معلومة

2.10: تنظيم التعبير الجيني - علم الأحياء


مقدمة في تنظيم الجينات

التنظيم هو كل شيء عن اتخاذ القرار. في القسم التالي نناقش بعض الآليات والمبادئ الأساسية التي تستخدمها الخلايا لتنظيم التعبير الجيني استجابة للتغيرات في العوامل الخلوية أو الخارجية. هذه البيولوجيا مهمة لفهم كيفية تعديل الخلايا للبيئات المتغيرة ، بما في ذلك كيف تقرر بعض الخلايا ، في الكائنات متعددة الخلايا ، أن تصبح متخصصة في وظائف معينة (مثل الأنسجة).

نظرًا لأن موضوع التنظيم هو موضوع عميق جدًا وواسع للدراسة في علم الأحياء ، فإننا في Bis2a لا نحاول تغطية كل التفاصيل - فهناك ببساطة الكثير. بدلاً من ذلك ، كما فعلنا مع جميع الموضوعات الأخرى ، نحاول التركيز على (أ) تحديد بعض التركيبات المنطقية الأساسية والأسئلة التي يجب أن تكون لديك عندما تتعامل مع أي سيناريو يتضمن التنظيم ، (ب) تعلم بعض المفردات الشائعة والآليات في كل مكان و (ج) فحص بعض الأمثلة الملموسة التي توضح النقاط الواردة في أ و ب.

التعبير الجيني

مقدمة

تتحكم جميع الخلايا في وقت ومقدار التعبير عن كل من جيناتها. هذه العبارة البسيطة - التي يمكن اشتقاقها ببساطة من مراقبة السلوك الخلوي - تثير العديد من الأسئلة التي يمكننا البدء في وضعها باستخدام تحدي التصميم.

محاولة تعريف "التعبير الجيني"

ومع ذلك ، فإن أول شيء يتعين علينا القيام به هو تحديد ما يعنيه عندما نقول أن الجين "تم التعبير عنه". "التعبير" النهائي للجين هو تأثيره على النمط الظاهري. إذا كان الجين يشفر بروتينًا ، فقد يقترح المرء بشكل معقول أن "تعبير" الجين يعني مقدار البروتين الوظيفي الذي يتم تكوينه ، وأن قياس كمية هذا البروتين قد يكون مقياسًا جيدًا "للتعبير الجيني". يشير العديد من علماء الأحياء الجزيئية إلى مستوى نسخة هذا الجين على أنه وكيل يمكن قياسه بسهولة أو تعبيره. من خلال هذا التعريف ، قد يرغب المرء في حساب عدد النصوص الكاملة الموجودة في كل خلية. من الناحية العملية ، نجد غالبًا أن التعريف يعتمد على سياق المناقشة. ضع ذلك في الاعتبار. في Bis2A سنحاول استخدام مصطلح "تعبير" بشكل أساسي لوصف إنشاء المنتج (المنتجات) الوظيفية النهائية.

تحدي التصميم لتنظيم التعبير الجيني

لدفع هذه المناقشة من منظور تحدي التصميم ، يمكننا أن نوضح رسميًا أن "المشكلة الكبيرة" التي نهتم بها هي تلك المتعلقة بتنظيم وفرة البروتين في الخلية. المشكلة: يجب تنظيم وفرة كل بروتين وظيفي. يمكننا بعد ذلك البدء بطرح مشاكل فرعية:

لنأخذ لحظة ، مع ذلك ، أولاً لإعادة تحميل بعض الأفكار. تتطلب عملية التعبير الجيني خطوات متعددة حسب مصير المنتج النهائي. في حالة الحمض النووي الريبي الهيكلية والتنظيمية (أي الحمض الريبي النووي الريبي ، الرنا الريباسي ، إلخ) تتطلب العملية نسخ الجين وأن تتم أي معالجة مطلوبة بعد النسخ. في حالة الجين المشفر للبروتين ، يجب أيضًا ترجمة النسخة إلى بروتين ، وإذا لزم الأمر ، يجب أيضًا إجراء تعديلات على البروتين. بالطبع ، كل من النسخ والترجمة عمليات متعددة الخطوات ومعظم تلك الخطوات الفرعية هي أيضًا مواقع محتملة للتحكم.

