معلومة

جزء البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية


إذا تم التعبير عن البروتين بطريقة غير متجانسة في الإشريكية القولونية تحت محفز T7 ، فما هو جزء من تركيز البروتين الكلي في الخلية الذي يتم التعبير عنه بشكل غير متجانس؟ ماذا يمكن أن يكون تركيزه على الأكثر؟ هل يعتمد بشدة على حجم البروتين أم أن هناك حدودًا معينة للحجم للتعبير المنخفض / العالي؟


Miroux and Walker (1996) الإنتاج المفرط للبروتينات في الإشريكية القولونية: مضيفات متحولة تسمح بتركيب بعض البروتينات الغشائية والبروتينات الكروية بمستويات عالية. J مول بيول. 260: 289-298

أبلغ المؤلفون عن مشاكل الإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء في بكتريا قولونية باستخدام نظام T7 (pET). يعزلون السلالات الطافرة التي تظهر مستويات محسّنة من التعبير مقارنة بالسلالة الأصل ، BL21 (DE3). في الجدول 1 الخاص بهم ، قاموا بتوثيق مستويات التعبير عن 17 بروتينًا بما في ذلك ، كعنصر تحكم ، GFP. تم العثور على GFP كمزيج من بروتين الجسم القابل للذوبان والشمول عند مستوى 37 مجم لتر-1 في BL21 (DE3) و 140 مجم لتر-1 في إحدى سلالاتها الطافرة (C41 (DE3)). كان أعلى مستوى من التعبير الذي لاحظوه هو 300 مجم لتر-1 ل OSCP البقري.

لسوء الحظ ، لم يوثق المؤلفون محتوى البروتين الكلي ولا كثافة الخلايا في الثقافات التي قاموا بتحليلها.

لنفترض أن المزارع كانت عبارة عن 10e9 خلايا مل-1 = 10e12 خلايا L.-1.

وفقًا لهذا المصدر (نقلاً عن Neidhardt F.C. Escherichia coli و Salmonella: Cellular and Molecular Biology. Vol 1. pp. 14، ASM Press 1996) بكتريا قولونية الخلية 2.8e-13 جم

الرقم المقبول عمومًا للبروتين كجزء من الوزن الجاف في بكتريا قولونية = 0.55

أحسب من هذه الأرقام قيمة 1540 مجم بروتين L.-1. بالنسبة لمستويات التعبير عن البروتين الثلاثة الموضحة أعلاه ، فهذا يعني:

GFP في BL21 (DE3) = 2.4٪

GFP في C41 (DE3) = 9.6٪

OSCP البقري في C41 (DE3) = 19.4٪

أستنتج (من هذه الأرقام ومن التجربة الشخصية) أن مستويات الإفراط في التعبير متغيرة للغاية ، وستكون معتمدة على الإجهاد والبروتين. يمكن توقع قيم في حدود 1-20٪ بروتين الخلية الكلي.


يتضح من هذه الدراسة أنه من أجل الاسترداد العالي لجزيء البروتين النشط ، يجب أن تكون الأجزاء القابلة للذوبان وإعادة الطي عالية الدقة. تتكون أجسام الإدراج من عديد ببتيدات من البروتين المؤتلف. هم الهياكل الثانوية غير النشطة و ndashlike. وبالتالي ، فإن عزل البروتين وتنقيته أمران بسيطان. يمكن إبراز نشاط البروتين المكشوف باستخدام ظروف تذويب خفيفة. سيساعد هذا في استرداد نسبة عالية من البروتين النشط بيولوجيًا مقارنة بالقابلية للذوبان باستخدام عامل تشوتروبي عالي.

يمكن استخدام خطوات المعالجة النهائية التالية لإنتاج البروتين المؤتلف من أجسام التضمين. تزرع الإشريكية القولونية المؤتلفة في وسط LB مع المضادات الحيوية مثل كاناميسين أو أمبيسلين أو كلورامفينيكول على أساس البلازميد. يتم اهتزاز القوارير عند لفة في الدقيقة حوالي 150-250 ويتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. بعد أن تصل الخلايا إلى مرحلة السجل ، توضح هذه الدراسة أن IPTG يضاف ويهتز مرة أخرى لمدة 4-6 ساعات. يتم طرد الخلايا وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت 50 ملي فوسفات الصوديوم.

يتم تحليل الخلايا باستخدام الخالط أو صوتنة. يتم طرد المعلق الخلوي وتصفيته باستخدام غشاء 0.45 وميكروم من البولي إيثر سلفونات. تتوفر العديد من الطرق الخاصة بالبروتين لزيادة قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية. لاستعادة البروتينات القابلة للذوبان ، يتم استخدام مواد مذيبة قوية مثل اليوريا وهيدروكلوريد الجوانيدينيوم. يتم الإذابة في ظل ظروف مختزلة. يجب غسل هذه الأجسام المتضمنة جيدًا قبل الذوبان. من المعروف أن عوامل الإذابة مثل thioredoxin تعمل على تحسين قابلية ذوبان البروتينات.

تقنيات الاندماج الجيني جيدة بنفس القدر لفصل البروتينات. تم العثور على بروتين رابط المالتوز و Glutathione-S- ترانسفيراز على ارتباط جيد بالبروتين ويمكن إزالته باستخدام تقنيات كروماتوجرافيا التقارب. يتم إجراء إعادة التشكيل باستخدام التخفيف أو الترشيح في مخازن منخفضة.


إنتاج البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية

الإشريكية القولونية (E. القولونية) تمت دراسة الجينات الوراثية خلال عقود وأصبح هذا الكائن الحي عنصرًا أساسيًا لا مفر منه في المختبرات.
تطوير الهندسة الوراثية والبيولوجيا التركيبية المرتبطة بالجيل قصير المدى والمرونة لاستغلال معلومات وراثية معينة ، حدد الإشريكية القولونية كمضيف مفضل لإنتاج البروتين المؤتلف.
بناءً على خبرتنا في الهندسة الوراثية والتخمير وإنتاج البروتين ، قمنا بتطوير تقنيات وخدمات في إنتاج البروتين المؤتلف.

تقنيتنا Staby®Express هي تحسين للتقنيات المتاحة التي نستخدمها عادة. يسمح بإزالة الجين المقاوم للمضادات الحيوية بالاتفاق مع توصيات الهيئات التنظيمية وتقليل العبء الحيوي للطاقة مع ضمان استقرار البلازميد المثالي.

يتم تنفيذ خدمات إنتاج البروتين المؤتلف مع أو بدون تقنيتنا وتشمل العديد من التكيف / التحسين لإنتاجك:

  • التسلسل والترميز الأمثل
  • التوليف الجيني
  • اختيار المروج
  • إضافة بطاقة لتنقية البروتين أو التعرف عليه

بعد البناء الجيني لمتجه التعبير الخاص بك ، نقوم بإجراء اختبار تعبير صغير من أجل تحسين حالة الثقافة والتعبير. ثم نقوم بتقييم وجود البروتين الخاص بك في الجزء القابل للذوبان أو غير القابل للذوبان الذي سيتم تحديده لعملية التنقية.

