مجموعة جديدة من الآبار من صفيحة 96 بئر.
00: 15: 14.24 في هذه الخطوة ، تأخذ cDNA الخاص بك
00: 15: 17.29 الموجودة في كل من هذه الخلايا ،
00: 15: 19.12 ثم تقوم بعمل رد فعل مختلف
00: 15: 21.27 سيضيف بعد ذلك رمزًا شريطيًا ثانيًا.
00: 15: 24.10 مرة أخرى ، كل خلية في كل بئر
00:15: 27.10 سيتلقى نفس الرمز الشريطي ،
00: 15: 28.28 ولكن هناك احتمالات لكل خلية في هذا البئر
00: 15: 31.18 جاء من بئر مختلف في هذه اللوحة الأولى.
00: 15: 34.22 وهكذا ، مع هذه المجموعة من الرموز الشريطية
00: 15: 36.22 - كما تعلم ، مع 96 و 96 ،
00: 15: 38.13 لديك حوالي 10000 مجموعة -
00: 15: 39.29 إذا كنت تسلسل حوالي ألف خلية فقط ،
00: 15: 42.04 ليس لديك فرصة كبيرة جدًا لامتلاك خليتين
00: 15: 45.17 بنفس الرمز الشريطي.
00: 15: 48.22 وهذا هو شكل المكتبة النهائية.
00: 15: 51.25 لديك رمز شريطي لـ RT ، أو رمز شريطي للنسخ العكسي.
00: 15: 56.07 لديك أيضًا رمزان شريطيان مختلفان
00: 15: 57.29 الموجودة في محولات Illumina
00: 15: 59.19 يمكن استخدامه أيضًا.
00: 16: 00.25 لذلك ، يمكنك استخدام الرمز الشريطي حتى ثلاث مرات
00: 16: 02.25 بهذه الطريقة.
00: 16: 04.09 وقوة هذه التقنية
00: 16: 06.21 يأتي حقًا عندما تضيف المزيد من هذه المستويات.
00: 16: 09.12 لذا ، على سبيل المثال ، مرة أخرى ،
00: 16: 11.17 إذا كان لديك مجموعتان من أطباق 96 جيدًا
00: 16: 13.23 وأنت ترميزهم ،
00: 16: 15.17 لديك ما يقرب من 10000 مجموعة.
00: 16: 17.06 إذا كنت ستعمل مع 384 لوحة جيدة ،
00: 16: 18.24 لديك ما يقرب من 150000 مجموعة.
00: 16: 22.23 وفي الواقع ليس من السخف العمل مع العديد من اللوحات ذات 384 جيدًا في كل خطوة.
00: 16: 25.29 وهكذا ، إذا كان لديك أربعة ألواح بئر 384 جيدًا في كل خطوة
00: 16: 29.17 - أو 1536. مزيج من كل خطوة -
00: 16: 32.08 يمكنك إنشاء حوالي 2.4 مليون مجموعة مختلفة.
00: 16: 35.02 وهكذا ، هذا هو مجرد جولتين من الترميز الشريطي.
00: 16: 37.10 إذا كنت ستقوم بثلاث جولات من التشفير الشريطي
00: 16: 39.08 وأضف رمزًا شريطيًا آخر
00: 16: 40.28 - في هذه الحالة ، 96 أو 384 للمستوى الثالث -
00: 16: 45.05 تقيس الأرقام حقًا.
00: 16: 47.04 وهكذا ، في هذه الحالة ،
00: 16: 48.24 أنا أمثل هذه الأرقام بالملايين الآن ،
00: 16: 50.26 فقط لأن الأرقام ستكون أكبر من أن تتناسب مع هذا المخطط.
00: 16: 53.15 وهكذا ، في هذه الحالة ، إذا كنت ستفعل
00: 16: 56.02 96 × 96 × 96 بثلاثة مستويات ،
00: 16: 58.11 سيكون لديك حوالي مليون مجموعة.
00: 17: 00.05 إذا قمت بإجراء 384 × 384 × 384 ،
00: 17: 03.08 سيكون لديك ما يقرب من 60 مليون مجموعة.
00: 17: 05.25 وهكذا ، هذا هو سبب هذا الحجم
00: 17: 07.25 حقًا ، جيد جدًا ،
00: 17: 09.11 خاصة إذا قمت بإضافة المستوى الثالث من الترميز الشريطي.
00: 17: 13.09 لذا ، تغيير التروس قليلاً ،
00: 17: 14.26 ركزنا في الغالب على تسلسل الحمض النووي الريبي ،
00: 17: 16.23 لكن من الممكن القيام بأشياء أخرى
00: 17: 18.29 مع منصات تسلسل خلية واحدة.
00: 17: 20.23 وأحد هؤلاء هو تحديد كمية البروتينات.
00: 17: 22.28 وهكذا ، قد تسأل ،
00: 17: 24.15 كيف يمكنني تحديد كمية البروتين باستخدام تسلسل الحمض النووي؟
00: 17: 26.15 والطريقة التي تم استخدامها ،
00: 17: 29.11 يسمى CITE-seq ،
00: 17: 31.01 هو أن لديك الأجسام المضادة الخاصة بك
00: 17: 33.16 التي سوف ترتبط بالبروتينات ذات الأهمية.
00: 17: 35.03 إذن ، هذا مشابه لجسم مضاد
00: 17: 36.20 قد تستخدمها لتحليل التدفق ،
00: 17: 38.15 ولكن بدلاً من اقتران حامل الفلور
00: 17: 40.24 ليتم قراءتها بالتدفق ،
00: 17: 42.15 أو نظير لـ CyTOF ،
00: 17: 44.21 أنت تقرن على باركود DNA.
00: 17: 47.06 وهكذا ، فإن رمز DNA الشريطي به مقبض PCR في النهاية ،
00: 17: 50.12 رمز شريطي يخبرك بالجسم المضاد المرتبط به
00: 17: 53.00 - مرة أخرى ، هذا مجرد رمز شريطي لتسلسل الحمض النووي ،
00: 17: 56.00 إذن أ ، ج ، ج ، ت
00: 17: 57.20 لديك فقط تسلسل فريد لكل جسم مضاد -
00: 17: 59.28 ثم ذيل بولي أ.
00: 18: 02.09 لذا ، فإن ذيل polyA هذا سيسمح بتسلسل هذا الجسم المضاد
00: 18: 04.22 لالتقاطها بواسطة طرق تسلسل الخلية المفردة ،
00: 18: 06.21 وبعد ذلك يمكنك قراءة الباركود ،
00: 18: 09.28 أساسًا باعتباره a. كنص
00: 18: 11.27 سيخبرك بعدد نسخ هذا الجسم المضاد
00: 18: 14.01 كانت مرتبطة ، كما تعلم ، بتلك الخلية المعينة.
00: 18: 16.09 وهكذا ، فهذه مجرد بعض البيانات للمقارنة
00:18: 18.28 تحليل الحمض النووي الريبي مع تحليل البروتين ،
00: 18: 20.24 فقط باستخدام خلايا بشرية وفأرية
00: 18: 23.11 تم خلطهما معًا نوعًا ما ،
00: 18: 24.26 لتوضيح أن الطريقة تعمل.
00: 18: 27.11 وهناك حاليًا ألواح من الأجسام المضادة
00: 18: 29.12 - حوالي 100 أو أكثر من الأجسام المضادة -