لذلك قد تكون بعض المشكلات الفرعية:

  1. يجب أن تكون هناك آلية (آليات) معينة لتنظيم الخطوة الأولى من هذه العملية متعددة الخطوات ، بدء النسخ (مجرد بدء الأشياء). لذلك ، يمكننا القول ، "نحن بحاجة إلى آلية لتنظيم بدء النسخ." يمكننا أيضًا تحويل هذا إلى سؤال ونسأل ، "كيف يمكن البدء في النسخ"؟
  2. يمكننا استخدام تفكير مشابه لنقول ، "نحن بحاجة إلى آلية لتنظيم نهاية النسخ" أو نسأل "كيف يتم إنهاء النسخ؟" (نحن هنا نتحدث عن إيقاف نسخ الجين- إغلاق الجين ، وليس إنهاء- تحديد النوكليوتيد الأخير لجزيء معين)
  3. باستخدام هذه الاتفاقية يمكننا القول ، "نحتاج إلى تنظيم بدء الترجمة ووقف الترجمة". (مرة أخرى ، تبديل الترجمة لنوع معين من النص أو إيقاف تشغيله)
  4. لقد تحدثنا فقط عن تخليق البروتين والحمض النووي الريبي. من المعقول تمامًا أن نقول ، "نحن بحاجة إلى آليات لتنظيم تدهور الحمض النووي الريبي والبروتين."

التركيز على النسخ

في هذه الدورة ، نبدأ بالتركيز بشكل أساسي على فحص أول زوجين من المشاكل / الأسئلة ، وتنظيم بدء النسخ وإنهائه - من المعلومات الجينومية إلى الحمض النووي الريبي الوظيفي ، إما جاهزًا كما هو (على سبيل المثال في حالة RNA وظيفي) أو جاهز للترجمة. هذا يسمح لنا بفحص بعض المفاهيم الأساسية المتعلقة بتنظيم التعبير الجيني وفحص بعض الأمثلة الحقيقية لتلك المفاهيم في العمل.

اقترح مناقشة

لماذا من المهم تنظيم التعبير الجيني - لماذا لا يتم التعبير عن جميع الجينات فقط طوال الوقت؟ لماذا لديك إذا كنت لا تريد التعبير عنها؟

قم بإنشاء قائمة من الفرضيات مع زملائك في الفصل حول الأسباب التي تجعل تنظيم التعبير الجيني مهمًا للبكتيريا والعتائق ولحقيقيات النوى. بدلاً من البكتيريا مقابل حقيقيات النوى ، قد ترغب أيضًا في التفكير في أسباب متناقضة يعد تنظيم الجينات مهمًا للكائنات أحادية الخلية مقابل الكائنات متعددة الخلايا أو مجتمعات الكائنات أحادية الخلية (مثل مستعمرات البكتيريا).

تفعيل وقمع النسخ

بعض الأساسيات

دعونا نفكر في جين مشفر للبروتين ونعمل من خلال بعض المنطق. نحن نعلم أنه لنسخ هذا الجين ، يجب تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي في بداية منطقة الترميز. يجب أن تكون هناك آلية ما ، تعتمد على المنطق الكيميائي ، للمساعدة في تجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي في بداية جين ترميز البروتين. وبالمثل ، إذا كانت هذه العملية يجب تنظيمها ، فيجب أن تكون هناك آلية ، أو آليات ، لتحديد متى ينبغي تجنيد بوليميريز RNA في بداية الجين ، ومتى لا ينبغي ، و / أو إذا تم تجنيده إلى الحمض النووي ، سواء كان يجب أن يبدأ بالفعل النسخ أم لا وكم مرة يجب أن تحدث هذه العملية. لاحظ أن الجملة السابقة بها العديد من المشكلات الفرعية / الأسئلة المميزة (على سبيل المثال ، متى يتم تجنيد البوليميراز ؟، إذا تم تجنيده ، فهل يجب أن يبدأ النسخ؟ كم مرة يجب أن يحدث هذا؟). يمكننا أيضًا أن نستنتج بشكل معقول ، أنه ستكون هناك حاجة إلى بعض الآليات "لتوجيه" (المزيد من الأشكال البشرية) البوليميراز لإيقاف النسخ. أخيرًا ، نظرًا لأن دور النسخ هو إنشاء نسخ RNA من مقاطع الجينوم ، يجب علينا أيضًا النظر في المشكلات / الأسئلة المتعلقة بالعوامل الأخرى التي تؤثر على وفرة الحمض النووي الريبي ، مثل آليات التدهور. يجب أن تكون هناك آلية ما لكل خطوة من هذه الخطوات ، ويمكن أن يشارك أي منها في تنظيم هذه العملية.