بعد التحقق من صحة شرط التعبير ، سنقوم بإنتاج البروتين الخاص بك بالمقياس الذي تختاره وتنقيته وفقًا لبروتوكول محدد.

يمكن إنتاج البروتينات في دورق مخفوق أو في جهاز تخمير (من 5 لترات إلى 50 لترًا).
نحن نقدم البروتين المنقى من الملجم إلى عدة جرامات.


الاستراتيجيات التي يتم فيها تجنب تعديل الهدف

تؤثر بعض البروتينات بشكل مباشر على التمثيل الغذائي الخلوي للمضيف من خلال خصائصها التحفيزية ، ولكن في التعبير العام عن البروتينات المؤتلفة يؤدي إلى "عبء أيضي". يُعرَّف العبء الأيضي بأنه كمية الموارد (المواد الخام والطاقة) ، التي يتم سحبها من التمثيل الغذائي للعائل للحفاظ على الحمض النووي الغريب والتعبير عنه [6]. يحدث تكوين أجسام متضمنة كرد فعل لتراكم البروتين المشوه. لا يرتبط العبء الأيضي وتكوين الجسم المتضمن ارتباطًا مباشرًا ولكن كلاهما من بين العوامل الرئيسية لتحديد قدرة الخلايا على إنتاج البروتين القابل للذوبان المؤتلف. نظرًا لأنه يمكن التحكم في تراكم البروتين المشوه والعبء الأيضي بواسطة عدد من العوامل البيئية ، فنحن قادرون جزئيًا على التحكم في تكوين البروتين القابل للذوبان في الجسم الحي.

تعبير البروتين في درجات حرارة منخفضة

تقنية معروفة للحد من في الجسم الحي يتكون تجميع البروتينات المؤتلفة من الزراعة في درجات حرارة منخفضة [7]. أثبتت هذه الإستراتيجية فعاليتها في تحسين قابلية ذوبان عدد من البروتينات الصعبة بما في ذلك الإنترفيرون البشري α-2 و subtilisin E وسلسلة ricin A واللوسيفيراز البكتيري وشظايا Fab و β-lactamase و الأرز ليبوكسجيناز L-2 وفول الصويا lypoxygenase L-1 ، kanamycin nuclotidyltransferase و Rabbit muscle glycogen phosphorylase (انظر [8] والمراجع المذكورة فيه).

يُفضل تفاعل التجميع بشكل عام عند درجات حرارة أعلى نظرًا للاعتماد القوي على درجة الحرارة للتفاعلات الكارهة للماء التي تحدد تفاعل التجميع [9]. النتيجة المباشرة لتقليل درجة الحرارة هي الإزالة الجزئية لبروتياز الصدمة الحرارية التي تحدث تحت ظروف الإفراط في التعبير [10]. علاوة على ذلك ، فإن النشاط والتعبير عن عدد من بكتريا قولونية تزداد المرافق عند درجات حرارة حوالي 30 درجة مئوية [11 ، 12]. تفسر هذه العوامل جزئيًا الاستقرار المتزايد وإمكانية الطي الصحيح عند درجات الحرارة المنخفضة.

ومع ذلك ، فإن الانخفاض المفاجئ في درجة حرارة الزراعة يمنع النسخ المتماثل والنسخ والترجمة [13]. كما تتأثر المحفزات التقليدية المستخدمة في النواقل لتعبير البروتين المؤتلف بشدة من حيث الكفاءة [14]. يتم تحقيق تأثير نسخ مماثل عند استخدام مروج متوسط ​​القوة أو ضعيف أو عندما يتم إحداث مروج قوي جزئيًا. تم العثور على مستويات تحريض منخفضة تؤدي إلى كميات أعلى من البروتين الذائب [15]. هذا نتيجة لانخفاض تركيز البروتين الخلوي الذي يفضل الطي. ومع ذلك ، ينخفض ​​نمو البكتيريا ، مما يؤدي إلى انخفاض كمية الكتلة الحيوية.

الاستراتيجيات المختلفة التي تهدف إلى تحسين التعبير عن البروتينات المؤتلفة عند درجة حرارة منخفضة هي كما يلي.

نظام يعتمد على cspA تم تطوير محفز للتعبير عن البروتينات عند درجة حرارة منخفضة [16]. ال cspA يتم تحفيز المروج بدرجة عالية عند درجة حرارة منخفضة ويتم كبته جيدًا عند 37 درجة مئوية وما فوق. تسلسل يشفر بروتين الانصهار TolAI-β-lactamase السام لـ بكتريا قولونية وسرعان ما تدهورت عند 37 درجة مئوية تحت سيطرة cspA المروجين. ألغى انزياح درجة الحرارة إلى 15 أو 23 درجة مئوية تحلل بروتين الاندماج وتم قمع النمط الظاهري السام المرتبط بالتعبير عند 37 درجة مئوية. تم اقتراح أن هذا النظام هو أداة قيمة لإنتاج البروتينات التي تحتوي على مجالات ممتدة للأغشية أو منتجات جينية غير مستقرة بطريقة أخرى في بكتريا قولونية.

تم مؤخرًا تقديم مبدأ يسمح بتعبير البروتين والطي عند 4 درجات مئوية [17]. يعتمد هذا المبدأ على التعبير المشترك للبروتين المستهدف مع مرافقين من بكتيريا محبة للنفسية. المرافقتان (Cpn60 و Cpn10 from Oleispira أنتاركتيكا RB8 T) تسمح بكتريا قولونية لتنمو بمعدلات عالية عند 4 درجات مئوية [12]. استريز من O. القارة القطبية الجنوبية تم التعبير عن RB8 T بالاشتراك مع Cpn60 و Cpn10 في بكتريا قولونية عند 4 درجات مئوية. أدى هذا الإجراء إلى زيادة النشاط المحدد للإستريز المنقى 180 ضعفًا مقارنة بالإنزيم المحضر من الزراعة عند 37 درجة مئوية. تم استنتاج أن درجة الحرارة المنخفضة كانت مفيدة للطي وتم اقتراح النظام كأداة للتعبير والطي الصحيح للبروتينات المؤتلفة في سيتوبلازم بكتريا قولونية.

بكتريا قولونيةسلالات تستخدم لتحسين التعبير القابل للذوبان

تم تطوير العديد من سلالات المضيف المتخصصة للتغلب على العبء الأيضي المرتبط بتعبير البروتين عالي المستوى.

