معلومة

هل البورينز على الغشاء الداخلي أو الخارجي للميتوكوندريا؟

هل البورينز على الغشاء الداخلي أو الخارجي للميتوكوندريا؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد بحثت في مصادر متعددة وهم يقولون أشياء مختلفة.


هذا ليس مجال عملي ، لكن قاعدة بيانات تصنيف الناقل تبدو مصدرًا موثوقًا وتنص على ما يلي:

أفضل أفراد عائلة MPP هم خوارق القناة الانتقائية التي تعتمد على الجهد (VDAC) في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا.

من خلال البحث في بنك بيانات البروتين ، يمكن للمرء أن يجد بنية بلورية لقناة الأنيون التي تعتمد على الجهد البشري 1 وتشير الورقة المرتبطة أيضًا إلى أنها موجودة في غشاء الميتوكوندريا الخارجي ، لذلك يمكنك أن تتخيل أنهم يجب أن يعرفوا.


الفضاء بين الغشاء

ال الفضاء بين الغشاء هي المنطقة الواقعة بين الغشاء الداخلي والغشاء الخارجي للميتوكوندريا أو البلاستيدات الخضراء. وظيفتها الرئيسية هي الفسفرة النيوكليوتيدية. تسمح بروتينات القناة التي تسمى porins في الغشاء الخارجي بالحركة الحرة للأيونات والجزيئات الصغيرة في الفضاء بين الغشاء.

عندما تتحرك الإلكترونات أسفل البروتينات في سلسلة نقل الإلكترون ، تفقد الإلكترونات الطاقة لجلب أيونات H + من مصفوفة الميتوكوندريا إلى الفضاء بين الغشاء.

الفضاء بين الغشاء
ال الفضاء بين الغشاء (اختصار IMS) للميتوكوندريا هي المنطقة التي تقع بين الغشاء الخارجي والداخلي للميتوكوندريا. هذا هو المكان الذي يحدث فيه الفسفرة المؤكسدة [14].
مصفوفة الميتوكوندريا .

هي المسافة بين الغشاء الخارجي والغشاء الداخلي. يُعرف أيضًا باسم الفضاء المحيط بالميتوكوندريا.

- الفراغ بين الغشاء الخارجي والداخلي في الميتوكوندريا.
الليزوزوم - عضية مرتبطة بالغشاء توجد في الخلايا حقيقية النواة. تحتوي على أحماض وإنزيمات تعمل على تحلل الجزيئات غير المرغوب فيها.
المصفوفة - المساحة الموجودة داخل الغشاء الداخلي للميتوكوندريا.

الميتوكوندريا
C. الغشاء الداخلي للميتوكوندريا
D. مصفوفة الميتوكوندريا.

يتم وضع البلاستيدات الخضراء ذات الشكل الإهليلجي في غشاء مزدوج وتسمى المنطقة الواقعة بين الطبقتين اللتين تشكلان الغشاء بـ

. الطبقة الخارجية للغشاء المزدوج أكثر نفاذية من الطبقة الداخلية ، والتي تتميز بعدد من بروتينات نقل الغشاء المضمنة.

يُطلق على الجزء الداخلي من الغشاءين اسم المصفوفة ، وتسمى المساحة الموجودة بين الغشاءين

وتسمى الطيات الناتجة عن الغشاء الداخلي cristae. تحتوي الميتوكوندريا أيضًا على الحمض النووي الخاص بها والذي يشفر بعض الإنزيمات المستخدمة داخل الميتوكوندريا.

من مصفوفة الميتوكوندريا.
293
98 .

يتطور التدرج البروتوني بين

تتكون الميتوكوندريا من أغشية خارجية وداخلية ، و

(المسافة بين الأغشية) ، و cristae (غشاء الغشاء الداخلي) ، والمصفوفة (الفضاء داخل الغشاء الداخلي). يحتوي الغشاء الخارجي على عدة خزانات تشكل قنوات حيث يمكن لجزيئات معينة أن تنتشر بحرية.

الطاقة المنبعثة أثناء مرور الإلكترونات من حاملة إلى حاملة تنقل أيونات الهيدروجين (البروتونات) عبر الغشاء ، من مصفوفة الميتوكوندريا إلى

، وخلق تدرج تركيز البروتونات.

بعد تسمم السيانيد ، لم تعد سلسلة نقل الإلكترونات قادرة على ضخ الإلكترونات في

سيزداد ، وسيتوقف تخليق ATP.
ب
ج.

الميتوكوندريا الميتوكوندريا الغشاء الخارجي cristae الغشاء الداخلي

يتم تضمين مكونات الفسفرة المؤكسدة - سلسلة نقل الإلكترون و سينثيز ATP - داخل غشاء الميتوكوندريا الداخلي. تُضخ البروتونات (+) من المصفوفة إلى الفراغ المملوء بالسائل بين الغشاءين ، ويسمى أيضًا "

المسافة بين الأغشية الخارجية والداخلية تسمى

. يوجد داخل الغشاء الداخلي هياكل مسطحة تشبه الفطائر تسمى ثايلاكويدات. تشكل الثايلاكويدات أكوامًا تسمى جرانا.


وظائف الميتوكوندريا

الميتوكوندريا مسؤولة عن العديد من الأنشطة الرئيسية داخل الخلية:

  • إنه الموقع الرئيسي لتخليق ATP وبالتالي يطلق عليه قوة الخلية (الفسفرة التأكسدية). تشير الخلايا مثل خلايا العضلات والكبد إلى ارتفاع معدل استخدام ATP في هذه المناطق. في كرات الدم الحمراء الناضجة ، الميتوكوندريا غائبة من أجل خلق مساحة أكبر للهيموجلوبين لربط الأكسجين.
  • يحتوي الغشاء الداخلي للميتوكوندريا على بروتينات (جسيمات F0-F1) تشارك في نقل الإلكترون وتخليق ATP.

  • تلعب الميتوكوندريا دورًا حيويًا في امتصاص وإطلاق الكالسيوم الذي يحافظ على تركيز الكالسيوم في سيتوبلازم الخلايا.
  • تلعب الميتوكوندريا أيضًا دورًا أساسيًا جدًا في عملية موت الخلايا المبرمج في خلايا الثدييات. تنظم بروتينات عائلة BCL2 إطلاق السيتوكروم ج من الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا والذي يؤدي بمجرد وجوده في السيتوبلازم إلى تنشيط إشارات موت الخلايا المبرمج الأخرى ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلية.
  • في الأنسجة الدهنية ، تطلق الميتوكوندريا الحرارة عبر سلسلة نقل الإلكترون.

المركز الحيوي لجامعة فورتسبورغ ، فورتسبورغ ، ألمانيا

المركز الحيوي لجامعة فورتسبورغ ، فورتسبورغ ، ألمانيا

الملخص

يحتوي الغشاء الخارجي للميتوكوندريا على قناة مسؤولة عن مرور المستقلبات المحبة للماء عبر الغشاء. يسمى البروتين المكون للقناة المعروف للعديد من الكائنات الحية بورين الميتوكوندريا أو VDAC (قناة أنيون انتقائية تعتمد على الجهد) ، يبلغ طولها حوالي 280 من الأحماض الأمينية. تحتوي جينومات الكائنات حقيقية النواة على العديد من الأشكال الإسوية للبورين ذات الوظيفة غير المحددة جيدًا. لا يعتبر الهيكل الأساسي لبورينات الميتوكوندريا أو حقيقيات النوى مسعورًا بشكل خاص وتشير تنبؤات البنية الثانوية إلى أن أسطوانة-برميل النموذجية للهيكل الثانوي للبورنات البكتيرية تشكل أيضًا قناة الميتوكوندريا. ترتبط الكينازات المشاركة في استقلاب الميتوكوندريا مثل هيكسوكيناز أو جليسيروكيناز بالبورين وتلعب دورًا مهمًا في تكوين الحيز في الميتوكوندريا. إن بورينز الميتوكوندريا عبارة عن بوابات ذات جهد كهربائي وتتحول إلى محطات فرعية قابلة للنفاذ للأيونات بجهد أعلى من 20 إلى 30 مللي فولت. القناة المفتوحة لها تفضيل صغير للأنيون على الكاتيونات من نفس الحركة المائية. الحالات المغلقة هي الكاتيون الانتقائية وغير منفذة لـ ATP و ADP. يبدو أن بورينات الميتوكوندريا متورطة في موت الخلايا المبرمج وإطلاق السيتوكروم ج. توجد أدلة ناشئة على أن الغشاء السيتوبلازمي للخلايا حقيقية النواة يحتوي أيضًا على بورين من عائلة بورين حقيقية النواة مع دور في التمثيل الغذائي الخلوي لم يتم فهمه بعد.