مخطط يوضح الجين المشفر للبروتين وبعض الأسئلة أو المشكلات التي نحتاج إلى طرحها على أنفسنا أو بدلاً من ذلك ، نحتاج إلى معرفة حلول إذا أردنا أن نفهم كيف يتم تنظيم تنظيم الجزء النسخي من تعبير الجين. الإسناد: Marc T. Facciotti (عمل خاص)

تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي في مواقع محددة

لبدء النسخ ، يجب تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي في جزء من الحمض النووي بالقرب من بداية منطقة من الحمض النووي ترميز نسخة وظيفية. ومع ذلك ، فإن وظيفة بوليميراز الحمض النووي الريبي كما هو موصوف حتى الآن ، ليست ربط تسلسلات محددة ، بل التحرك على طول أي جزء من الحمض النووي. لذا فإن إيجاد طريقة لتجنيد البوليميراز في موقع معين يبدو متناقضًا مع سلوكه المعتاد ، والذي لا يُظهر تفضيلًا معينًا لتسلسل معين. يتطلب شرح هذا التناقض أن نستدعي شيئًا جديدًا. يمكن أن يبدأ النسخ في أي مكان ، وفقط تلك الأحداث التي تؤدي إلى نسخة إنتاجية كاملة تفعل أي شيء مفيد أو أي شيء آخر غير بوليميراز الحمض النووي الريبي نفسه يساعد في تجنيد الإنزيم في بداية الجين. هذا الأخير ، الذي نعتبره الآن أمرًا مفروغًا منه ، هو الحال بالفعل ، وهذا صحيح لكل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى.

يتم توظيف بوليميراز RNA بوساطة بروتينات تسمى عوامل النسخ العامة. في البكتيريا ، هذه تسمى عوامل سيجما.

في حقيقيات النوى ، تتضمن عوامل بدء النسخ العامة الهامة بروتين ربط TATA (TBP) و TFIIB ، والتي تعمل بالاقتران مع العديد من مجمعات البروتين الأخرى (لما يقرب من 100 بروتين) لتجنيد RNA polymerase II. تحمل أرشيا نسخة مجردة من هذا حقيقيات النوى مجمع preinitiation.

عوامل النسخ العامة لها وظيفتان أساسيتان على الأقل: (1) أنها (في حقيقيات النوى ، كمركب متعدد البروتينات) قادرة على التعرف كيميائيًا على تسلسل معين من الحمض النووي و (2) أنها قادرة على تحميل بوليميراز الحمض النووي الريبي في هذا الموقع . تعمل هاتان الوظيفتان معًا لعوامل النسخ العامة على حل مشكلة تجنيد إنزيم غير قادر على ربط محدد موقع الحمض النووي. في بعض النصوص ، يُقال أن عوامل النسخ العامة (وخاصةً أصناف عامل سيجما) هي جزء من بوليميريز الحمض النووي الريبي. بينما هم بالتأكيد جزء من المعقد عندما يساعدون في استهداف بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) ، إلا أنهم (عادةً) لا يستمرون في بوليميريز RNA بعد أن يبدأ النسخ. يتم تحميل كل بوليميريز RNA على مروج بواسطة عامل سيجما. قد يشفر الجينوم البكتيري عدة عوامل سيجما ، ويعبر عنها بشكل تفاضلي في ظل ظروف مختلفة ، ونتيجة لذلك يتم اختيار مجموعة مختلفة من المحفزات لمساعدة البكتيريا على التكيف مع تلك الظروف.

يُطلق على موقع الحمض النووي الذي يتم تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي إليه اسم أ المروجين. بينما لا يلزم أن تكون متواليات الحمض النووي للمروجين المختلفين متطابقة تمامًا ، فإن تسلسلات المحفز المختلفة عادة ما يكون لها بعض الخصائص الكيميائية الخاصة المشتركة. من الواضح أن إحدى الخصائص هي أنها قادرة على الارتباط بعوامل النسخ العامة المذكورة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي المروج عادةً على تسلسل DNA يسهل تفكك الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بحيث يمكن للبوليميراز البدء في نسخ منطقة التشفير. (ملاحظة: من الناحية الفنية ، كان بإمكاننا تقسيم خصائص المروج إلى مشكلات فرعية لتحدي التصميم. في هذه الحالة ، تخطينا ذلك ، ولكن لا يزال بإمكانك الرجوع إلى الوراء وإنشاء بيانات المشكلة و / أو الأسئلة ذات الصلة بمجرد معرفة المروجين ).