00: 18: 31.15 يمكنك استخدامها مع تسلسل الخلية المفردة.
00: 18: 34.19 والشيء الرائع هنا هو ذلك
00: 18: 36.23 لا يمكنك الحصول على وفرة من البروتين فقط
00: 18: 38.14 للبروتينات التي لديك أجسام مضادة لها ،
00: 18: 40.15 ولكنك تحصل أيضًا على قراءات نصية
00: 18: 42.16 من حيث الجينات التي يتم تشغيلها وإيقافها أيضًا
00: 18: 45.15 في كل من هذه الخلايا.
00: 18: 46.28 إذن ، تحصل على هذا النوع من ملف. نهج متعدد omic ،
00: 18: 48.08 حيث يمكنك تحليل كل من البروتين والحمض النووي الريبي.
00: 18: 53.05 إذن ، هناك مشكلة واحدة أخبرتك عنها سابقًا
00: 18: 54.24 ببعض هذه الطرق
00: 18: 56.12 هي مسألة المضاعفات.
00: 18: 58.06 لذا ، إذا تجاهلنا فقط مضاعفات الخرزة
00: 19: 00.06 وركز فقط على تعدد الخلايا ،
00: 19: 01.28 هذا أحد أسباب محدوديتنا
00: 19: 04.02 من حيث عدد الخلايا التي تخرج منها.
00:19:07.12 both these microfluidic and microwell platforms.
00:19:09.27 And again, you don't want to load very many cells
00:19:13.00 because you want most of these droplets
00:19:15.05 to be empty so that you avoid these doublets.
00:19:17.08 So, again, if you were to increase the concentration of cells
00:19:21.13 that you load in to maximize the number of singlets
00:19:23.17 -- so, for instance, over here you have four singlets --
00:19:28.03 you do increase the rate of your doublets
00:19:30.24 -- so, these increase here and here.
00:19:32.19 Now, if there's some way to identify these doublets,
00:19:34.28 you could remove them computationally
00:19:37.02 from your data analysis.
00:19:38.18 And so, for instance,
00:19:40.00 if you had two differentially labeled samples
00:19:42.24 that you pooled together,
00:19:44.14 and then you flowed into your microfluidic device
00:19:46.25 at a high concentration,
00:19:48.11 you would get multiplets.
00:19:49.24 But if the multiplets came from two different cell types,
00:19:51.08 and you can identify that,
00:19:52.26 you can exclude those from analysis,
00:19:54.12 and then actually get more single cells for the same cost.
00:19:59.06 And so, one.
00:20:01.06 the first strategy to do this was a method called demuxlet.
00:20:03.16 And this is multiplexing by genotype.
00:20:05.22 So, this group, here at UCSF,
00:20:07.20 was working with different patient samples,
00:20:10.04 and with different humans,
00:20:12.02 we all have different DNA sequences.
00:20:14.05 And some of these sequences are found in our transcripts,
00:20:17.03 and those can be detected by single cell RNA sequencing.
00:20:20.18 And so, in this example,
00:20:22.10 they had eight different donors that had different genotypes,
00:20:25.03 depicted by different colors here,
00:20:26.22 that got combined and then run
00:20:28.25 in a single cell sequencing platform.
00:20:30.13 So, you get a whole bunch of single cell data.
00:20:32.11 And if you take a look at each individual cell
00:20:34.27 -- let's take a look at one cell, here --
00:20:36.19 we see a certain genotype in the transcripts,
00:20:38.26 and we can match that with one of the original donors.
00:20:42.03 So, we can tell that this sample.
00:20:44.16 or, this cell came from this patient sample.
00:20:46.02 And you can do this for most of the cells in.
00:20:48.27 in the. in the data set.
00:20:50.22 What's really cool about this method
00:20:53.14 is that if you have a doublet
00:20:55.06 -- two cells in a single droplet --
00:20:56.26 and you have eight different samples,
00:20:58.22 chances are those two cells came from different samples,
00:21:01.16 and they'll have two different genotypes.
00:21:03.26 So, if you analyze the data within those cells,
00:21:06.09 if you see the presence of two different genotypes,
00:21:08.15 you know that's a doublet,
00:21:09.28 and we can remove those from analysis.
00:21:11.20 So, this allows you to bump up that concentration
00:21:13.19 and get more single cell data
00:21:15.18 for the same cost.
00:21:17.18 So, if you're not working with genetically distinct individuals,
00:21:20.06 this method won't work,
00:21:21.26 and so there are a couple of non-genetic strategies
00:21:23.27 that came out.
00:21:25.08 The first one was from the same group that developed CITE-seq.