ما هي الميتوكوندريا ، ولماذا هي مهمة؟

كل كائن حي يتكون من خلايا ، وهي اللبنات الأساسية للحياة. يوجد داخل هذه الخلايا سلسلة من الكائنات العضوية - كيانات تشبه المقصورة الفرعية تؤدي وظائف مختلفة ولكنها محددة. تتميز الخلايا المختلفة في جميع أنحاء الجسم بشكل ملحوظ بأشكال وأحجام مختلفة ، وبالتالي ، أغراض مختلفة. الخلايا المماثلة (تلك التي تقوم بنفس الوظيفة) تشكل أنسجة الجسم ، مثل العضلات أو الجلد أو أنسجة العظام. تشكل مجموعات من أنواع مختلفة من الخلايا الأعضاء في جسمك ، مثل القلب أو الكبد أو الرئتين. بشكل جماعي ، تعمل جميع الأعضاء معًا كنظام لإبقائك على قيد الحياة وبصحة جيدة (Science NetLinks).

ماذا يكون الميتوكوندريا؟

”القوة من الخلية " هذه هي الطريقة التي يفكر بها معظم الناس ويتذكرون الميتوكوندري على (جمع: ميتوكوندريا) من فصل علم الأحياء في المدرسة الثانوية. وهي عبارة عن عضويات تعمل كمصانع مجهرية ومعقدة للغاية ، حيث تنتج الطاقة وتتخلص من النفايات الضارة بالجسم. تعتبر الميتوكوندريا ضرورية لبقاء الخلية ، و ATP (الطاقة) التي تساعد ميتروكوندريا الخاصة بك على إنتاجها أمر حيوي لعمليات التمثيل الغذائي والحفاظ على صحتك.

هيكل الميتوكوندريا

تم تصميم الميتوكوندريا لزيادة إنتاجيتها. تحتوي على غشاءين - يعمل الغشاء الخارجي مثل الجلد ، والغشاء الداخلي يجعل من الممكن حدوث المزيد من التفاعلات. هذا يعني أن خلاياك يمكنها إنجاز المزيد من العمل. الغشاء الخارجي: هذه طبقة ثنائية الفسفوليبيد تشتمل على هياكل قائمة على البروتين تسمى بورينات ، والتي تمكن الجزيئات (الأيونات ، ATP ، ADP ، إلخ) من العبور.

الغشاء الداخلي: هذا الغشاء معقد للغاية وهو المكان الذي يتكون فيه معظم ATP. ويشمل جميع معقدات نظام نقل الإلكترون ومركب مركب ATP وبروتينات النقل. لا يحتوي الغشاء الداخلي على خزانات مثل الغشاء الخارجي ، لذلك فهو غير منفذ لمعظم الجزيئات.

كريستي: هذه هي طيات الغشاء الداخلي ، والتي تزيد من مساحة السطح والمساحة المتاحة لحدوث التفاعلات الكيميائية. هذا هو المكان الذي توجد فيه سلسلة نقل الإلكترون والإنزيمات. عدد cristae في الميتوكوندريا يرتبط بطلب الخلية المعينة لـ ATP. على سبيل المثال ، تحتوي خلايا عضلة القلب على ما يصل إلى ثلاث مرات من الكرستيات أكثر من الخلايا الأخرى بسبب الحاجة الأكبر إلى ATP (قاموس الأحياء).

مصفوفة: هذا هو الفضاء داخل الغشاء الداخلي حيث تحدث دورة حمض الستريك ، أو دورة كريبس. هذا جزء مهم من التنفس الخلوي وإنتاج ATP. يوجد هنا أيضًا الحمض النووي للميتوكوندريا.

كيف تعمل الميتوكوندريا القوية

توجد الميتوكوندريا في خلايا الحيوانات والبشر والنباتات والفطريات. بينما تشتهر y في المقام الأول بتحويل الطاقة من الغذاء إلى طاقة للعمليات البيولوجية ، فإن الميتوكوندريا تشارك بعمق في العديد من الأنشطة الأخرى التي تمكن الخلايا من العمل بكفاءة من أجل مساعدتك في الحفاظ على صحة جسمك. فيما يلي الأدوار الخمسة الرئيسية التي تلعبها الميتوكوندريا في الصحة الخلوية ، وما الذي يمكن أن يحدث عند اضطراب هذه الوظائف:

  1. إنتاج ATP تنتج الميتوكوندريا 90٪ من الطاقة التي يحتاجها الجسم ليعمل عن طريق تحويل الطاقة الكيميائية من العناصر الغذائية إلى ATP. أثناء التنفس الخلوي ، يتم إنتاج مادة كيميائية أخرى تسمى NADH ، والتي يتم استخدامها بعد ذلك بواسطة الإنزيمات لتوليد ATP في شكل روابط كيميائية. يعد إنتاج الـ ATP ضروريًا لمساعدة الجسم على العمل بشكل صحيح. بدون طاقة ، تعاني خلاياك وجسمك. يمكن أن يساهم الخلل الوظيفي الناتج عن نقص ATP في مجموعة متنوعة من المشكلات الصحية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: مرض الزهايمر ، ومرض باركنسون ، ومرض لو جيريج ، والسكري ، والسرطان ، وأنواع عديدة من أمراض الميتوكوندريا.
  2. توازن الكالسيوم & # 8212 هذا هو تدفق الكالسيوم داخل وخارج الميتوكوندريا في الخلية. هذه العملية جزء مهم من تنظيم التمثيل الغذائي وقتل الخلايا غير الصحية. عندما يتم اختراق توازن الكالسيوم في الميتوكوندريا ، يمكن أن تحدث حالات مرضية مختلفة ، اعتمادًا على نوع الخلية المعنية (NCBI).
  3. هجرة الخلايا يشير هذا إلى الحركة المنظمة للخلايا إلى مواقع محددة استجابة للإشارات الكيميائية. يمكن أن يساعد تنظيم هجرة الخلايا في إنهاء الخلايا غير الصحية وتسريع التئام الجروح على العكس من ذلك ، إذا لم تتم إدارة هذه العملية بشكل جيد ، فقد تكون هناك عواقب صحية خطيرة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: تكوين الورم وتكوين الحبوب ، وأمراض الأوعية الدموية ، والأورام تشكيل ورم خبيث. - هذا هو موت الخلايا المبرمج بشكل أساسي والذي يتضمن الحفاظ على صحة الجسم عن طريق القضاء على الخلايا القديمة والخلايا غير الضرورية والخلايا غير الصحية. بدون موت الخلايا المبرمج المناسب (إما قليل جدًا أو أكثر من اللازم) ، هناك خطر أكبر للإصابة بحالات صحية ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية ، والأضرار الدماغية ، واضطرابات المناعة الذاتية والعديد من أنواع السرطان (NCBI).
  4. المناعة الفطرية & # 8212 يشير هذا إلى آليات دفاع غير محددة - مثل الجلد والمواد الكيميائية في الدم والخلايا داخل جهاز المناعة التي تهاجم الخلايا الغريبة & # 8212 التي تأتي بشكل أساسي للإنقاذ فورًا أو في غضون ساعات من ظهور مستضد & # 8217s في هيئة . بالإضافة إلى تنظيم الإشارات المضادة للفيروسات ، تساهم الميتوكوندريا أيضًا في تنشيط المناعة الفطري بعد التلف الخلوي والإجهاد (NCBI).