في جميع الحالات تقريبًا ، ولكن بشكل خاص في الأنظمة حقيقية النواة ، يمكن لمجمع البروتينات التي تتجمع مع بوليميراز الحمض النووي الريبي في المحفزات (التي تسمى عادةً مجمع ما قبل البدء) أن تصل إلى عشرات البروتينات. كل من هذه البروتينات الأخرى له وظيفة محددة ولكن هذا بعيد جدًا عن الكثير من التفاصيل للتعمق فيها من أجل Bis2A.

نموذج لمركب ما قبل البدء بالإشريكية القولونية. عامل سيجما ملون باللون الأحمر. يُصوَّر الحمض النووي على أنه أنابيب برتقالية وأزرق متعارض: قواعد خضراء. تم تلوين باقي مجمع ما قبل البدء باللون الوردي. لاحظ أن الحمض النووي يحتوي على مناطق من الحلزون المزدوج وهيكل مفتوح داخل الموافقة المسبقة عن علم. الإسناد: هيكل مشتق من إحداثيات PDB (4YLN) Marc T. Facciotti (العمل الخاص)

دول المروج المنظم

نظرًا لأن المروجين يجندون بوليميريز RNA ، فإن هذه المواقع وتجميع مجمع ما قبل البدء هي مواقع واضحة لتنظيم الخطوات الأولى للتعبير الجيني. على مستوى بدء النسخ ، غالبًا ما نصنف المروج إلى فئة واحدة من ثلاث فئات. الأول يسمى التأسيسي. لا يتم تنظيم المروجين التأسيسي بشكل عام بشدة. حالة قاعدتهم "على". عندما يكون النسخ التأسيسي من أحد المروجين مرتفعًا جدًا (بالنسبة إلى معظم المروجين الآخرين) ، فسوف نسمي هذا المروج بالعامية المروج "التأسيسي القوي". على النقيض من ذلك ، إذا كان مقدار النسخ من المروج التأسيسي منخفضًا (بالنسبة إلى معظم المروجين الآخرين) فسوف نطلق على هذا المروج المروج "الضعيف التأسيسي".

طريقة ثانية لتصنيف المروجين باستخدام المصطلح مفعل أو مكافئ، الناجم عن. تُستخدم هذه المصطلحات القابلة للتبديل لوصف المروجين التي تكون حساسة لبعض المحفزات الخارجية وتستجيب للحافز المذكور عن طريق زيادة النسخ. المروجين المنشطون لديهم حالة أساسية بشكل عام لا يُظهر سوى القليل من النسخ. ثم يتم "تنشيط" النسخ استجابةً لمحفز - يقوم الحافز بتشغيل "المروج".

أخيرًا ، المصطلح الثالث المستخدم لتصنيف المروجين هو استخدام المصطلح مكبوت. تستجيب هذه المحفزات أيضًا للمنبهات ولكنها تفعل ذلك عن طريق تقليل النسخ. الحالة الأساسية لهذه المحفزات هي مستوى أساسي من النسخ ويعمل التحفيز على رفض أو قمع النسخ. يتم "كبت" النسخ استجابةً لمحفز - يُوقف المحفز المثير.

تفترض الأمثلة المذكورة أعلاه أن حافزًا واحدًا يعمل على تنظيم المروجين. في حين أن هذه أبسط حالة ، فقد يقوم العديد من المروجين بدمج أنواع مختلفة من المعلومات ويمكن تنشيطها بالتناوب بواسطة بعض المحفزات وقمعها بواسطة محفزات أخرى.

تساعد عوامل النسخ على تنظيم سلوك المروج

كيف المروجين حساسين للمنبهات الخارجية؟ في كل من التنشيط والقمع ، يتطلب تنظيم الجينات من البروتينات تغيير الناتج النسخي للجين الذي يتم ملاحظته. تسمى البروتينات المسؤولة عن المساعدة في تنظيم التعبير عوامل النسخ. غالبًا ما تسمى متواليات الحمض النووي المحددة المرتبطة بعوامل النسخ المشغلين وفي كثير من الحالات يكون المشغلون قريبين جدًا من تسلسل المحفز.