00:21:27.08 They realized that if they used an antibody
00:21:29.08 that binds to some type of universal surface antigen on cells,
00:21:34.14 they could take that antibody
00:21:36.17 and split it up into a couple of different aliquots.
00:21:38.17 And with each aliquot,
00:21:40.07 you can give it a different barcode.
00:21:42.15 Then, you can take your different samples
00:21:44.11 and then add them to these different aliquots of antibodies
00:21:47.18 to allow them to bind.
00:21:49.07 At that point, you can pool them all together,
00:21:51.03 run them in the single cell sequencing platform,
00:21:53.15 and you look for the presence
00:21:55.17 of which barcoded antibody showed up.
00:21:58.13 And this will allow you to set.
00:22:00.10 assign each of these individual cells
00:22:02.10 to a particular starting sample,
00:22:03.22 because you knew which barcode.
00:22:05.11 the antibody used for each sample.
00:22:08.04 And again, this also has the advantage
00:22:10.09 where, if you have two or more cells in a droplet,
00:22:12.08 you can detect those,
00:22:14.00 because you'll see two different barcode sequences
00:22:16.08 assigned to a single droplet.
00:22:18.02 And you can exclude that from analysis.
00:22:20.06 More recently,
00:22:22.05 in collaboration with other group at UCSF,
00:22:23.22 we developed a method that is a universal method
00:22:25.27 that uses lipidated DNA
00:22:28.13 that embeds into the membranes of cells.
00:22:30.00 So, this doesn't depend on the surface antigen.
00:22:32.01 It just depends on an accessible membrane
00:22:35.17 that this barcoding DNA molecule can insert into.
00:22:39.23 So, it inserts into the membrane of cells.
00:22:41.26 You can insert a different barcode into each pool of samples,
00:22:44.21 and then pool them together.
00:22:46.08 In this case, we were able to barcode
00:22:48.15 96 different samples, pool them together,
00:22:49.28 and we can identify all the singlets and the doublets.
00:22:52.19 And you can see all the different 96 samples
00:22:55.11 represented here, in this plot.
00:22:58.21 So, in conclusion,
00:23:00.27 there are actually many different types of single cell sequencing.
00:23:03.13 I've only focused on RNA today,
00:23:04.26 but there's DNA, there's protein,
00:23:06.24 there's chromatin accessibility.
00:23:08.11 And many, many new methods coming out,
00:23:10.09 you know, every few weeks.
00:23:11.24 So, it's an exciting field to be in.
00:23:14.08 Single cell sequencing also generates
00:23:17.02 high dimensional data,
00:23:18.26 especially if you're looking at RNA,
00:23:20.26 because you're probing the quantity, or the expression level,
00:23:22.24 of all 20,000 different genes that can be expressed in cells.
00:23:24.26 And so, this can reveal biology
00:23:27.00 that's hidden from lower dimensional techniques.
00:23:29.14 So, single cell sequencing does have some disadvantages.
00:23:31.29 It is lower throughput and more expensive
00:23:33.22 compared to flow cytometry and mass cytometry.
00:23:35.08 You know, with those methods,
00:23:37.02 you can easily analyze hundreds of thousands
00:23:39.00 or millions of cells at a time.
00:23:40.27 And I also didn't mention single cell analysis
00:23:44.02 that doesn't use sequencing.
00:23:45.21 So, there are microscopy-based techniques
00:23:47.29 that are out there as well
00:23:49.23 that have some very interesting, you know, properties,
00:23:52.09 including the ability to give you some spatial information.
00:23:54.21 So, if you're working with tissues,
00:23:57.19 with most single cell sequencing techniques right now,
00:23:59.12 you have to dissociate those tissues
00:24:01.04 into a single cell suspension
00:24:02.29 and then run them.
00:24:04.11 So, you lose a lot of that spatial context
00:24:05.29 that might be important for the biological question
00:24:07.22 that you're trying to answer.
00:24:09.15 And some of these microscopy methods
00:24:11.09 can offer you some additional information that might be valuable.
00:24:14.14 And so, again, thank you for watching today.
00:24:16.27 And I hope you enjoyed this video.