للتلخيص ، ATP هي عملة الطاقة لخلاياك ، والميتوكوندريا الخاصة بك هي المصادر الأساسية لإنتاج المزيد منها للمساعدة في إبقائك على قيد الحياة وبصحة جيدة. هذه العضيات مسؤولة أيضًا عن مراقبة نمو الخلايا غير الصحية والقضاء عليها. إذا كان هناك أي نقص في الميتوكوندريا لديك ، فمن المرجح أن تواجه مشكلات صحية.


نتائج

التعبير عن VDAC بتنسيق بكتريا قولونية

للتحقق مما إذا كان ملف بكتريا قولونية يمكن لمركب Bam التعامل مع بروتين ميتوكوندريا β-برميل ، قمنا بدمج VDAC وراثيًا من ن. كراسا لتسلسل إشارة البورين البكتيري PhoE للسماح بالنقل عبر الغشاء الداخلي. بالإضافة إلى البروتين كامل الطول ، تم إنشاء نوعين مختلفين من VDAC في البداية للتحقق مما إذا كانت إشارة ، المطلوبة لتجميع بروتينات البرميل في الميتوكوندريا OM ، ضرورية أيضًا لتجميعها في البكتيرية OM. لا يؤثر حذف اثنين من بقايا الأحماض الأمينية من الطرف C على إشارة التي حددها Kutik et al. (2008) ويضع بقايا Phe عند الطرف C كما هو الحال في تسلسل توقيع OMP البكتيري (الشكل 1). يؤثر حذف خمس بقايا على إشارة β ويزيل بقايا Phe (الشكل 1). التركيبات التي تم إنشاؤها تحت سيطرة phoE المروج ، الذي يسمح بالتعبير عالي المستوى عندما تزرع الخلايا تحت P.أنا تحديد. نظرًا لوجودها على بلازميد متوسط ​​النسخ ، كان من المتوقع ظهور تعبير منخفض المستوى تحت Pأنا- شروط كاملة.

مقارنة بين إشارات التجميع البكتيرية والميتوكوندريا β-برميل-OMP والمحطات C لمتغيرات VDAC المستخدمة في هذه الدراسة. يتم استخدام رمز من حرف واحد للأحماض الأمينية. X ، أي حمض أميني φ ، بقايا مسعور π ، بقايا قطبية ن، 1–28 من المخلفات. إشارة للميتوكوندريا محاطة بخطوط سميكة.

مقارنة بين إشارات التجميع البكتيرية والميتوكوندريا β-برميل-OMP والمحطات C لمتغيرات VDAC المستخدمة في هذه الدراسة. يتم استخدام رمز من حرف واحد للأحماض الأمينية. X ، أي حمض أميني φ ، بقايا مسعور π ، بقايا قطبية ن، 1–28 من المخلفات. إشارة للميتوكوندريا محاطة بخطوط سميكة.

خلايا من النوع البري بكتريا قولونية نمت سلالة MC4100 تحتوي على البلازميدات ذات الصلة في P.أنا-مرق L- مكتمل ، ومحللات الخلية الكاملة تم تحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي. كشف الترميم المناعي للبقع أنه تم التعبير عن VDAC كامل الطول في ظل هذه الظروف (الشكل 2 أ). تم تأكيد خصوصية المصل المضاد VDAC من خلال عدم وجود إشارة في السلالة تحمل المتجه الفارغ (الشكل 2 أ). بعد تعطيل الموجات فوق الصوتية بكتريا قولونية الخلايا ، VDAC مجزأة مع الأغشية مثل الخنازير الداخلية OmpF و OmpC ، في حين تم استرداد العراف السيتوبلازمي SecB في المادة الطافية (الشكل 2 أ). لم يؤثر حذف اثنين من البقايا من الطرف C على مستويات البروتين ، ومثل البروتين كامل الطول ، تم استرداد هذا الشكل المتحور أيضًا في جزء الغشاء (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف البروتين الطافر الذي يفتقر إلى خمس بقايا طرفية C في ظل هذه الظروف ، ربما لأن هذا المتغير لم يتم تجميعه في OM وبالتالي تم تحلل البروتين. وبالمثل ، لم يتم اكتشاف VDAC عند التعبير عنه بدون تسلسل إشارة (الشكل 2 أ). للتحقق من التحلل البروتيني للبروتين الطافر الذي يفتقر إلى خمسة مخلفات طرفية C ، تم إدخال البلازميد الذي يشفر هذا البناء في سلالة JW0157 ، والتي تفتقر إلى البروتياز الرئيسي DegP ، وسلالة الوالدين متساوية المنشأ BW25113. لأنه تم اكتشاف البروتين الطافرة فقط في درجة متحولة (الشكل 2 ب) ، يبدو أنه ركيزة للبروتياز المحيط بالبلازما في سلالة من النوع البري.

VDAC الميتوكوندريا من نيوروسبورا كراسا مترجمة إلى OM في الإشريكية القولونية. (أ) تم عزل lysates كامل الخلية ومغلفات الخلية والكسور القابلة للذوبان (طاف) من خلايا MC4100 التي تحتوي على البلازميدات التي تشفر VDAC (الطول الكامل) ، المتغيرات المقطوعة الطرفية C التي تفتقر إلى خمسة (Δ5 C- مصطلح) أو اثنين (Δ2 C- مصطلح .) الأحماض الأمينية ، VDAC بدون تسلسل إشارة (إشارة) أو ناقل فارغ. تم تحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد VDAC ، بكتريا قولونية porins (OmpC / F) ، أو البروتين السيتوبلازمي SecB. (ب) خلايا كاملة من بكتريا قولونية سلالة BW25113 و درجة تم تحليل المشتق المتحور JW0157 ، وكلاهما يحتوي على بلازميدات ترميز إما VDAC كامل الطول أو VDAC متحولة تفتقر إلى خمسة مخلفات طرفية C ، بواسطة SDS-PAGE متبوعًا بنشاف غربي باستخدام مضادات موجهة ضد VDAC أو OmpA. (ج) تم فصل الأغشية الداخلية و OMs من خلايا MC4100 التي تعبر عن VDAC كامل الطول عن طريق الطرد المركزي المتدرج كثافة السكروز. تم تحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد VDAC أو بكتريا قولونية بورينز. تم تقييم نشاط NADH- أوكسيديز كعلامة غشاء داخلي. تم تطبيع الإشارات أو الأنشطة لكل بروتين في كل جزء إلى الكمية المكتشفة في جزء الذروة. (د) عزل الميتوكوندريا من ن. كراسا (يسار) وتعليق مغلفات الخلية من بكتريا قولونية سلالة MC4100 معربا ن. كراسا كان VDAC (على اليمين) إما تركًا سليمًا (إدخالًا) ، أو تم هضمه بالتركيزات المحددة من بروتيناز K (PK) ، أو مستخلصًا بـ 6 M من اليوريا وفصله إلى جزء قابل للاستخراج (طاف) وجزء مدمج في الغشاء (بيليه). تم إخضاع العينات لـ SDS-PAGE ، متبوعًا إما بالتلوين باستخدام Coomassie Brilliant Blue لاكتشاف بروتينات OmpC و OmpF و OmpA أو النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة ضد VDAC و Tom. Tom40 ، الميتوكوندريا OMP مع حلقة OmpA التي يمكن الوصول إليها بالبروتياز ، بكتريا قولونية OMP مع ملحق محيطي يمكن الوصول إليه بالبروتياز OmpC و OmpF ، OMPs المحمية بالبروتياز.