اثنين بكتريا قولونية ساهمت السلالات المتحولة بشكل كبير في التعبير القابل للذوبان عن البروتينات المؤتلفة الصعبة. C41 (DE3) و C43 (DE3) عبارة عن طفرات تسمح بالتعبير المفرط لبعض البروتينات الكروية والغشائية التي لا يمكن التعبير عنها بمستويات عالية في السلالة الأم BL21 (DE3) [18]. التعبير عن حرف F1Fا البروتين الغشائي للوحدة الفرعية لـ ATP synthase في هذه السلالات ، ولا سيما C43 (DE3) ، مصحوبًا بتكاثر الأغشية داخل الخلايا وغياب أجسام التضمين [19]. يتم الآن تسويق هذه السلالات بواسطة Avidis http://www.avidis.fr وقد تم نشر عدد كبير من التقارير حول استخدامها للتعبير عن البروتينات الصعبة [20-23]. أفاد عمل حديث أن استقرار البلازميدات التي تشفر البروتينات السامة يزداد في C41 (DE3) وخاصة في C43 (DE3) [24].

سيستين في بكتريا قولونية يتم الحفاظ على السيتوبلازم بشكل نشط من خلال المسارات التي تشمل اختزال الثيوريدوكسين والجلوتاريدوكسين. تم تحسين الطي المعتمد على رابطة ثاني كبريتيد للبروتينات غير المتجانسة في سلالات Origami من Novagen. تعطيل trxB و غور الجينات المشفرة للاختزالين ، تسمح بتكوين روابط ثاني كبريتيد في بكتريا قولونية السيتوبلازم. ال trxB (نوفاجين AD494) و trxB / gor (نوفاجين اوريجامي) سلالات سلبية من بكتريا قولونية تم اختيارهم في عدة مواقف تعبيرية [25-27]. يتم تعزيز تشكيل الرابطة وثاني كبريتيد في البروتين المستهدف عن طريق الاندماج مع ثيوردوكسين في سلالات تفتقر إلى اختزال ثيوريدوكسين (trxB) [28]. يحفز الإفراط في التعبير عن DsbC periplasmic foldase في السيتوبلازم تكوين رابطة ثاني كبريتيد بشكل أكبر [27].

تعديل استراتيجيات الزراعة للحصول على البروتين القابل للذوبان

إن أبسط طريقة لإنتاج بروتين مؤتلف هي الزراعة على دفعات. يتم هنا توفير جميع العناصر الغذائية اللازمة للنمو من البداية وهناك سيطرة محدودة على النمو أثناء العملية. غالبًا ما يؤدي هذا القيد إلى تغييرات في وسط النمو مثل التغيرات في الرقم الهيدروجيني وتركيز الأكسجين المذاب وكذلك استنفاد الركيزة. علاوة على ذلك ، تتراكم المنتجات المثبطة من مسارات التمثيل الغذائي المختلفة. كثافة الخلايا ومستويات الإنتاج معتدلة فقط في الزراعة على دفعات.

في الزراعة على دفعات التغذية ، يمكن تعديل تركيز مصادر الطاقة وفقًا لمعدل الاستهلاك. يمكن أيضًا تنظيم العديد من العوامل الأخرى من أجل الحصول على أقصى مستوى إنتاج من حيث البروتين المستهدف لكل كتلة حيوية. يمكن اتباع تكوين أجسام التضمين في الزراعة على دفعات التغذية من خلال مراقبة التغيرات في تشتت الضوء الجوهري عن طريق قياس التدفق الخلوي [29]. يسمح هذا بتحسين ظروف النمو في الوقت الفعلي بمجرد اكتشاف أجسام التضمين حتى عند المستويات المنخفضة ويمكن تجنب تكوين الجسم المتضمن [30].

يتطلب طي بعض البروتينات وجود عامل مساعد محدد. قد تؤدي إضافة مثل هذه العوامل المساعدة أو الشركاء الملزمين إلى وسط الزراعة إلى زيادة محصول البروتين القابل للذوبان بشكل كبير. تم توضيح ذلك بالنسبة لطفرة مؤتلفة من الهيموجلوبين والتي تحسنت من تراكم المنتج القابل للذوبان عندما كان الهيم زائدًا [31]. وبالمثل ، لوحظ زيادة بنسبة 50٪ في قابلية الذوبان للجلوشيدوبين عندما بكتريا قولونية تمت زراعة المواد المؤتلفة في وجود 0.1 ملي مولار مغ 2 + [32]. عامل مهم في التعبير القابل للذوبان عن البروتينات المؤتلفة هو تكوين الوسائط وتحسينها. على الرغم من أن هذا يتم تحقيقه في الغالب عن طريق التجربة والخطأ ، إلا أنه قد يكون مفيدًا.

تقود المرافق الجزيئية طي البروتينات المؤتلفة

الإستراتيجية الممكنة للوقاية من تكوين الجسم المتضمن هي الإفراط في التعبير عن المرافق الجزيئية. هذه الإستراتيجية جذابة ولكن ليس هناك ما يضمن أن المرافقين يحسنون قابلية ذوبان البروتين المؤتلف. بكتريا قولونية ترميز المرافقات ، وبعضها يقود محاولات الطي ، بينما يمنع البعض الآخر تراكم البروتين [4 ، 11 ، 33]. بمجرد أن تغادر البروتينات المركبة حديثًا نفق الخروج من بكتريا قولونية الريبوسوم يربطونه مع عامل الزناد المساعد [34]. يتم حماية البقع المكشوفة الكارهة للماء على البروتينات المصنعة حديثًا من خلال الارتباط بعامل الزناد من التفاعلات غير المقصودة بين الجزيئات أو داخل الجزيئات وبالتالي منع الطي المبكر. يمكن أن تبدأ البروتينات أو تستمر في طيها إلى حالتها الأصلية بعد إطلاقها من عامل الزناد. البروتينات المحصورة في التوافقيات غير الأصلية والتجمع ، هي ركائز لـ DnaK و GroEL. يمنع DnaK (عائلة Hsp70 chaperone) تكوين أجسام متضمنة عن طريق تقليل التجميع وتعزيز التحلل البروتيني للبروتينات غير المطوية [11]. يتوسط نظام ثنائي المرافق يشتمل على DnaK و ClpB (عائلة Hsp100) في إذابة البروتينات أو تفكيكها [35]. تقوم GroEL (عائلة Hsp60 chaperone) بتشغيل نقل البروتين بين أجزاء البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان وتشارك بشكل إيجابي في التفصيل وتشكيل الجسم الشامل. تحمي بروتينات الصدمة الحرارية الصغيرة lbpA و lbpB البروتينات المشوهة بالحرارة من التكدس الذي لا رجعة فيه وقد وُجدت مرتبطة بأجسام متضمنة [36 ، 37].