  • Educators of H. School / Intro Undergrad
  • طالب
  • Educators of Adv. Undergrad / Grad
  • Researcher
  • المتعلمين

Microdeletion associated with the integration process of hepatitis B virus DNA

Hepatitis B virus (HBV) DNA is often found in integrated form in hepatocellular carcinomas (HCC) and in non-cancerous liver cells of chronic carriers of HBV. However, the process of integration has not been well understood. Analyses of integrant DNA was expected to give clues. However, the majority of the integrants are products of multistep rearrangements following integrations, and analysis of randomly selected samples do not give clues for understanding the process of primary integrant formation. Therefore, one must select an appropriate integrant(s) that has a simple structure. We surveyed a collection of integrants prepared from many HCC's, and found one integrant that has the simplest structure so far studied: The viral genome is almost complete, is joined to cellular DNA using the cohesive end of the viral DNA, and furthermore, the "left" and "right" flanking cellular DNA's are almost contiguous. Analysis of the unoccupied sites in cellular DNA showed that, although almost contiguous, it has generated a microdeletion (15 base pairs) in the target sequence. This target sequence has a short region of homology to the sequence in the viral genome located close to the junction. One integrant with strikingly similar features has been reported independently. Two similar, but not identical cases from literatures could be added to this category. Therefore, the integrants with these properties may represent a unique category among those prepared from hepatocellular carcinomas. Based on these findings, we propose that this integrant represents the primary product of integration, and discuss the intermediate acting in the process of integration.


16.11: DNA Sequencing - Biology

All the cells of one organisms share the genome. However, during development, some cells develop into skin cells while others develop into muscle cells. How can the same genetic instructions result in two different cell types in the same organism? Thoroughly explain your answer.

  1. When lactose and glucose are present in the medium, transcription of the lac operon is induced.
  2. When lactose is present but glucose is absent, the lac operon is repressed.
  3. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is absent.
  4. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is present.
  1. Mutation in structural genes will stop transcription.
  2. Mutated lacY will produce an abnormal β galactosidase protein.
  3. Mutated lacA will produce a protein that will transfer an acetyl group to β galactosidase.
  4. Transcription will continue but lactose will not be metabolized properly.

In some diseases, alteration to epigenetic modifications turns off genes that are normally expressed. Hypothetically, how could you reverse this process to turn these genes back on?

  1. In new seedlings, histone acetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  2. In new seedlings, histone deacetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  3. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, acetylation occurs.
  4. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, deacetylation occurs.
  1. Mutated promoters decrease the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  2. Mutated promoters increase the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  3. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors to increase or decrease the rate of transcription.
  4. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors and thereby cease transcription of the adjacent gene.
  1. The transcription rate would increase, altering cell function.
  2. The transcription rate would decrease, inhibiting cell functions.
  3. The transcription rate decreases due to clogging of the transcription factors.
  4. The transcription rate increases due to clogging of the transcription factors.

ال wnt transcription pathway is responsible for key changes during animal development. Based on the transcription pathway shown below. In this diagram, arrows indicate the transformation of one substance into another. Square lines, or the lines with no arrowheads, indicate inhibition of the product below the line. Based on this, how would increased wnt gene expression affect the expression of Bar-1?

  1. RBPs can bind first to the RNA, thus preventing the binding of miRNA, which degrades RNA.
  2. RBPs bind the miRNA, thereby protecting the mRNA from degradation.
  3. RBPs methylate miRNA to inhibit its function and thus stop mRNA degradation.
  4. RBPs direct miRNA degradation with the help of a DICER protein complex.
  1. UV rays can alter methylation and acetylation of proteins.
  2. RNA binding proteins are modified through phosphorylation.
  3. External stimuli can cause deacetylation and demethylation of the transcript.
  4. UV rays can cause dimerization of the RNA binding proteins.
  1. Phosphorylation of proteins can alter translation, RNA shuttling, RNA stability or post transcriptional modification.
  2. Phosphorylation of proteins can alter DNA replication, cell division, pathogen recognition and RNA stability.
  3. Phosphorylated proteins affect only translation and can cause cancer by altering the p53 function.
  4. Phosphorylated proteins affect only RNA shuttling, RNA stability, and post-translational modifications.
  1. UV rays could cause methylation and deacetylation of the genes that could alter the accessibility and transcription of DNA.
  2. The UV rays could cause phosphorylation and acetylation of the DNA and histones which could alter the transcriptional capabilities of the DNA.
  3. UV rays could cause methylation and phosphorylation of the DNA bases which could become dimerized rendering no accessibility of DNA.
  4. The UV rays can cause methylation and acetylation of histones making the DNA more tightly packed and leading to inaccessibility.
  1. These drugs maintain the demethylated and the acetylated forms of the DNA to keep transcription of necessary genes “on”.
  2. The demethylated and the acetylated forms of the DNA are reversed when the silenced gene is expressed.
  3. The drug methylates and acetylates the silenced genes to turn them back “on”.
  4. Drugs maintain DNA methylation and acetylation to silence unimportant genes in cancer cells.
  1. Understanding gene expression patterns in cancer cells will identify the faulty genes, which is helpful in providing the relevant drug treatment.
  2. Understanding gene expression will help diagnose tumor cells for antigen therapy.
  3. Gene profiling would identify the target genes of the cancer-causing pathogens.
  4. Breast cancer patients who do not express EGFR can respond to anti-EGFR therapy.
  1. Personalized medicines would vary based on the type of mutations and the gene’s expression pattern.
  2. The medicines are given based on the type of tumor found in the body of an individual.
  3. The personalized medicines are provided based only on the symptoms of the patient.
  4. The medicines tend to vary depending on the severity and the stage of the cancer.
  • أنت هنا: & # 160
  • الصفحة الرئيسية
  • كتب قسم علم الأحياء أندوفر
  • علم الأحياء Openstax لدورات AP (كتاب مدرسي لتسلسل Bio58x)
  • بيو 581
  • Chapter 16 Gene Regulation
  • 16.11 Critical Thinking Questions