VDAC الميتوكوندريا من نيوروسبورا كراسا مترجمة إلى OM في الإشريكية القولونية. (أ) تم عزل lysates الخلية الكاملة ومغلفات الخلية والكسور القابلة للذوبان (طاف) من خلايا MC4100 التي تحتوي على البلازميدات التي تشفر VDAC (الطول الكامل) ، المتغيرات المقطوعة الطرفية C التي تفتقر إلى خمسة (Δ5 C- مصطلح) أو اثنين (Δ2 C- مصطلح .) الأحماض الأمينية ، VDAC بدون تسلسل إشارة (إشارة) أو ناقل فارغ. تم تحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد VDAC ، بكتريا قولونية porins (OmpC / F) ، أو البروتين السيتوبلازمي SecB. (ب) خلايا كاملة من بكتريا قولونية سلالة BW25113 و درجة تم تحليل المشتق المتحور JW0157 ، وكلاهما يحتوي على بلازميدات ترميز إما VDAC كامل الطول أو VDAC متحولة تفتقر إلى خمسة مخلفات طرفية C ، بواسطة SDS-PAGE متبوعًا بنشاف غربي باستخدام مضادات موجهة ضد VDAC أو OmpA. (ج) تم فصل الأغشية الداخلية و OMs من خلايا MC4100 التي تعبر عن VDAC كامل الطول عن طريق الطرد المركزي المتدرج كثافة السكروز. تم تحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد VDAC أو بكتريا قولونية بورينز. تم تقييم نشاط NADH- أوكسيديز كعلامة غشاء داخلي. تم تطبيع الإشارات أو الأنشطة لكل بروتين في كل جزء إلى الكمية المكتشفة في جزء الذروة. (د) عزل الميتوكوندريا من ن. كراسا (يسار) وتعليق مغلفات الخلية من بكتريا قولونية سلالة MC4100 معربا ن. كراسا كان VDAC (على اليمين) إما تركًا سليمًا (إدخالًا) ، أو تم هضمه بالتركيزات المحددة من بروتيناز K (PK) ، أو مستخلصًا بـ 6 M من اليوريا وفصله إلى جزء قابل للاستخراج (طاف) وجزء مدمج في الغشاء (بيليه). تم إخضاع العينات لـ SDS-PAGE ، متبوعًا إما بالتلوين باستخدام Coomassie Brilliant Blue لاكتشاف بروتينات OmpC و OmpF و OmpA أو النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة ضد VDAC و Tom. Tom40 ، الميتوكوندريا OMP مع حلقة OmpA التي يمكن الوصول إليها بالبروتياز ، بكتريا قولونية OMP مع ملحق محيطي يمكن الوصول إليه بالبروتياز OmpC و OmpF ، OMPs المحمية بالبروتياز.

تجميع VDAC في البكتيرية OM

كنا نرغب في تحديد أي غشاء يقع VDAC. لفصل الأغشية الداخلية و OMs ، قمنا بتطبيق أجهزة طرد مركزي متدرجة كثافة السكروز. تم تجزئة VDAC باستخدام بروتينات OM OmpF و OmpC وليس باستخدام علامة الغشاء الداخلي NADH-oxidase (الشكل 2C). بعد ذلك ، قمنا بمراقبة تكامل VDAC في OM في تجارب هضم البروتياز. في بيئتها الأصلية ، الميتوكوندريا OM ، البروتين مقاوم للبروتيناز K ، بينما Tom40 ، الذي يحتوي على حلقة كبيرة معرضة لسطح الميتوكوندريا ، يتحلل (الشكل 2D). أيضًا في البكتيرية OM ، كان VDAC مقاومًا إلى حد كبير للبروتين K ، مثل الخزانات الداخلية OmpC و OmpF وعلى عكس OmpA ، الذي يحتوي على مجال كبير مكشوف من البلازما وقد تم تدهوره في ظل هذه الظروف (الشكل 2D). علاوة على ذلك ، على غرار البورنات البكتيرية ، لا يمكن استخراج VDAC من الأغشية البكتيرية مع اليوريا (الشكل 2D) ، مما يؤكد أنه تم إدخاله بشكل متكامل في OM.

إذا تم تجميع VDAC بالفعل في البكتيرية OM ، فقد يمكن اكتشافها على سطح الخلية البكتيرية بأجسام مضادة محددة. كان تعبير الخلفية منخفض المستوى في خلايا MC4100 غير المستحثة غير كافٍ للكشف عن VDAC عن طريق الفحص المجهري المناعي. لزيادة مستويات التعبير ، تم إدخال ترميز البلازميد VDAC بكتريا قولونية سلالة CE1224 ، والتي لا تنتج خزانات داخلية. تنمو الخلايا المحولة تحت Pأنا أدى التقييد إلى زيادة إنتاج VDAC بشكل كبير ، حتى لدرجة أنه تم اكتشاف جزء صغير من البروتينات الأولية غير المعالجة (الشكل 3 أ). باستخدام الفحص المجهري المناعي ، تم الكشف عن البروتين على سطح الخلية البكتيرية ، كما كان على سطح الميتوكوندريا المعزولة (الشكل 3 ب). تم تأكيد خصوصية الإشارة التي تمت ملاحظتها من خلال عدم وجودها في البكتيريا الحاملة للناقل الفارغ. أيضًا ، تم اكتشاف البروتين الطافر الذي يفتقر إلى اثنين من بقايا الأحماض الأمينية C- الطرفية على سطح الخلية البكتيرية ، ولكن ليس البروتين الذي يفتقر إلى خمسة أحماض أمينية (الشكل 3 ب) ، على الرغم من أنه تم إنتاجه بكثرة في ظل هذه الظروف (الشكل 3 ج). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن VDAC يتجمع في OM البكتيرية وأن هذا التجميع يعتمد على إشارة β.

الكشف عن VDAC على سطح الخلية البكتيرية باستخدام الفحص المجهري المناعي. (أ) مستويات الحالة الثابتة لـ VDAC كامل الطول في مختلف الإشريكية القولونية السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. الإشريكية القولونية سلالة CE1224 نمت تحت P.أنا الحرمان ، في حين نمت السلالات CE1265 و MC4100 بشكل كبير في L-broth. تحتوي جميع السلالات على بلازميد pJPNcPor1 يشفر VDAC كامل الطول تحت سيطرة phoE المروجين. تم حصاد كميات متساوية من الخلايا. تم عزل مظاريف الخلايا وتخفيفها بشكل متسلسل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام مصل مضاد ضد VDAC. لوحظ تراكم السلائف غير المعالجة (P) التي تحتوي على تسلسل الإشارة في خلايا CE1224 المستحثة بالكامل. (ب) الميتوكوندريا المعزولة من نيوروسبورا كراسا أو بكتريا قولونية خلايا CE1224 تعبر عن متغيرات VDAC كاملة الطول أو C مقطوعة نهائيًا ، أو تحمل ناقلًا فارغًا ، نمت بين عشية وضحاها تحت Pأنا الحرمان ، تم إصلاحه وتحصينه بالمناعة بمضاد ضد VDAC متبوعًا بجسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور. تم الحصول على الصور في قنوات الفلورة (FL) أو المجال الساطع (BF). (ج) مقارنة بين مستويات التعبير لـ VDAC كامل الطول والبروتين الطافرة التي تفتقر إلى خمسة مخلفات طرفية C (Δ5 C-term.) في سلالة CE1224 نمت تحت Pأنا تحديد. تم حصاد كميات متساوية من الخلايا وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام مضاد ضد VDAC. P ، السلائف و M ، شكل ناضج.