أثبت التعبير المفرط المتزامن لجينات ترميز المرافقة والبروتينات المستهدفة المؤتلفة فعاليته في عدة حالات. أدى الإفراط في التعبير عن عامل الزناد في المؤتلفات إلى منع تراكم إندوستاتين الفأر ، وبروتين ORP150 البشري المنظم بالأكسجين ، وليزوزيم بشري ، وترانسجلوتاميناز كبد خنزير غينيا [38 ، 39]. تم تحفيز التعبير القابل للذوبان بشكل أكبر عن طريق الإفراط في التعبير المشترك لأنظمة GroEL-GroES و DnaK-DnaJ-GrpE جنبًا إلى جنب مع عامل الزناد [39]. أنظمة المرافقة تعاونية والاستراتيجيات الأكثر تفضيلًا تتضمن التعبير المشترك عن مجموعات من المرافقين الذين ينتمون إلى مجموعات عوامل الزناد المرتبطة بـ GroEL و DnaK و ClpB والريبوسوم للمرافقين [40-42].

شركاء التفاعل وطي البروتين

عدم ذوبان البروتين في بكتريا قولونية يرتبط السيتوبلازم جزئيًا بتوزيع المخلفات الكارهة للماء على سطح البروتين. وبالتالي ، فإن التعبير القابل للذوبان للوحدات الفرعية للبروتينات متعددة الأقطاب غير المتجانسة يعاني أحيانًا من تكوين جسم التضمين في غياب شريك ملزم مناسب.

تعبير قابل للذوبان في بكتريا قولونية من منتج الجين 23 T4 العاثية (بروتين قفيصة رئيسي) يتطلب التعبير المشترك لمنتج الجين 31 (الملتهمة co-chaperonin gp31) [43]. مكّن التعبير عن شريك التفاعل الصحيح gp23 من الطي بشكل صحيح وتشكيل هياكل منتظمة طويلة في سيتوبلازم بكتريا قولونية.

تشير دراسة أخرى إلى تنقية مركب heterodimeric بالتعبير عن كل وحدة فرعية (pheromaxein A و C) على أنه اندماج للثيوردوكسين [44]. بقيت كل وحدة فرعية قابلة للذوبان في المحلول ، عندما تمت إزالة الثيوريدوكسين بروتينيًا ، فقط في وجود الأخرى.

بشكل قاطع ، يحتمل أن يفضل شركاء التفاعل في الجسم الحي ذوبان البروتينات المستهدفة. تمكّن الأنظمة الجديدة للتعبير المشترك للبروتينات المتعددة المتضمنة في الهياكل المعقدة مثل هذه الاستراتيجيات [1].


المواد والأساليب

البناء البلازميد والاستنساخ و بكتريا قولونية تحويل

بعد تحليل استخدام الكودون ، بناء بطول 320 نقطة أساس يحتوي على كودون محسن RMCP1 تسلسل الجينات (NM_001082294.1) محاط بمواقع تقييد ، Ncoانا و زهوأنا في pUC57 (RMCP1 / pUC57) ، تم إنشاؤه بواسطة GeneCust (Dudelange ، لوكسمبورغ) (الشكل 1). ثم تم استخدام RMCP1 / pUC57 للتحويل بكتريا قولونية سلالة الخلايا TOP10F (TOP10) لتضخيم DNA البلازميد. نمت الخلايا في مرق Luria-Bertani (LB) (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO) الذي يحتوي على التتراسيكلين (10 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. تم استخلاص البلازميد بعد ذلك باستخدام مجموعة SolGent Plasmid Mini Prep ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (سيول ، كوريا) ، وهضمها باستخدام زهوانا و Ncoتم فصل نواتج الهضم على هلام الاغاروز و RMCP1- تمت تنقية الجزء المحتوي عن طريق الاستخلاص الهلامي باستخدام GeNet Bio Kit (دايجون ، كوريا). تم ربط الجزء المنقى بـ زهوانا و Ncoناقل pET28a مهضوم (معهد باستور ، طهران ، إيران) ، ويستخدم لتحويل خلايا TOP10. تم إجراء جميع تحولات TOP10 باستخدام بروتوكول كلوريد الكالسيوم والصدمة الحرارية. تسلسل ترميز صاحب6-tag موجود مباشرة بعد زهوأنا موقع التقييد على البلازميد pET28a ، وبالتالي تم إنتاج البروتين المؤتلف الناتج باستخدام طرف C منصهر His6-بطاقة شعار.

(أ) رسم تخطيطي للبناء الذي يحتوي على تسلسل ترميز MCP1 للأرنب. (ب) النوكليوتيدات (السفلي) وتسلسل الأحماض الأمينية المترجمة (العلوي) للأرنب المؤتلف MCP1. الموضع 1 في تسلسل الأحماض الأمينية يتوافق مع أول حمض أميني (ميثيونين) لبروتين الأرانب الناضج MCP1.

(أ) رسم تخطيطي للبناء الذي يحتوي على تسلسل ترميز MCP1 للأرنب. (ب) النوكليوتيدات (السفلي) وتسلسل الأحماض الأمينية المترجمة (العلوي) للأرنب المؤتلف MCP1. الموضع 1 في تسلسل الأحماض الأمينية يتوافق مع أول حمض أميني (ميثيونين) لبروتين الأرانب الناضج MCP1.

تم تقييم الحيوانات المستنسخة الإيجابية الناتجة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والهضم. احتوت مخاليط تفاعل PCR على بوليميراز DNA Taq (Thermo Scientific ، Waltham ، MA) (0.3 ميكرولتر ، 1.25 U) ، محلول 10x (2.5 ميكرولتر حراري علمي) ، 10 ملي مولار dNTPs (1 ميكرولتر) ، 1.25 ملي مولار MgCl2 (0.5 ميكرولتر حراري علمي) ، ماء مقطر مزدوج (17.75 ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر من 10 ملي مولار T7 للأمام (F ، 5΄-TAATACGACTCACTATAGGG-3΄) والعكس (R ، 5΄-GCTAGTATTGCTCAGCGG-3΄) الاشعال. بدأ برنامج PCR بحضانة لمدة 4 دقائق عند 96 درجة مئوية تليها 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 50 ثانية وتنتهي بخطوة عند 72 درجة مئوية لـ 10 دقائق. تم استخدام الدورة الحرارية Bio-Rad (Hercules ، CA) لـ PCR. تم التحقق من أحجام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة هلام الاغاروز (1٪) الكهربائي ومقارنتها مع سلم خليط الحمض النووي (فيرمنتاز).

تعبير البروتين المؤتلف

تم استخراج البلازميد المركب (RMCP1 / pET28a) من الحيوانات المستنسخة الإيجابية واستخدامها للتحويل. بكتريا قولونية BL21 (DE3) (BL21) (معهد باستير). تم اختيار المحولات الفردية على أجار LB (Sigma-Aldrich) التي تحتوي على 25 ميكروغرام / مل من كاناميسين ، وتم التحقق منها بواسطة مستعمرة PCR و زهوأنا/Ncoأنا تقييد إنزيم الهضم. تم تأكيد التسلسل الدقيق للجزء الذي تم إدخاله في الحيوانات المستنسخة الناتجة (نسختان) من خلال تسلسل الحمض النووي ، والذي تم إجراؤه بواسطة شركة Bioneer (كوريا).