يستند هذا النص إلى Openstax Biology لدورات AP ، المؤلفين المساهمين الكبار Julianne Zedalis ، مدرسة Bishop في La Jolla ، كاليفورنيا ، John Eggebrecht ، المؤلفون المساهمون بجامعة كورنيل Yael Avissar ، كلية رود آيلاند ، Jung Choi ، معهد جورجيا للتكنولوجيا ، Jean DeSaix ، University of North Carolina at Chapel Hill، Vladimir Jurukovski، Suffolk County Community College، Connie Rye، East Mississippi Community College، Robert Wise، University of Wisconsin، Oshkosh

هذا العمل مُرخص بموجب ترخيص Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License بدون قيود إضافية


مناقشة

A fundamental assumption underlying the use of cultured cells in biological research is that cell lines retain and mimic the molecular characteristics of the tissue from which they were derived, allowing observations made في المختبر to be directly translated to an في الجسم الحي سياق الكلام. Cell lines have been extensively used to investigate the normal and pathogenic role of DNA methylation, particularly its dysregulation in cancer [20]. However, over 20 years ago, Antequera, Boyes and Bird [11] noted aberrant de novo CGI methylation at 14 loci in mouse NIH3T3 and L cells, which was interpreted as cell culture-induced changes in DNA methylation. Subsequently, using restriction landmark genomic scanning, a comparison of six human ES cell lines derived and cultured in various conditions showed widespread inter-line differences in DNA methylation, which could be further altered by changing serum levels in culture [43]. Mouse ES cells are derived from E3.5 blastocyst cells that are globally hypomethylated, but once grown in serum they become hypermethylated [44]. In analogous observation to our adaptation experiment, there is a massive deposition of DNA methylation during ES cell establishment in serum [45]. However, cultivating ES cells in the presence of small molecule inhibitors (2i medium) leads to reversible global hypomethylation [46]. Molecular analysis suggests there is a high degree of similarity between the hypomethylated E3.5 blastocyst cells and 2i ES cells, as well as between hypermethylated E6.5 blastocyst cells and serum ES cells [44,47,48]. This demonstrates that the correct culturing conditions can lead to ‘epigenetic’ equivalence between cells propagated in culture and their embryo/animal counterparts.

Restriction landmark genomic scanning was also used to reveal that CGI hypermethylation was 5-fold to 90-fold more common in cancer cell lines compared with primary malignancies, and that approximately 60% of the loci methylated in cancer cell lines were never methylated in the 114 primary malignancies studied [49]. A recent large-scale genome-wide study of DNA methylation re-emphasized the effect of cell culture on the epigenome [50]. Using reduced-representation bisulfite sequencing, Varley and colleagues [50] found that normal human tissues and primary cell lines form two separate and robust clades based on genome-wide DNA methylation patterns. That is, the methylome of primary cell lines from multiple different tissues more closely resembled each other than the normal tissues from which they were derived [50]. How and why cell lines accumulate CGI methylation in culture is unknown, but in their seminal paper in 1990, Antequera, Boyes and Bird proposed that the observed CGI hypermethylation was consistent with a loss of DNA demethylase activity in culture, 20 years prior to the characterization of a robust mammalian demethylation pathway based on 5hmC/Tet [11].

By studying the establishment of MEFs in culture we found that adaptation by mammalian cells resulted in a rapid and comprehensive re-programming of the transcriptome and epigenome, indicative of an altered cell state. Re-programming involved almost complete loss of 5hmC in cultured cells, consistent with loss of a methylcytosine dioxygenase activity in culture in the absence of Tet enzymatic activity, 5hmC lost by dilution during each round of DNA replication cannot be restored. This loss was observed genome-wide and was not restricted to particular genomic compartments, again consistent with a general loss of Tet-mediated demethylase activity. In the absence of a demethylase activity, de novo methylation events cannot be erased and would result in progressive accumulation of methylation at methylation-prone loci, which over time is likely (perhaps through spreading) to affect gene expression, imprinting, chromatin structure and genome stability. Indeed, even at the early time-points assayed here, we observed increased CGI methylation at several loci known to be prone to hypermethylation in cancer, such as the هوكس clusters [51,52].

The epigenetic remodeling we observed was paralleled by extensive gene expression changes in culture. Up-regulated genes were linked to cell adhesion and extracellular matrix organization, possibly reflecting adaptation to growth on a two-dimensional plastic surface. However, a recent study has suggested that these genes are regulated directly by Tet1 in MEFs [37]. A highly significant down-regulation of genes involved in a variety of epigenetic processes, including nucleosome assembly, chromatin modification, DNA methylation and DNA demethylation, were also observed. وشملت هذه Tet1 and three components of the PRC2 complex, which deposits the repressive histone modification H3K27me3, namely Ezh2, Suz12 و Rbbp4. Tet1 directly interacts with Suz12 in mouse ES cells, and loss of Suz12 results in a global loss of 5hmC in mouse ES cells similar in scale to that reported here [35]. It is tempting to speculate that CGIs marked by H3K27me3 are actively maintained in an unmethylated state by Tet1 and may thus be particularly susceptible to aberrant methylation upon loss of the Tet1 interaction with the PRC2 complex, or methylcytosine dioxygenase activity in culture.