الكشف عن VDAC على سطح الخلية البكتيرية باستخدام الفحص المجهري المناعي. (أ) مستويات الحالة الثابتة لـ VDAC كامل الطول في مختلف الإشريكية القولونية السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. الإشريكية القولونية سلالة CE1224 نمت تحت P.أنا الحرمان ، في حين نمت السلالات CE1265 و MC4100 بشكل كبير في L-broth. تحتوي جميع السلالات على بلازميد pJPNcPor1 يشفر VDAC كامل الطول تحت سيطرة phoE المروجين. تم حصاد كميات متساوية من الخلايا. تم عزل مظاريف الخلايا وتخفيفها بشكل متسلسل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام مصل مضاد ضد VDAC. لوحظ تراكم السلائف غير المعالجة (P) التي تحتوي على تسلسل الإشارة في خلايا CE1224 المستحثة بالكامل. (ب) الميتوكوندريا المعزولة من نيوروسبورا كراسا أو بكتريا قولونية خلايا CE1224 تعبر عن متغيرات VDAC كاملة الطول أو C مقطوعة نهائيًا ، أو تحمل ناقلًا فارغًا ، نمت بين عشية وضحاها تحت Pأنا الحرمان ، تم إصلاحه وتحصينه بالمناعة بمضاد ضد VDAC متبوعًا بجسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور. تم الحصول على الصور في قنوات الفلورة (FL) أو المجال الساطع (BF). (ج) مقارنة بين مستويات التعبير لـ VDAC كامل الطول والبروتين الطافرة التي تفتقر إلى خمسة مخلفات طرفية C (Δ5 C-term.) في سلالة CE1224 نمت تحت Pأنا تحديد. تم حصاد كميات متساوية من الخلايا وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام مضاد ضد VDAC. P ، السلائف و M ، شكل ناضج.

تشكيل المسام بواسطة VDAC في بكتريا قولونية OM

VDAC هو المسار الرئيسي الذي تعبر به المستقلبات غشاء الميتوكوندريا الخارجي. وبالتالي ، إذا تم تجميع VDAC بشكل صحيح في البكتيرية OM ، فيجب أن تشكل مسامًا كبيرة. لاختبار هذا الاحتمال ، تم إدخال ترميز البلازميد VDAC في بكتريا قولونية سلالة CE1265 ، والتي لا تنتج بورينات داخلية. بسبب طفرة في الجين التنظيمي phoR، هذه السلالة تعبر عن فو Regulon بشكل تأسيسي ولكن ليس بنفس القدر مثل سلالة مستحثة بالكامل مثل CE1224 (شكل 3 أ). تم تحديد تكوين المسام في OM في اختبار حساسية المضادات الحيوية حيث تكون منطقة تثبيط النمو حول قرص يحتوي على المضاد الحيوي الذي تم اختباره بمثابة مقياس لانتشار المضاد الحيوي عبر المسام. عندما أنتجت البكتيريا VDAC ، كانت أكثر حساسية لجميع المضادات الحيوية التي تم اختبارها (الجدول 1) ، مما يشير إلى أن VDAC يشكل مسامًا في البكتيريا OM. لإثبات هذا الاستنتاج ، تم قياس انقسام nitrocefin بواسطة β-lactamase في الخلايا السليمة ، وهي عملية يكون فيها تغلغل هذا المضاد الحيوي chromogenic من خلال OM محدودًا للمعدل. نتج عن تخليق VDAC زيادة كبيرة في معدل انقسام النيتروسفين في الخلايا السليمة (الشكل 4 أ) بما يتفق مع تكوين المسام المائية في OM. في كلا الاختبارين ، التعبير عن phoE من نفس المتجه أدى إلى زيادة معتدلة في امتصاص المضادات الحيوية (الجدول 1 والشكل 4 أ) بما يتفق مع ملاحظة أن VDAC له حجم مسام أكبر بكثير من حجم المسام. بكتريا قولونية بورينز (فريتاج وآخرون ، 1982). بشكل جماعي ، على غرار دوره في الميتوكوندريا ، فإن دمج VDAC في البكتيريا OM يعزز تدفق المواد المذابة عبر هذا الغشاء.

التعبير عن VDAC بتنسيق الإشريكية القولونية تزيد الخلايا من قابليتها للتأثر بالمضادات الحيوية.

بلازميد منطقة تثبيط النمو (مم)
ايري (25) امب (5) تيت (2) ريف (0.3) في ان سي (5) سيف (5)
المتجه 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
بلازميد منطقة تثبيط النمو (مم)
ايري (25) امب (5) تيت (2) ريف (0.3) في ان سي (5) سيف (5)
المتجه 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

N OTE. - بورين أقل بكتريا قولونية تم تحويل السلالة CE1265 باستخدام ناقل فارغ ، أو ترميز بلازميد PhoE ، أو ترميز بلازميد VDAC. تم تقييم حساسية الخلايا المحولة للمضادات الحيوية على الصفائح عن طريق قياس منطقة تثبيط النمو حول أقراص المرشح المشبعة بالمضادات الحيوية بالتركيز الموضح بين الأقواس (مجم / مل). يتم عرض القيم المتوسطة لمنطقة تثبيط النمو (بالملليمتر من حافة أقراص المرشح) من ثلاث تجارب. إري ، إريثروميسين أمب ، أمبيسيلين تيت ، تتراسيكلين ريف ، ريفاميسين إنك ، فانكومايسين وسيف ، سيفالوريدين.

التعبير عن VDAC بتنسيق الإشريكية القولونية تزيد الخلايا من قابليتها للتأثر بالمضادات الحيوية.

بلازميد منطقة تثبيط النمو (مم)
ايري (25) امب (5) تيت (2) ريف (0.3) في ان سي (5) سيف (5)
المتجه 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3
بلازميد منطقة تثبيط النمو (مم)
ايري (25) امب (5) تيت (2) ريف (0.3) في ان سي (5) سيف (5)
المتجه 4.0 4.3 3.7 1.0 1.7 2.0
PhoE 6.0 5.7 6.3 2.3 1.0 4.0
VDAC 15.7 16.7 10.7 14.0 12.3 6.3

N OTE. - بورين أقل بكتريا قولونية تم تحويل السلالة CE1265 باستخدام ناقل فارغ ، أو ترميز بلازميد PhoE ، أو ترميز بلازميد VDAC. تم تقييم حساسية الخلايا المحولة للمضادات الحيوية على الصفائح عن طريق قياس منطقة تثبيط النمو حول أقراص المرشح المشبعة بالمضادات الحيوية بالتركيز الموضح بين الأقواس (مجم / مل). يتم عرض القيم المتوسطة لمنطقة تثبيط النمو (بالملليمتر من حافة أقراص المرشح) من ثلاث تجارب. إري ، إريثروميسين أمب ، أمبيسيلين تيت ، تتراسيكلين ريف ، ريفاميسين إنك ، فانكومايسين وسيف ، سيفالوريدين.

يشكل VDAC مسامًا في البكتيريا OM. (أ) تم استخدام خلايا من سلالة CE1265 تحتوي على ترميز pBR322 β-lactamase. تم تحويل الخلايا بالإضافة إلى ذلك باستخدام ناقل فارغ أو ترميز بلازميد إما PhoE أو متغيرات VDAC المشار إليها واحتضانها باستخدام nitrocefin. تم تحديد دوران الركيزة عن طريق القياس الطيفي. (ب) تم تحليل محللات الخلية الكاملة من الخلايا المستخدمة في تجارب امتصاص النيتروتسافين بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات المشار إليها.