تم اختيار النسختين الموجبتين (المستنسختان 2 و 3) لإنتاج بروتين rRMCP1. للحث على التعبير عن البروتين ، تم استنبات الحيوانات المستنسخة في مرق LB مكملًا بـ 25 ميكروغرام / مل من كاناميسين ، مع تحريض isopropyl-β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG). لتحديد الظروف المثلى التي تسمح بمستوى متوسط ​​من التعبير البروتيني ، تم فحص معلمات الحث التالية: OD600 للثقافة البكتيرية عند الحث (0.4-0.5 ، 1.0-1.2 و 2.0-2.5) ، درجة الحرارة (26 درجة مئوية ، 30 درجة مئوية ، 37 درجة مئوية) ، مدة الحث (5-24 ساعة) ، معدل الاهتزاز (180-250 دورة في الدقيقة ) والتركيز النهائي لـ IPTG (0.5 ، 1 و 2 ملي مولار). تم أيضًا فحص تأثير استبدال الوسائط كل 4-6 ساعات أثناء التحريض ، أي كل 4-6 ساعات ، تم جمع البكتيريا بالطرد المركزي وأضيف وسط استنبات جديد بنفس المضاد الحيوي وتراكيز IPTG.

تم إجراء الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) مع تصور البروتين بواسطة تلطيخ Coomassie Brilliant Blue R-250 والنشاف الغربي باستخدام بيروكسيداز الفجل المترافق / الجسم المضاد له (Thermo Scientific) للتحقق من التعبير عن rRMCP1.

تنقية البروتين المؤتلف

تم تحلل خلايا BL21 التي تنتج بروتين rRMCP1 في 4 مل من محلول التحلل [100 ملي مولار الصوديوم2ص4، 10 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) و 8 م يوريا] لكل 1 جرام من الحبيبات البكتيرية ، وتم الانتهاء من هذه العملية عن طريق صوتنة (خمس نبضات من 50 ثانية) ، وفقًا لبروتوكول تنقية البروتين QIAGEN (هيلدن ، ألمانيا). تم الطرد المركزي للمحللين عند 8500 × ز عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم تم تحضين المادة الطافية براتنج حمض النيكل نيتريلوترياسيتيك (Ni-NTA) (QIAGEN) عند درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية - 25 درجة مئوية) لمدة 45 دقيقة. تم تطبيق معقد البروتين / الراتينج على عمود QIAGEN مصغر ، وغسله ، وتصفية باستخدام المحاليل B إلى E وتم جمع الكسور بشكل منفصل. بعد تحليل SDS-PAGE للكسور التي تم جمعها ، تم تجميع أجزاء البروتين المنقى وتركيزها باستخدام مرشحات Amicon Ultra-4 للطرد المركزي (Merck Millipore ، Billerica ، MA). تم تحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد (برادفورد 1976) ، مع الزلال المصل البقري (سيغما الدريتش) كمعيار.

SDS-PAGE والنشاف الغربي

SDS-PAGE

تمت زراعة خلايا BL21 و BL21 / pET28a و BL21 / pET28a / RMCP1 في وسط مرق LB. في OD600 = 0.4–0.5 ، تم تقسيم ثقافة BL21 / pET28a / RMCP1 إلى أنبوبين ، وتم تحفيز النصف بواسطة IPTG لمدة 24 ساعة. تم سحب العينات بعد 5 و 16 و 24 ساعة من الحث وتم تطبيع كمية البكتيريا بين الظروف الثلاثة عن طريق قياس OD الخاص بهم600s ومعادلتها بالتخفيف ، وتجهيزها للرحلان الكهربي. تم تحميل العينات وعلامة البروتين الملون مسبقًا (10-270 كيلو دالتون ، Thermo Scientific) على هلام SDS-PAGE بنسبة 15 ٪ ، ثم تم صبغها في محلول Coomassie R-250 ، لمدة 3 ساعات ، وتم توزيعها.

النشاف الغربي

بعد SDS-PAGE ، تم نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيل باستخدام محلول نقل (25 ملي مولار من قاعدة تريس ، 190 ملي جلايسين ، 20٪ ميثانول ، درجة الحموضة 8.3) ، عند 90 فولت لمدة 90 دقيقة. (فيض الله زاده وآخرون. 2016). تم اكتشاف بروتين rRMCP1 باستخدام الجسم المضاد المترافق أحادي النسيلة الفأري المضاد للبولي هيستيدين بيروكسيديز (التخفيف العامل من 1: 2000 Sigma-Aldrich).

النشاط البيولوجي لـ rRMCP1

ثقافة وحيدات

تم أخذ ما يقرب من 3 مل من الدم من آذان اثنين من الأرانب النيوزيلندية البيضاء (2.3 ± 0.2 كجم) (تم شراؤها من معهد باستور). تمت الموافقة على التجربة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة أصفهان للعلوم الطبية ، أصفهان ، إيران.

تم فصل الخلايا الوحيدة بواسطة Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich) وفقًا لتوصيات الشركة الصانعة. تم الحفاظ على الخلايا الوحيدة المنفصلة في معهد Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Biosera ، Nuaille ، فرنسا) مكملًا بنسبة 10 ٪ من مصل بقري الجنين (Sigma-Aldrich) ، و 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (Invitrogen) ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، في حاضنة رطبة في جو من 5 ٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.

مقايسة هجرة الخلية الوحيدة بوساطة rRMCP1

تم استخدام خليتين من ستة آبار مع غشاء بولي كربونات مسام 0.4 ميكرومتر (Sterlitech Corporation ، Kent ، OH). تم تحضير تركيزات مختلفة من rRMCP1 المنقى (5 ، 10 ، 15 أو 20 ميكروغرام لكل 2 مل من وسط RPMI المضاف إليه 0.5٪ من مصل بقري جنيني ، 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) ، تم تحضيرها ووضعها في الغرفة السفلية لكل بئر ، من نسختين. كان هناك بئرا تحكم ، بدون إضافة بروتين. تم تعليق وحيدات (2.5 × 10 6 خلايا) في 10 مل من RPMI ، وتم وضع 1 مل من المعلق في الغرفة العلوية. ثم تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة ، 5٪ CO2، بين عشية وضحاها. تم نقل الوسائط الموجودة في الغرف العلوية إلى أنابيب منفصلة. تم نقل الوسائط من الغرف السفلية إلى أنابيب منفصلة ، بالطرد المركزي عند 1500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، علقت الكريات في 1 مل من RPMI وعدت الخلايا بعد تلطيخ التريبان الأزرق. تم تقييم هجرة الخلايا الوحيدات بناءً على عدد الخلايا التي هاجرت من الغرفة العلوية ، عبر الغشاء ، إلى الغرفة السفلية في كل بئر والتي تحتوي على 0.18 أو 0.36 أو 0.72 نانوغرام / مل ، مقارنةً بالتحكم. كان عدد الخلايا الوحيدة التي هاجرت من خلال المرشح متناسبًا مع الانجذاب الكيميائي.