A 50% reduction in Tet1 gene expression is unlikely to fully account for the significant global loss of 5hmC observed, particularly as expression of Tet2 و Tet3 were relatively unchanged in culture. All Tet enzymes require 2-oxoglutarate and vitamin C as cofactors to efficiently catalyze hydroxylation of canonical 5mC to 5hmC [24]. Most cell culture media do not contain vitamin C, and several recent studies have shown that addition of vitamin C increases Tet enzyme activity and 5hmC levels in MEFs and mouse ES cells [23,37]. We observed a partial yet substantial recovery of global 5hmC levels upon addition of 1,000 μM vitamin C during establishment of MEF cultures. This result suggests that the observed loss of 5hmC results from both a reduction of Tet1 levels and general loss of Tet activity due to limiting co-factors. Significantly, addition of vitamin C to mouse ES cells resulted in greater Tet-dependent demethylation at methylated CGIs, resulting in a more blastocyst-like state in the ES cells [23]. This finding, in combination with our observations reported here, suggest that optimization of culture media with regard to enzymatic co-factors may ameliorate the scale of epigenetic changes occurring in culture. The identification of suitable substrates for culturing cells, probably in three dimensions, will also lead to improvements in generating في المختبر equivalents of في الجسم الحي cellular morphologies. As vitamin C is an essential co-factor for a growing list of enzymes, including the epigenetic modifiers JHDM1B, KDM3 and KDM4, and regulates hypoxic inducible factor (HIF)-1 activity through asparagine and proline hydroxylases and is also critical to collagen metabolism, caution may need to be applied when assessing the effect of vitamin C on individual molecular pathways such as DNA demethylation [53-55].

Our findings reinforce a growing realization that cell line models of human diseases, particularly cancer, can be poor surrogates for many aspects of في الجسم الحي biology, as emphasized in a recent study of multi-drug resistance genes in ovarian cancer, in which no correlation in expression was found between primary ovarian cancer samples and established cancer cell lines [56]. Though novel, the findings presented here do not address cause and effect of the observed reprogramming during the process of adaptation of cells to culture. That is, are the observed changes driven by epigenome dynamics or is the epigenome responding to changes in transcription factor networks? Are the observed gains in 5mC due to loss of 5hmC or independent of this deficit? A system in which Tet1 expression can be induced during the process of adaptation to culture would help to address some of these questions. It is worth noting that Tet1 can replace Oct4 to initiate somatic cell reprogramming in conjunction with Sox2, Klf4, and c-Myc [57]. This requires an active form of the enzyme that results in altered DNA methylation and hydroxymethylation profiles in the derived pluripotent cells.


Next-generation DNA Sequencing Techniques and Applications

Thursday, 31 May 2012 at 11:45

Add to Calendar ▼ 2012-05-31 11:45:00 2012-05-31 12:45:00 Europe/London Next-generation DNA Sequencing Techniques and Applications SELECTBIO [email protected]

Next generation DNA sequencing techniques are opening fascinating opportunities in life sciences. Commercially available DNA sequencing platforms, Single molecule Real-time methods, Nanopores (also Graphene), as well as other techniques under development are described and applications in bio-medical fields discussed.


خلفية

Repetitive sequences present many difficulties for genome sequencing and analysis. The presence of large numbers of repeats often confounds sequence assembly, especially if the repeats are long and highly conserved. The presence of low copy-number repeats can also confound assembly, especially for whole-genome shotgun sequencing projects [1]. Once a genome has been assembled, repeats take on a new and more important role involving their biological function. Certain classes of repeats, such as transposons, perform a function by allowing mobile elements to move around a genome. Other classes belong to less well-defined categories with respect to their role, though they may be even more ubiquitous. Repetitive sequences appear to dominate the centromeres of many eukaryotes [2], and telomeric and subtelomeric repeats extend for thousands or tens of thousands of nucleotides at the ends of chromosomes. These repeats also appear elsewhere in the genome, for reasons as yet unknown. For these and other reasons, it is critical to both the assembly and analysis of genomic sequences to identify and characterize repetitive sequence elements.

There are numerous computational methods for detecting repeats, in one form or another, in genomic DNA sequences. These include algorithms that locate repeated substrings, including tandem repeats [3,4,5,6], as well as programs for identifying known repeats, such as the widely-used RepeatMasker [7]. RepeatMasker uses a database of known repeat sequences and implements a string-matching algorithm to find copies of those repeats in a new sequence. A more rapid implementation of the same approach is MaskerAid [8], a wrapper for WU-BLAST [9,10] that uses the BLAST engine instead of the CrossMatch algorithm. Most of these tools have some restriction on the maximum length of the input sequence, which limits their use to sequences considerably smaller than the size of a eukaryotic chromosome. Recently, however, new systems based on suffix trees, such as RepeatMatch (based on MUMmer [11]) and REPuter [12,13], have overcome this size limitation, at least for biologically realistic input sizes. Both RepeatMatch and REPuter are highly efficient computational tools that can find all exact repeats in sequences as long as complete eukaryotic chromosomes - 10–100 megabases (Mb). The output of these systems, however, while accurately representing the long list of positions of exact repeats, does not provide any overview or summary of the repetitive structure of the sequence. The REPuter system includes a visualization tool to generate repeat graphs, which are useful for identifying the positions of repeats, but this does not provide an overview of the exact and non-exact repeats in a genome. Figure 1 shows an example of a repeat graph [12] for a short DNA sequence.

Exact repeats. An example sequence of 180 bp and graphical depiction of exact repeats, using minimal repeat length 6 bp. This example shows forward and reverse complemented repeats. In the repeat graph [12], both of the horizontal lines correspond to the example sequence, and diagonal lines connect the two occurrences of each repeat. REPuter includes a visualization tool to provide similar graphics.

Examining the output of REPuter and RepeatMatch for a complete bacterial genome, it quickly becomes obvious that many exact repeats are non-exact copies of one another. Whether a genome is a few or hundreds of megabases in length, the task of recognizing and describing how repeats resemble one another at this scale is too complicated to accomplish manually.