يشكل VDAC مسامًا في البكتيريا OM. (أ) تم استخدام خلايا من سلالة CE1265 تحتوي على ترميز pBR322 β-lactamase. تم تحويل الخلايا بالإضافة إلى ذلك باستخدام ناقل فارغ أو ترميز بلازميد إما PhoE أو متغيرات VDAC المشار إليها واحتضانها باستخدام nitrocefin. تم تحديد دوران الركيزة عن طريق القياس الطيفي. (ب) تم تحليل محلول الخلية الكاملة من الخلايا المستخدمة في تجارب امتصاص النيتروتسافين بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات المشار إليها.

الجمعية VDAC في بكتريا قولونية OM تعتمد على إشارة β

في اختبار امتصاص النيترويسفين ، أدى التعبير عن VDAC المتحولة الذي يفتقر إلى بقايا من الطرف C إلى انقسام المضاد الحيوي بكفاءات مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها عند التعبير عن البروتين كامل الطول (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أن هذه الطفرة لا تؤثر على التجمع وتشكيل المسام. على النقيض من ذلك ، كان انقسام النيترويسفين أقل بكثير من خلال التعبير عن المتغير الذي يفتقر إلى خمسة بقايا (الشكل 4 أ). يمكن اكتشاف المتغير الأخير في السلالة التكوينية CE1265 على الرغم من أنه أقل بوضوح من البروتين كامل الطول (الشكل 4 ب). يتحلل البروتين إلى حد كبير عندما تمت معالجة جزء غلاف الخلية من هذه الخلايا بالبروتيناز K ويمكن استخلاصه من هذه الأغشية باستخدام اليوريا ، في حين أن البروتين كامل الطول المنتج في هذه السلالة كان مقاومًا للبروتياز ولا يمكن استخلاصه من الأغشية باليوريا (الشكل 5 أ). وبالتالي ، يبدو أن جزءًا كبيرًا من البروتين المتحور المكتشف لم يتم إدخاله في OM ، هذه البولي ببتيدات تتجزأ فقط مع الأغشية ، على الأرجح لأنها تشكل مجاميع كثيفة يتم تكويرها بالأغشية أثناء إجراء الطرد المركزي (Tommassen 1986). ومع ذلك ، فإن جزءًا صغيرًا من البولي ببتيدات كان مقاومًا للبروتيناز K ولم يتم استخلاصه مع اليوريا (الشكل 5 أ) ، من المرجح أن يتم تجميع هذه البولي ببتيدات بشكل صحيح في OM البكتيرية لأنها سهلت تحلل النيترويسفين في الخلايا السليمة إلى حد ما (الشكل 4 أ) ) بما يتفق مع تكوين المسام الوظيفية.

تجميع VDAC في ملف الإشريكية القولونية تعتمد OM على إشارة سليمة. (أ) لم يتم دمج غالبية جزيئات VDAC التي تفتقر إلى المخلفات الطرفية الخمسة C بشكل صحيح في OM. مغلفات الخلية من بكتريا قولونية تم معالجة السلالة CE1265 التي تعبر إما عن VDAC كامل الطول (الجزء العلوي) أو VDAC المتحولة (الجزء السفلي) باستخدام بروتيناز K (PK) أو استخلاصها مع اليوريا كما هو موضح في وسيلة الإيضاح للشكل 2D وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وإما تلطيخ باستخدام Coomassie Brilliant Blue لتصور OmpA أو النشاف الغربي لاكتشاف متغير VDAC. (ب) مغلفات الخلية من بكتريا قولونية تم استخلاص السلالة MC4100 التي تعبر إما عن VDAC كامل الطول أو البروتين الطافر الذي يفتقر إلى أربعة مخلفات طرفية C مع اليوريا كما هو موصوف في وسيلة الإيضاح للشكل 2D وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي باستخدام مضاد ضد VDAC.

تجميع VDAC في ملف الإشريكية القولونية تعتمد OM على إشارة β سليمة. (أ) لم يتم دمج غالبية جزيئات VDAC التي تفتقر إلى المخلفات الطرفية الخمسة C بشكل صحيح في OM. مغلفات الخلية من بكتريا قولونية تم معالجة السلالة CE1265 التي تعبر إما عن VDAC كامل الطول (الجزء العلوي) أو VDAC المتحولة (الجزء السفلي) باستخدام بروتيناز K (PK) أو استخلاصها مع اليوريا كما هو موضح في وسيلة الإيضاح للشكل 2D وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وإما تلطيخ with Coomassie Brilliant Blue to visualize OmpA or western blotting to detect the VDAC variant. (ب) Cell envelopes of بكتريا قولونية strain MC4100 expressing either full-length VDAC or the mutant protein lacking four C-terminal residues were extracted with urea as described in the legend to figure 2D and analyzed by SDS-PAGE and western blotting using antiserum against VDAC.

The results presented so far indicated that the mutant protein lacking five C-terminal residues is only very inefficiently incorporated into the بكتريا قولونية OM, whereas the mutant protein lacking two residues, which still retains an intact β-signal and presents a Phe residue at the C terminus, is assembled as efficiently as is the wild-type VDAC. To investigate whether the presence of a C-terminal Phe could compensate for the disruption of the β-signal, an additional mutant was constructed, which lacks four amino acid residues from the C terminus where it presents a Phe ( fig. 1). In contrast to the mutant protein lacking five C-terminal residues ( fig. 2A), the protein lacking four residues was detected when the construct was expressed in the wild-type بكتريا قولونية أضنى. However, when the membrane fraction of this strain was extracted with urea, the mutant protein was partially solubilized, whereas the wild-type protein was insoluble as before ( fig 5B). Therefore, in spite of the presence of a Phe at the C terminus, the mutant protein lacking four C-terminal residues is inefficiently assembled into the بكتريا قولونية OM. Together, our results are consistent with the notion that an intact β-signal is needed for efficient insertion of VDAC into the bacterial OM but is not absolutely essential for this process.

VDAC Assembly Is Dependent on BamA

To determine whether assembly of VDAC into the OM of بكتريا قولونية depends on the Bam complex, we made use of a temperature-sensitive (ts) bamA mutant strain ( Doerrler and Raetz 2005). This strain fails to grow at 44 °C, but even at a permissive temperature, it shows an assembly defect of OMPs as evidenced by decreased levels of these proteins. These reduced levels probably result from degradation of misassembled OMPs by periplasmic proteases, such as DegP. The plasmid encoding VDAC was introduced into this mutant strain and into an isogenic strain carrying a wild-type bamA gene, and the bacteria were grown at 32 °C under Pأنا-limiting conditions to induce VDAC synthesis. ال bamA(ts) mutation did not affect growth under these conditions ( fig. 6A). Like the amounts of correctly assembled endogenous porins and OmpA, the amount of membrane-inserted VDAC was drastically reduced in the bamA(ts) mutant strain ( fig. 6B). In contrast, levels of the periplasmic enzyme alkaline phosphatase (PhoA), the inner–membrane-located enzyme leader peptidase, and the cytoplasmic chaperone SecB in the cell lysates were unaffected ( fig. 6B). Thus, BamA is required for the efficient assembly of VDAC into the bacterial OM.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in الإشريكية القولونية. (أ) الإشريكية القولونية cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in Pأنا-poor medium (LPأنا) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPأنا) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (ب) Pأنا-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPأنا or HPأنا were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and بكتريا قولونية OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon Pأنا limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.