تحليل احصائي

تم تحليل بيانات مقايسة ترحيل الخلية الأحادية في برنامج IBM SPSS (الإصدار 20.0) باستخدام الاختبار المستقل ر اختبار و ANOVA في اتجاه واحد. ص- اعتبرت القيم الأقل من 0.05 ذات دلالة.


الاستنساخ والتعبير العالي والتنقية للإنسان المؤتلف Intereferon-β-1b in الإشريكية القولونية

تم استخدام التقييم المتسلسل واستراتيجية التحكم في العملية لملف الشوائب والانتعاش العالي مع جودة rhIFN-β-1b المعبر عنها في الإشريكية القولونية. تم تحقيق التعبير عالي المستوى باستخدام استبدال الكودون (محتوى AT بنسبة 52.6٪ في المنطقة الطرفية N) وتحسين ظروف الاستنبات. أدت إضافة ريفامبيسين بتركيز 200 ميكروغرام / مل إلى زيادة إنتاج المنتج المحدد البالغ 66 مجم كثافة بصرية −1 لتر (43.5٪ من إجمالي البروتين الخلوي). تمت إزالة ثلاثة وثمانين بالمائة من عديدات السكاريد الدهنية ، و 32٪ من حمض الديوكسي ريبونوكلييك المضيف (DNA) ، و 78٪ من بروتينات الخلية المضيفة بنسبة 0.75٪ Triton X-100 وغسل اليوريا 2 M. تمت إزالة أحد عشر بالمائة من عديدات السكاريد الدهنية ، و 39٪ من DNA المضيف ، و 12٪ من بروتينات الخلية المضيفة في خطوة الذوبان. تم تحقيق اثنين وتسعين في المائة من إعادة تشكيل البروتين عن طريق طريقة الترشيح بالضغط العالي. تم تحديد إعادة الطي عن طريق الترشيح عالي الضغط ، وارتفاع السرير ، والارتفاع المكافئ لقيمة اللوحة النظرية في عمود الكروماتوغرافيا كمعلمات رئيسية لاستعادة عالية بنقاء. أخيرًا ، أسفرت العملية المقررة عن 34٪ من البروتين المنقى بنقاوة تزيد عن 99٪ وهي مقبولة لدراسات السمية قبل السريرية. يعتبر rhIFN-β-1b المنقى الذي تم الحصول عليه في هذه الدراسة هو الأعلى الذي تم الإبلاغ عنه حتى الآن.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


التعبير البروتين في بكتريا قولونية

تعبير البروتين في البكتيريا بكتريا قولونية هي الوسيلة الأكثر شيوعًا لإنتاج البروتين المؤتلف. بكتريا قولونية هو مضيف راسخ يوفر وقتًا قصيرًا للثقافة ، ومعالجة جينية سهلة ووسائط منخفضة التكلفة. بالإضافة إلى، بكتريا قولونية لها تاريخ طويل في كونها قادرة على إنتاج مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من البروتينات. حتى البروتينات التي تحتوي على روابط ثاني كبريتيد يمكن التعبير عنها داخل السيتوبلازم لسلالات NEB SHuffle & reg.

داخل عالم بكتريا قولونية التعبير ، نظام T7 هو الأسلوب الأكثر شيوعًا لإنتاج البروتينات. في هذا النظام ، يتم إدخال ناقل تعبير يحتوي على جين مهم مستنسخ في اتجاه مجرى مروج T7 إلى مضيف تعبير T7. تحمل مضيفات التعبير T7 مثل سلالات DE3 أو سلالات T7 Express نسخة كروموسومية من جين بوليميريز Phage T7 RNA. عند إضافة محفز ، يتم التعبير عن بوليميريز T7 RNA ويصبح مخصصًا لنسخ الجين المعني.

اختر النوع:

  • تطبيقات محددة
  • أسئلة وأجوبة
  • البروتوكولات
  • الأدوات والموارد
  • المنشورات
  • يتفوق NiCo21 (DE3) على BL21 (DE3) من حيث نقاء البروتين الذي يحمل علاماته
  • T7 التحكم في التعبير عن البروتين في بكتريا قولونية المضيفون
  • نظام Lemo ™ لتعبير البروتين الغشائي
  • تشكيل رابطة ثاني كبريتيد
  • NiCo21 (DE3) تنقية من خطوتين
  • المعلومات القانونية

مقالات

تقدم هذه المقالة نظرة عامة على التطورات في منهجية التعبير عن البروتين وتنقيته على مدار الأربعين عامًا الماضية.

تشكيل رابطة ثنائي كبريتيد في السيتوبلازم من النوع البري E. coli غير مناسب ، بينما SHuffle قادر على طي البروتينات بشكل صحيح مع روابط ثاني كبريتيد متعددة في السيتوبلازم.

هذا المنتج مغطى بواحدة أو أكثر من براءات الاختراع والعلامات التجارية و / أو حقوق النشر المملوكة أو الخاضعة لسيطرة New England Biolabs، Inc (NEB).

بينما تقوم NEB بتطوير منتجاتها والتحقق منها لتطبيقات مختلفة ، فإن استخدام هذا المنتج قد يتطلب من المشتري الحصول على حقوق ملكية فكرية إضافية لطرف ثالث لتطبيقات معينة.

لمزيد من المعلومات حول الحقوق التجارية ، يرجى الاتصال بفريق تطوير الأعمال العالمية في NEB على [email protected]

هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط. هذا المنتج غير مخصص للاستخدام لأغراض علاجية أو تشخيصية في البشر أو الحيوانات.

أشرطة فيديو

حلول للتعبير عن البروتينات الصعبة

يتمتع NEB بتاريخ طويل في التعبير عن البروتين المؤتلف وقد طور مجموعة واسعة من الحلول للبروتينات التي يصعب التعبير عنها.


تحلل وتنقية البروتين المؤتلف

تقليديا ، تنقية البروتين من بكتريا قولونية يتضمن أربع مراحل: الحصاد ، وتحلل الخلايا البكتيرية ، وتنقية المحللة ، وتنقية البروتين. يتطلب التحلل البكتيري عادةً عدة خطوات تستغرق وقتًا طويلاً ، بما في ذلك دورات التجميد / الذوبان والصوت ، مما قد يؤثر سلبًا على جودة البروتين ويساهم في تباين العينة. للحفاظ على نشاط البروتين وسلامته ، يتم استخدام مخازن التحلل القائمة على المنظفات لتجنب طرق استخراج البروتين الميكانيكية. عادة ما يكون الطرد المركزي مطلوبًا لتكوير حطام الخلية غير المرغوب فيه والسماح باستعادة المحللة الموضحة.