Here we describe a new system for the recognition of repeat classes in genome sequences. This system, RepeatFinder, is freely available from our website [14]. In contrast to approaches that cluster together the results of BLAST searches (for example, Z.H. Bao and S. Eddy, unpublished data) our algorithm uses a comprehensive set of exact repeats as the basis for constructing repeat classes. It relies on the efficient suffix tree data structure for identification of exact repeats, which permits rapid identification of repeat classes even in sequences containing tens of millions of nucleotides. The algorithm does not make any prior assumptions about the number or structure of the classes. At its core is a merging procedure that produces the actual members of each repeat class using merging criteria described below, and it also builds a repeat map of the genome sequence.

We have applied this system to several complete microbial genomes [15,16,17,18,19,20,21], to the complete نبات الأرابيدوبسيس thaliana genome [2], and to a large collection of rice bacterial artificial chromosome (BAC) end sequences [22,23]. The results of this analysis are described below. The output of the system gives a clear picture of all repeat classes identified in a genome or a sequence collection. It provides straightforward access to the actual repeat sequences as a multi-fasta file, simple statistical analyses of the results, and a procedure for identifying each class's most representative element. We describe here the computational techniques used in the system and demonstrate its use on several different genome sequences.


Labs and Facilities

Burroughs AM, Kaur G, Zhang D, Aravind L. Novel clades of the hu/ihf superfamily point to unexpected roles in the eukaryotic centrosome, chromosome partitioning, and biological conflicts. دورة الخلية. 2017, 16(11):1093-1103.

Li J, Bonkowski MS, Moniot S, Zhang D, Hubbard BP, Ling AJ, Rajman LA, Qin B, Lou Z, Gorbunova V, Aravind L, Steegborn C, Sinclair DA. A conserved NAD+ binding pocket that regulates protein-protein interactions during aging. علم. 2017, 355(6331):1312-1317.

Zhang D, Burroughs AM, Vidal ND, Iyer LM, Aravind L. Transposons to toxins: the provenance, architecture and diversification of a widespread class of eukaryotic effectors. بحوث الأحماض النووية. 2016, 44(8):3513-3533.

Iyer LM, Zhang D, Aravind L. Adenine methylation in eukaryotes: Apprehending the complex evolutionary history and functional potential of an epigenetic modification. BioEssays. 2016, 38(1):27-40.

Burroughs AM, Zhang D, Schäffer DE, Iyer LM, Aravind L. Comparative genomic analyses reveal a vast, novel network of nucleotide-centric systems in biological conflicts, immunity and signaling. بحوث الأحماض النووية.2015, 43(22):10633-10654.

Aravind L, Zhang D, de Souza RF, Anand S, Iyer LM. The natural history of ADP-ribosyltransferases. الموضوعات الحالية في علم الأحياء الدقيقة والمناعة. 2015, 384: 3-32.

Aravind L, Burroughs AM, Zhang D, Iyer LM. Protein and DNA modifications: evolutionary imprints of bacterial biochemical diversification and geochemistry on the provenance of eukaryotic epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.2014, 6(7):a016063.

Zhang D, Iyer LM, Burroughs AM, Aravind L. Resilience of biochemical activity in protein domains in the face of structural divergence. Current Opinion in Structural Biology. 2014, 26:92-103

Pusapati GV 1 , Hughes CE 1 , Dorn KV 1 , Zhang D 1 , Sugianto P, Aravind L, Rohatgi R. EFCAB7 and IQCE regulate hedgehog signaling by tethering the EVC-EVC2 complex to the base of primary cilia. الخلية التنموية. 2014, 28(5):483-496. ( 1 co-first authors)

Iyer LM 1 , Zhang D 1 , de Souza RF, Pukkila PJ, Rao A, Aravind L. Lineage-specific expansions of TET/JBP genes and a new class of DNA transposons shape fungal genomic and epigenetic landscapes. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية. 2014, 111(5):1676-1683. ( 1 co-first authors)

Iyer LM, Zhang D, Burroughs AM, Aravind L. Computational identification of novel biochemical systems involved in oxidation, glycosylation and other complex modifications of bases in DNA. Nucleic Acids Research. 2013, 41(16):7635-7655.

Zhang D, Iyer LM, He F, Aravind L. Discovery of Novel DENN Proteins: Implications for the Evolution of Eukaryotic Intracellular Membrane Structures and Human Disease. Frontiers in Genetics: Bioinformatics and Computational Biology. 2012, 3:283.

Zhang D, Xi Y, Coccimiglio ML, Mennigen JA, Jonz MG, Ekker M, Trudeau VL. Functional prediction and physiological characterization of a novel short trans-membrane protein 1 as a subunit of mitochondrial respiratory complexes. Physiological Genomics.2012, 44(23):1133-1140.

Zhang D, Aravind L. Novel transglutaminase-like peptidase and C2 domains elucidate the structure, biogenesis and evolution of the ciliary compartment. دورة الخلية. 2012, 1(20):3861-3875.

Zhang D, Iyer LM, Aravind L. Bacterial GRAS domain proteins throw new light on gibberellic acid response mechanisms. المعلوماتية الحيوية. 2012, 28(19):2407-2411.

Zhang D, de Souza RF, Anantharaman V, Iyer LM, Aravind L. Polymorphic toxin systems: Comprehensive characterization of trafficking modes, processing, mechanisms of action, immunity and ecology using comparative genomics. Biology Direct.2012, 7:18.