BamA is required for membrane insertion of VDAC in الإشريكية القولونية. (أ) الإشريكية القولونية cells containing either a ts allele or wild-type bamA were grown overnight in L-broth at 30 °C. Cells were resuspended at time 0 in Pأنا-poor medium (LPأنا) or the same medium supplemented with 660 μM K2HPO4 (HPأنا) and growth at 32 °C was determined by measuring the optical density at 660 nm. (ب) Pأنا-starved cells containing either the ts bamA allele or the wild-type allele grown in LPأنا or HPأنا were harvested after 6 h (arrow in panel A). Cell envelopes were isolated and extracted with 6 M urea to determine the amount of membrane-inserted VDAC and بكتريا قولونية OMPs. Whole-cell lysates were analyzed to determine the effect of the bamA ts mutation on other proteins. Samples were analyzed by SDS-PAGE, followed either by staining with Coomassie Brilliant Blue to visualize PhoE, OmpC, OmpF, and OmpA or by western blotting using antisera against the following controls: PhoA, periplasmic alkaline phosphatase, which is expressed upon Pأنا limitation leader peptidase, an inner-membrane protein SecB, a cytoplasmic protein.


Mitochondria are double-membrane and rods shaped organelles found in the cells of both animals and plants and are responsible for various metabolic functions within the cells. Mitochondria play a vital role in providing the necessary biological energy for the cell through enzymatic oxidation of the substrates of the Krebs&rsquos cycle. The mitochondrion is made up of the outer membrane, inner membrane, intermembrane space, and matrix.

The outer membrane consists of the same amounts of proteins and phospholipids as well as a large number of porins which are specialized proteins. The outer membrane is permeable to ions, nutrients, and energy molecules such as ADP and ATP (Abdrakhimova et al, 2011). The inner membrane of the mitochondrion is complex and consists of a number of folds known as the cristae which are important since it increases the surface area within the organelle. The increased surface area within the organelle coupled with the presence of various proteins within the inner membrane is crucial in aiding various enzymatic reactions including the production of ATP.

However, unlike the outer membrane, the inner membrane is strictly permeable to ATP, Oxygen, and the movement of metabolites across the membrane (Jones, 2013). The space between the outer and the inner membranes is referred to as the intermembrane space and its composition is similar to that of the cytoplasm. The matrix which is the fourth component of the mitochondrion is made up of a complex mixture of enzymes and proteins which are important in the synthesis of the ribosome, ATP, mitochondrial DNA, and tRNAs (Miles et al, 2014).

Succinate dehydrogenase is one of the enzyme complex bound to the inner membrane of the mitochondrion. Succinate dehydrogenase plays a vital role in Krebs&rsquos cycle since it catalyzes the oxidation of Succinate to fumarate within the inner membrane (Gorbacheva et al, 2013).


How do proteins enter mitochondria?

If the inner membrane is so impermeable, how do proteins enter?

The outer membrane of the mitochondria contains the protein "porin". This forms an aqueous channel through which proteins up to 10,000 daltons can pass and go into the intermembrane space. Indeed, the small molecules actually equilibrate between the outer membrane and the cytosol. However, most proteins cannot get into the matrix unless they pass through the inner membrane. This membrane contains cardiolipin which renders it virtually impermeable. This requires transport mechanisms across the membrane that are more organized and regulated. A very simple view of the process is diagrammed in this cartoon.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

Transport across the mitochondrial membranes requires the concerted action of a number of translocation machineries. The machinery in the outer membrane is called the Tom complex (تيranslocator اuter membrane) and that for the inner membrane is called the Tim complex (تيranslocator أناnner مembrane). Proteins that have to go all the way to the matrix have an NH2 cleavable signal sequence (see the above cartoon).

Most proteins must be uncoiled or stretched out to go through the translocators. This involves ATP binding and is monitored and stabilized by a chaperone proteins, including hsp70. Thus, before the protein can go through Tom complex, it must become "translocation competent".

Transport through the outer membrane: characteristics of Tom complex.

Not surprisingly, the TOM complex will include import receptors that initially recognize the signal peptide or a signal sequence (these include Tom20, Tom22, and Tom70). Different proteins use different receptors. In the above cartoon, the receptor is represented as a blue oval in which the signal peptide is inserted. The receptors then bring the protein to the region containing the translocator proteins. This is actually a complex of proteins.
It is called the General Import Pore (GIP) and it facilitates the translocation of the presequence of the protein across the outer membrane. (the GIP is made of Tom40, Tom5, Tom 6, and Tom7). Tom40 appears to be the core element of the pore and forms oligomers. It traverses the membrane as a series of 14 anti-parallel beta strands which form a beta barrel. It also interacts with polypeptide chains passing through the pore. All of the other Tom components in GIP are anchored to the outer membrane by helical transmembrane segments (hydrophobic anchors).

Recent study of Tom40: Rapaport, D and Neupert W, Biogenesis of Tom40, Core Component of the TOM complex of mitochondria. J Cell Biol 146 321-332, 1999. Study looked at how Tom40 entered outer membrane and became a part of the GIP. The study reported that:

  • First, as with many mitochondrial proteins, Tom40 requires cytosolic chaperones to prepare it for entry. In the case of this protein, becoming "translocation competent" requires ATP and a partially folded state (the latter is mediated by the cytosolic chaperone (hsp70).
  • Second, when it is "competent", it interacts with the surface receptor, Tom20. There is no cleavable signal peptide however, the experiments showing the requirement for partial folding suggests targeting information is found in discontinuous sites brought together in the folded domain.
  • Final insertion is into preexisting Tom complexes. This requires an intact N terminus.
  • Dimerization occurs after entry into the membrane.

Characteristics of Tim Complexes

Mitochondrial proteins destined for the matrix often have a cleavable signal peptide on the protein which must be recognized before it will be admitted through the mitochondrial translocator. These proteins with "amino terminal signals" (your text), or "preproteins" or "presequences" (current literature) usually interact with Tom20 first. Then, they have to get through the outer membrane. To do that, they are transferred to the GIP complex: First, they interact with Tom22 and Tom5 which ushers them to the pore formed by Tom40. They then enter the matrix using the pore complex made of Tim23 and Tim17 which are in the inner membrane. Also, very important, their entry is dependent on membrane potential. This is set up by the electron transport complexes. Recall that hydrogen ions are being pumped into the intermembrane space creating a charge gradient that is more negative on the matrix site. This membrane potential actually helps pulls the protein into the Tim23-Tim17 channels. The protein then enters the matrix where the cleavable preprotein is clipped off by a protease, MPP. mt- hsp 70 in the matrix works with Tim44 to complete the full transfer to the matrix. mthsp70 and Tim 44 actually "pull" the protein into the matrix by a process that requires ATP. It also requires the membrane potential set up by the electron transport chain.

Some mitochondrial proteins destined for the inner membrane have a cleavable presequence followed by one or more hydrophobic membrane-spanning segments that function as stop-transfer sequences in the IM or, serve to insert the polypeptide into the IM after it gets in the matrix. These are like the Type I membrane proteins described in the unit on the rough endoplasmic reticulum.

However, other proteins do not have a cleavable targeting signal (Types II and III). Mitochondrial proteins that have an internal signal sequence (examples include a number of proteins in the inner membrane) generally interact with Tom70 as the receptor. Then, after they transit the outer membrane via the GIP complex, they enter the special Tim pathway. This may involve interactions with small Tim's of the intermembrane space and Tim22-Tim54 of the inner membrane itself.

Those proteins that do not have a cleavable targeting signal sequence often have signals with the following characteristics: They are often a stretch of positively charged amino acids (sometimes adjacent to a membrane spanning hydrophobic region). Sometimes these form loops that face the matrix. Recall the "positive inside rule" has positively charged amino acids concentrated at the cytosolic side for proteins being inserted into the rough endoplasmic reticulum. These mitochondrial proteins tend to follow this rule, only the matrix becomes the site where the positive charges are most numerous.