يتم إجراء التنقية بشكل متكرر باستخدام وسائط تقارب خاصة بعلامات الحاتمة المعبر عنها. عادةً ما يتم استخدام الوسائط القائمة على Agarose ، إما كملاط في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة أو معبأة في أعمدة. على الرغم من سهولة التعامل مع الأعمدة ، إلا أنها تتأثر بالاتساق المتحلل وترحيل حطام الخلية ، مما قد يتسبب في حدوث انسداد.

ستوضح هذه المقالة بروتوكولًا جديدًا لتبسيط سير عمل تنقية البروتين المؤتلف التقليدي من خلال الجمع بين التحلل الأنزيمي وخطوات التنقية. ينتج عن هذا النهج وقت تدريب أقل بشكل ملحوظ وتوفير وقت أكبر من ساعتين مقارنة بسير العمل التقليدي (شكل 1).

إن دمج الخرزات المغناطيسية في البروتوكول يلغي الحاجة إلى توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي. تم اعتماد الخرزات المغناطيسية حيث تم استخدام خرز الاغاروز ، مما يقلل من وقت المعالجة ويزيد من إنتاجية العينة. تُستخدم الخرزات المغناطيسية بشكل عام في وضع الدُفعات ومعزولة على مغناطيس للسماح بتبادل المخزن المؤقت.

تسهل الخرزات المغناطيسية أتمتة البروتوكول باستخدام معالج الجسيمات ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية العينة مع تقليل وقت المعالجة العملية إلى أقل من 10 دقائق. To further improve the workflow, we used BugBuster® Master Mix reagent (EMD Millipore), which allows for nonmechanical extraction of soluble protein from bacterial cells. This extraction reagent combines detergent-based lysis with the enzymatic agent Benzonase® nuclease and the enzyme rLysozyme™ in a ready-to-use formulation.


Figure 1. One-step lysis combined with purification (right) saves considerable time compared to traditional recombinant protein purification, which requires separate lysis, lysate clarification, and purification steps (left).

المواد والأساليب

Histidine-tagged recombinant glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) was purified with PureProteome™ Nickel Magnetic Beads (EMD Millipore), using a traditional purification workflow (mechanical lysis) and the new condensed protocol (combined detergent-based lysis and purification). These magnetic beads capture histidine-tagged proteins they isolate recombinant proteins at high purity and can be used manually or on automated systems. We compared the manual processing results with those obtained using the KingFisher® automated particle processor (Thermo Scientific).

Traditional Protein Purification
بكتريا قولونية culture was pelleted into microcentrifuge tubes and the supernatant was discarded. Lysis/wash buffer containing lysozyme was added to each pellet. The pellet was resuspended and incubated with end-over-end mixing, followed by sonication using a microtip. The lysate was frozen, followed by quickly thawing the sonication/freeze-thaw cycle was repeated once more. To reduce viscosity, Benzonase endonuclease was added to the lysate and clarified by centrifugation.

The clarified lysate was added to PureProteome Nickel Magnetic Beads. The beads were incubated with بكتريا قولونية lysate with end-over-end mixing. After removal of the lysate, the beads were washed with lysis/wash buffer by vortexing, capturing the beads on the magnet and removing the buffer by pipette. The wash step was repeated two more times prior to eluting the captured histidine-tagged GAPDH. The beads were mixed, and an additional elution was performed to achieve maximum yield. Both elution fractions were combined into one microcentrifuge tube for future analysis.

One-Step Protein Purification
Manual Processing
بكتريا قولونية culture was pelleted into microcentrifuge tubes and the supernatant discarded. Suspended PureProteome Nickel Magnetic Bead slurry was added. Using the PureProteome Magnetic Stand, the preservative was removed, and the beads were washed with lysis/wash buffer. The beads were collected on the magnet, and the buffer was removed by pipette. The beads were resuspended in BugBuster Master Mix and the suspension was added to each بكتريا قولونية pellet. Each tube was briefly vortexed, then incubated with end-over-end mixing. The unbound fractions were discarded and beads were washed using the PureProteome Magnetic Stand to capture beads. Elution was performed as previously described.

Automated Processing
بكتريا قولونية culture was pelleted into a KingFisher Microtiter Deepwell 96 plate and the supernatant discarded. Reagents and samples were pipetted into the KingFisher Duo plates and the suspended PureProteome Nickel Magnetic Bead slurry was brought up to sufficient volume with wash buffer. Wash buffer was used for both equilibration and wash steps, and the elution buffer was pipetted into the elution strips. The protocol was executed and the plates were loaded into the KingFisher Duo System.

The PureProteome Nickel beads were equilibrated in wash buffer to remove preservatives. The beads were collected, and cell lysis and His-tagged protein capture was performed. The beads were then washed and recombinant protein was eluted. After the run ended, the eluted sample fractions were collected for further analysis.

Protein Analysis
Additional lysates were prepared using the traditional mechanical lysis approach as well as using the BugBuster Master Mix protocol no magnetic beads were added during the lysis step. The lysate was clarified by centrifugation, and total protein concentration was determined with the Direct Detect®
IR spectrometer (EMD Millipore).

A quantitative Bradford assay was also performed to assess the efficiency of lysis and protein purification.

Finally, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed. Purified samples were reduced, denatured and loaded onto NuPAGE® Bis-Tris gels (Life Technologies). Following electrophoresis, the gels were stained with Coomassie® blue to visualize protein bands.

The results demonstrated that the new protocol delivered more total protein in less time and with greater consistency than the traditional method. Traditional mechanical lysis of six samples took about two hours the average total protein collected was 3.54 mg/mL and the CV% was 15.55. In contrast, enzymatic lysis using the new protocol took about 30 minutes the average total protein collected was 4.09 mg/mL and the CV% was 2.05.

The eluted fractions were then tested for protein yield using a Bradford assay. All workflows demonstrated roughly equivalent yields of purified protein. However, the traditional method exhibited greater inter-sample variability than did either condensed protocol. Workflow automation offered the highest degree of reproducibility (طاولة).

Finally, the SDS-PAGE gel showed all workflows provided similar sample purity (الشكل 2). As previously noted, greater sample-to-sample variability was observed for the traditional workflow.


Yield of His-tagged GAPDH using the traditional and condensed بكتريا قولونية lysis and purification protocol as determined by Bradford assay.

For extraction of recombinant protein from بكتريا قولونية, traditional mechanical lysis is a time-consuming manual process. Mechanical lysis and manual processing can also result in variable yield due to sample-to-sample variations in the sonication step. By combining gentle nonmechanical lysis with magnetic affinity capture beads for His-tagged protein purification, the traditional recombinant protein purification workflow has been condensed.

Even when samples were manually processed, a one-step lysis and purification protocol reduced processing time by 75% without sacrificing yield or purity. Due to reduced sample manipulation, the simplified protocol also provides greater sample-to-sample consistency. Moreover, by eliminating centrifugation requirements, the condensed workflow can be automated using particle processors to further reduce sample variability and increase throughput while reducing hands-on time to less than 10 minutes.