Iyer LM, Zhang D, Rogozin IB, Aravind L. Evolution of the deaminase fold and multiple origins of eukaryotic editing and mutagenic nucleic acid deaminases from bacterial toxin systems. بحوث الأحماض النووية.2011, 39(22):9473-9497.

Zhang D, Iyer LM, Aravind L. A novel immunity system for bacterial nucleic acid degrading toxins and its recruitment in various eukaryotic and DNA viral systems. بحوث الأحماض النووية. 2011, 39(11):4532-4552.

Zhao E, Grey CL, Zhang D, Mennigen JA, Basak A, Chang JP, Trudeau VL. Secretoneurin is a potential paracrine factor from lactotrophs stimulating gonadotropin release in the goldfish pituitary. American Journal of Physiology - Regulatory,Integrative and Comparative Physiology.2010, 299(5):R1290-R1297.

Zhang D, Aravind L. Identification of novel families and classification of the C2 domain superfamily elucidate the origin and evolution of membrane targeting activities in eukaryotes. الجين. 2010, 469(1-2):18-30.

Zhang D, Popesku JT, Martyniuk CJ, Xiong H, Duarte-Guterman P, Yao L, Xia X, Trudeau VL. Profiling neuroendocrine gene expression changes following fadrozole-induced estrogen decline in the female goldfish. Physiological Genomics. 2009, 38(3):351-361.

Zhang D, Xiong H, Mennigen JA, Popesku JT, Marlatt VL, Martyniuk CJ, Crump K, Cossins AR, Xia X, Trudeau VL. Defining global neuroendocrine gene expression patterns associated with reproductive seasonality in fish. بلوس واحد. 2009, 4(6):e5816.

Xiong H, Zhang D, Martyniuk CJ, Trudeau VL, Xia X. Using generalized procrustes analysis (GPA) for normalization of cDNA microarray data. BMC Bioinformatics. 2008, 9:25.

Zhang D, Xiong H, Shan J, Xia X, Trudeau VL. Functional insight into Maelstrom in the germline piRNA pathway: A unique domain homologous to the DnaQ-H 3'-5' exonuclease, its lineage-specific expansion/loss and evolutionarily active site switch. Biology Direct. 2008, 3:48.


مقدمة

Cancer has a significant impact on public health worldwide. One strategy to lower its burden is through cancer screening and early diagnosis. It is well known that patients have a higher cure rate and 5-year survival if diagnosed at early stages [1]. Medical expense increases dramatically with the stage [2, 3]. Tissue biopsy is the most widely-used tool for cancer detection, staging, and prognosis, but sometimes tumor tissue can be difficult to obtain, especially in metastatic diseases like late-stage lung cancer. Moreover, it is unrealistic to use tissue biopsy for cancer screening and early diagnosis when the tumors have not formed yet. Currently, there are some screening methods proved to be useful for cancer prevention. For example, the mammogram is the best way to detect breast cancer Pap test is used for early detection of cervical cancer regular colorectal cancer screening and low-dose computed tomography are recommended to reducing mortality from colorectal cancer and lung cancer, respectively [4]. However, all of these screening methods have limited sensitivity and specificity and are only applicable to a unique cancer type. In order to perform large-scale cancer screening among healthy individuals in the future, a more general and cost-effective approach is needed. In recent years, many scientists and companies have cast their eyes on liquid biopsy [5,6,7,8]. Blood contains many types of biological materials like circulating cells, platelets, extracellular vesicles, mRNA, miRNA, protein, and cell-free DNA (cfDNA) [9]. From the blood of cancer patients, a portion of the cfDNA is released by tumor cells through apoptosis, necrosis, or active release [10], and this DNA is called circulating tumor DNA (ctDNA). The tumor-specific mutations in ctDNA sequence can act as a new type of cancer biomarker and help to identify cancer patients from a group of healthy individuals. Compared to traditional cancer diagnosis using tissue biopsy, liquid biopsy is more feasible and less invasive and is more comprehensive than tissue biopsy to evaluate tumor heterogeneity [11] because all tumor sites will release ctDNA into the blood. Facilitated by the rapid development of next-generation sequencing (NGS) technologies, nowadays, ctDNA sequencing can achieve much higher sensitivity than tissue biopsy and can be designed for different purposes [12].


Ethics declarations

تضارب المصالح

A.D.E is cofounder and advisor at GRO Biosciences, Inc, which is using computational protein design and synthetic biology to develop protein therapeutics. A.D.E has filed intellectual property disclosures that reference Compartmentalized Partner Replication: 6761ELL ‘Thermostable reverse transcriptase based on a thermostable DNA polymerase,’ US 15/410, 211, Japan 2018-538718 and EP 17741900.9, filed on 1/19/17 and 7151 ELL ‘A method for screening metabolites and their receptors’ PCT/US2018/037818, filed on 6/15/18.


شاهد الفيديو: تكنولوجيا الحمض النووي DNA (قد 2022).


تعليقات:

  1. Wynton

    أوصيك بالحضور إلى الموقع ، حيث يوجد الكثير من المعلومات حول هذا السؤال.

  2. Granville

    رائعة ، هذه رسالة ثمينة للغاية

  3. Hewett

    وأنا ممتن جدا لكم على هذه المعلومات. كان مفيدًا جدًا بالنسبة لي.

  4. Eurypylus

    أشاركها تمامًا وجهة نظرها. أعتقد أن هذه فكرة رائعة.

  5. Tadhg

    الأكورديون

  6. Nikozuru

    كل شيء واضح ودقيق. حسن الكتابة ، شكرا لك.



اكتب رسالة