Examples from the literature:

Davis, AJ, Ryan, KR, and Jensen, RE Tim23p contains separate and distinct signals for targeting to mitochondria and insertion in to the inner membrane. Molecular Biology of the Cell 9: 2577-2593 (1999).

  • Tim23 is one of the inner membrane translocator proteins. It does not have an amino-terminal presequence. Targeting information is found within the mature protein.
  • Tim23 has 4 transmembrane segments and two positively charged loops facing the matrix. What is needed for signalling an import?
  • Replaced positively charged amino acids in one or both loops with alanine residues.
  • At least one of these loops is required for insertion into the inner membrane.
  • The signal for targeting to mitochondria is found in at least two of the hydrophobic transmembrane segments.

Kurz, M, Martin, H, Rassow J, Pfanner, N, and Ryan, MT. Biogenesis of Tim proteins of the mitochondrial carrier import pathway: differential targeting mechanisms and crossing over with the main import pathway. Molecular Biology of the Cell 10: 2461-2474 (1999). Compared the route and binding of three Tim proteins

  • Tim54 carries a amino terminal, noncleaved translocation sequence that is positively charged. However, it prefers to use Tom70 as its receptor instead of Tom20. After moving through the GIP, it uses its positively charged amino terminal sequence to enter the matrix. It required chaperones and ATP to get to the matrix.
  • Tim22 is a hydrophobic protein that uses Tom20 for targeting to the OM. Then it follows the Tim route for carrier proteins, like Tim23. It does not require hsp70 or ATP for entry.
  • Small Tims are normally found in the intermembrane space and are not membrane proteins. They used Tom20 for their receptor and transfer to the GIP complex. However, when Tom20 was destroyed by trypsin, leaving only Tom5, the small Tims were able to enter.

The above cartoon from your text shows more ways that proteins can be inserted into inner and outer membranes, once they are recognized by the receptors. As shown by proteins in the literature examples above, the mitochondria uses both positively charged signals as well as membrane spanning hydrophobic sequences to translocate and then reach their final destination. As in the above examples, there can be multiple signal and insertion sites. However, the distribution of the charged amino acids helps orient the protein so that the positive charges are in the matrix. This is how the cytochromes in the respiratory chain or the elementary particles are inserted by mitochondrial actions.

This figure is taken from Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, N.Y. 1994, Third Edition

The following figure is from another text by Lodish et al, Molecular Cell Biology. It shows the entire sequence of events required to take a protein into the matrix.

  • Step 1: Protein unfolds as it binds to hsp70 chaperone. Red positive area indicates targeting sequence. Chaperone binding is ATP dependent.
  • Step 2: Targeting sequence binds to receptor (usually Tom20)
  • Step 3. Receptor ushers protein to site of translocator. Other Tom proteins involved, but Tom40 is the core of the translocator channel.
  • Step 4: Protein is translocated stimulated by the membrane potential. Electron transport complexes on inner membrane have pumped H+ across to the intermembrane space, leaving the matrix more negative. This attracts the protein (the signal is positively charged). Protein moves through Tim translocators. Tim 44 and hsp70 in the matrix continue to guide and pull the protein through the pore. An ATP requiring process.
  • Step 5. another chaperone (called a chaperonin), hsp60 causes the folding of the the protein into its tertiary sequence. Also an ATP requiring process.
  • Step 6. Presequence is cleaved in the matrix.

What happens if an import protein is defective?

Studies of yeast have helped us learn about the receptor and translocation machinery contains a complex of proteins that work together to allow entry. In yeast, these have been named the MOMX. series, where the number designates the protein number. An important protein in the recognition of the signal peptide and its binding to the receptor is called "MOM19". MOM 19 works with MOM 72 to recognize and bind the proteins. Then MOM22 helps the protein to pass from the receptor binding site to the insertion point at the outer membrane. The importance of MOM19 can be proved by adding antibodies to MOM19 and blocking import.

In a recent paper by Harkness et al (J Cell Biology 124: 637-648, 1995), they created mutant yeast cells that included a defective gene for MOM19.

They also included a drug resistant marker so they could selectively grow cells with the mutant gene (in the presence of the drug, p=fluorophenyl alanine, or fpa). So, the longer the cells grow in the drug, the more drug-resistant mutant cells will be found. The above electron micrographs are from their paper (cited above). They show the result of the absent MOM19 protein. What is absent in the cells grown for 16 or 32 h in the drug?

When they did the assays for the proteins, what proteins were actually missing? Tests showed that there was a dramatic decrease in most of the respiratory chain (electron transport chain) including cytochromes a/a3, and b. However, cytochrome C was unaffected. This suggests that another protein must control its import.


الطرد المركزي التفاضلي

Differential centrifugation is the most common method of fractionating cell. Fractionation is separation of different organelles within a cell. It is a classical procedure used to isolate different particles by stepwise successive centrifugations at increasing RCF's (Relative Centrifugal Forces).
Centrifugation separates particles in a suspension based on differences in size, shape and density that together define their sedimentation coefficient. The tube containing the suspension of particles is rotated at a high speed, which exerts a centrifugal force directed from the center of the rotor towards the bottom of the tube. Centrifugal Force 'G' is more commonly expressed as the Relative Centrifugal Force (RCF) or g value in multiples of the earth's gravitational field 'g'.

Relative centrifugal force or g value is calculated using the following formula:

RCF =Relative Centrifugal Force,
r = radius in centimeter,
Q = revolutions per minute.

Thus depending on the radius of centrifuge being used the Q value will vary for different centrifuge to obtain the same g value. When doing differential centrifugation, density of the liquid in which the centrifugation is carried out should be uniform and its density must be far lower than that of the particles to be separated. The viscosity of the particles should also be very low. As a consequence, the rate of particle sedimentation depends on its size and the applied g force. Differential centrifugation gives a crude resolution of sub cellular fraction. This centrifugation is usually carried out using fixed angle rotor.


Mitochondria: Structure and Functions

الميتوكوندريا are known as the powerhouses من الخلية. هم انهم العضيات that act like a digestive system that takes in nutrients, breaks them down, and creates energy-rich molecules for the cell. The biochemical processes of the cell are known as التنفس الخلوي. Many of the reactions involved in cellular respiration happen in the mitochondria. They are the working organelles that keep the cell full of energy.

There are small organelles floating free throughout the cell. Some cells have several thousand mitochondria while others have none. Muscle cells need a lot of energy so they have loads of mitochondria. Neurons (cells that transmit nerve impulses) don’t need as many. If a cell feels it is not getting enough energy to survive, more mitochondria can be created. Sometimes it can grow larger or combine with other mitochondria. It all depends on the needs of the cell.


Metabolons and Supramolecular Enzyme Assemblies

Kendrick B. Turner , . Scott A. Walper , in Methods in Enzymology , 2019

2.2.1.2 Cultivation conditions

Cultivation conditions as described in Section 2.1.1.2 can be followed until the induction of expression (steps 1–4). The subsequent protocols are based on the protein–protein packaging strategy described by Alves et al. that employs a SpyTagged-porin protein (OmpA-ST) and a SpyCatcher-labeled phosphotriesterase enzyme (PTE-SC) ( Alves et al., 2018 Alves, Turner, Medintz, et al., 2016 Zakeri et al., 2012 ). The methods below are based on a two vector expression system in which the anchor protein (OmpA-ST) is under the control of an arabinose-inducible promoter, and the enzyme (PTE-SC) is regulated using a T7 promoter. Expression of the T7 polymerase is itself regulated by a lactose-inducible promoter.

After the culture reaches an OD600 = 0.8 add l -arabinose (0.02%–1% final concentration v/v) to induce expression of the PTE-SC construct under the control of the arabinose inducible promoter.

Incubate an additional 2 h at 37°C.

Induce expression of the OmpA-ST anchor by adding the lactose analog Isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.5 mم.