Figure 2. SDS-PAGE analysis of His-tagged GAPDH purified using the traditional and condensed recombinant protein purification workflows. The condensed protocol was performed manually as well as on the KingFisher Duo System. (Molecular weight standards are included in the rightmost lane.)


بكتريا قولونية

NEB offers two protein expression systems in بكتريا قولونية. The pMAL&trade Protein Fusion & Purification System (NEB #E8200) is used to express an MBP-fusion protein which is then purified by affinity purification. This system enhances solubility and results in reliable بكتريا قولونية expression in either the cytoplasm or periplasm.

The IMPACT&trade Kit (NEB #E6901) allows fusion of a tag consisting of the intein and the chitin binding domain (CBD), to either the C-terminus (pTXB1) or the N-terminus (pTYB21) of the target protein. In the presence of thiols, such as DTT, the intein undergoes specific self-cleavage which releases the target protein from the chitin-bound intein tag resulting in purification in a single chromatographic step with no need for proteases.

pMAL&trade and IMPACT&trade are trademarks of New England Biolabs, Inc.

Choose Type:

  • Subcategories
  • FAQs
  • البروتوكولات
  • ملاحظات طلب التقديم
  • الأدوات والموارد
  • المنشورات
  • Schematic Illustration of the IMPACT™ System
  • Expression and Purification of بكتريا قولونية Maltose-Binding Protein (MBP) Using the pTXB1 Vector (pMXB10)
  • T7-Controlled Expression of a Non-Toxic Protein in بكتريا قولونية Hosts
  • Western Analysis of 6-His-tagged Brugia malayi بروتين
  • Overnight Expression of a Membrane Protein - PhoA fusion
  • Disulfide Bond Formation
  • PfCHT1 Chitinase Activity Assayed from Crude Lysates
  • Improved Purity of His-tagged Proteins with NiCo21(DE3)
  • NiCo21 (DE3) Two-Step Purification
  • Optimization of YidC-GFP Expression with Lemo21(DE3)
  • Lemo21(BE3) vs. BL2(DE3)
  • المعلومات القانونية

مقالات

Read how to avoid common obstacles in protein expression that prevent interactions with cellular machinery.

Cell-free protein synthesis has the potential to become one of the most important high throughput technologies for functional genomics and proteomics.

الكتيبات

أدوات التحديد

Lane 1: uninduced cell extract.
Lane 2: induced cell extract showing expressed fusion protein.
Lane 3: MBP fractions eluted after inducing cleavage overnight at 4°C.
Lane 4: MBP ligated to a peptide containing an N-terminal cysteine. Marker M is the Protein Ladder (NEB #P7703).

Protein expression with Lemo21(DE3) is very similar to BL21(DE3), with only a few minor changes.

This product is covered by one or more patents, trademarks and/or copyrights owned or controlled by New England Biolabs, Inc (NEB).

While NEB develops and validates its products for various applications, the use of this product may require the buyer to obtain additional third party intellectual property rights for certain applications.

For more information about commercial rights, please contact NEB's Global Business Development team at [email protected]

This product is intended for research purposes only. This product is not intended to be used for therapeutic or diagnostic purposes in humans or animals.


مثال 4

Improvement in the Expression Level and Cellular In Vivo Folding of the Recombinant HSA with the Assistance of Molecular Chaperone System

Recombinant بكتريا قولونية origami DE3 cells co-transformed with both the plasmids (pETHSA and pTF16) were inoculated in the primary culture of 5 mL LB medium containing both the antibiotics-ampicillin (100-300 μg/mL) and chloramphenicol (20-40 μg/mL). They were then inoculated from primary culture into a secondary culture in ZY autoinduction growth medium containing both ampicillin (100-300 μg/mL) and chloramphenicol (20-40 μg/mL) antibiotics. The secondary culture was grown at a temperature between 30-40° C. and the samples were collected and checked for optical density at regular time intervals. The growth of the cells was monitored and the cells were induced with L-Arabinose (Final conc. 0.3-0.6 mg/mL) when the OD600 reached 0.2 to 0.5 (which took between 6-12 hours) and left to grow again until the OD600 reached 0.6-1.0.

Δt this point, the incubation temperature of the recombinant host cell culture was lowered to a temperature in the range of 10-20° C. and cells were harvested after 8-12 hours of induction.

In order to obtain the expressed protein, the cells were resuspended in the lysis buffer containing the osmolyte trehalose in the concentration range of 0.5-1.0M. Cell lysate was obtained after the lysis step using conventional means. To summarize the steps above briefly, induced بكتريا قولونية Origami2 (DE3) cells expressing both the Trigger factor (chaperone) and rHSA were harvested and pelleted down by centrifugation. The cell pellet obtained was resuspended in cell lysis buffer and incubated for 15-30 minutes. The resuspended cells in lysis buffer were then exposed to an ultrasonic cell disruptor to release the intracellular components in the lysis buffer. The sonicated cell lysate was fractionated by high speed centrifugation. The supernatant containing soluble fraction of rHSA was carefully aspirated without disturbing the pellet which contained the insoluble aggregated fraction of rHSA. Cells were then fractionated and analyzed for solubility and activity assay and was compared with the rHSA production in بكتريا قولونية without Trigger factor expression (chaperone assistance).

Overall, the present disclosure provides a process for obtaining soluble and functional rHSA protein, in the presence of the molecular chaperone Trigger Factor. The process results in 1.5-2.0 fold increase in expression level of rHSA protein as compared to protein levels obtained without the presence of the molecular chaperone. Further, it is observed that though the soluble fraction of the rHSA expressed in the بكتريا قولونية remains same in both the conditions (with or without chaperone assistance) i.e. 60%, there exists marked difference in the activity of the soluble fraction's functional content (FIG. 5). As has been demonstrated, the present process leads to 20-30% increase in functionally active soluble rHSA protein in the soluble fraction of rHSA when co-expressed along with the molecular chaperones as compared to when expressed alone in the بكتريا قولونية host system (Recently filed patent application, IP no. 201611027096).

The enhancement in the activity is credited to the employment of trigger factor system for rHSA production as Trigger factor (molecular chaperone) acts to prevent misfolding and aggregation reaction by transiently shielding the hydrophobic regions exposed in non-native polypeptides during and after translation. (Agashe et al., Cell (2009) 117:199-209).

Although the subject matter has been described with reference to specific embodiments, this description is not meant to be construed in a limiting sense. Various modifications of the disclosed embodiments, as well as alternate embodiments of the subject matter, will become apparent to persons skilled in the art upon reference to the description of the subject matter. It is therefore contemplated that such modifications can be made without departing from the spirit or scope of the present subject matter as defined.


شاهد الفيديو: هضم البروتين في المجترات (كانون الثاني 2022).