اقتراح: صِف الفرق بين "عامل النسخ" ، كما هو موضح أعلاه مباشرةً ، و "عامل النسخ العام" الموصوف سابقًا.

هنا حيث من المحتمل أن تكون التسمية مربكة - لا سيما عند المقارنة عبر الأبحاث البكتيرية وحقيقية النواة. في

البحوث البكتيرية

، إذا كان عامل النسخ يعمل عن طريق ربط DNA و RNA polymerase بطريقة تزيد من النسخ ، فإنه عادةً ما يسمى المنشط. على النقيض من ذلك ، إذا كان عامل النسخ يعمل عن طريق ربط الحمض النووي لقمع أو تقليل نسخ الجين ، فإنه يسمى كاظمة.

لماذا من المحتمل أن تكون تصنيفات المنشط والقمع مشكلة؟ تصف هذه المصطلحات وظائف فردية مثالية. في حين أن هذا قد يكون صحيحًا في حالة بعض عوامل النسخ ، فقد تعمل عوامل النسخ الأخرى في الواقع على تنشيط التعبير الجيني في بعض الحالات أثناء القمع في حالات أخرى. ستعمل بعض عوامل النسخ ببساطة على تعديل التعبير إما لأعلى أو لأسفل اعتمادًا على السياق بدلاً من إيقاف "إيقاف" النسخ أو "تشغيله" تمامًا. للتحايل على بعض هذا الالتباس المحتمل ، يفضل بعض المدرسين تجنب استخدام المصطلحين المنشط والقمع وبدلاً من ذلك يفضلون مناقشة نشاط النسخ المختلفة لعوامل النسخ إما كتأثير إيجابي أو سلبي على التعبير الجيني في حالات محددة. إذا تم استخدام هذه المصطلحات ، فقد تسمع معلمك يقول إن عامل النسخ المعني يتصرف مثل / كمنشط أو أنه يعمل كمنشط ، مع الحرص على عدم تسميته مجرد منشط أو مانع. ومع ذلك ، فمن المرجح أن تسمعهم يقولون إن عامل النسخ يؤثر إيجابًا أو سلبًا على النسخ.

اقترح مناقشة

ما أنواع التفاعلات التي تعتقد أنها تحدث بين الأحماض الأمينية لعامل النسخ واللولب المزدوج للحمض النووي؟ كيف تتعرف عوامل النسخ على موقع ارتباطها على الحمض النووي؟

المُعدِّلات الخيفية للبروتينات التنظيمية

يمكن تعديل نشاط العديد من البروتينات ، بما في ذلك البروتينات التنظيمية وعوامل النسخ المختلفة ، من خلال عوامل مختلفة ، بما في ذلك الوفرة النسبية للجزيئات الصغيرة في الخلية. غالبًا ما يشار إلى هذه الجزيئات الصغيرة باسم المحرضات أو القامع المشترك أو المنشطات وغالبًا ما تكون مستقلبات ، مثل اللاكتوز أو التربتوفان أو الجزيئات التنظيمية الصغيرة ، مثل cAMP أو GTP. تسمح هذه التفاعلات لـ TF بالاستجابة للظروف البيئية وتعديل وظيفتها وفقًا لذلك. إنه يساعد في اتخاذ قرار بشأن نسخ الجين أم لا اعتمادًا على وفرة الإشارة البيئية.

دعونا نتخيل منظم نسخ سلبي. في أبسط الحالات التي درسناها حتى الآن ، سيكون نسخ الجين مع موقع ربط لعامل النسخ هذا منخفضًا عندما يكون TF موجودًا ومرتفعًا عند غياب TF. يمكننا الآن إضافة جزيء صغير إلى هذا النموذج. في هذه الحالة ، يكون الجزيء الصغير قادرًا على ربط منظم النسخ السلبي من خلال مجموعات من الروابط الهيدروجينية والأيونية التكميلية. في هذا المثال الأول ، سوف نأخذ في الاعتبار الحالة التي يؤدي فيها ارتباط الجزيء الصغير بـ TF إلى تغيير تكوين في TF مما يقلل بشدة من قدرته على ربط الحمض النووي. إذا كان هذا هو الحال ، فإن المنظم السلبي - بمجرد ربطه بجزيئه الصغير - سوف ينطلق من الحمض النووي. هذا من شأنه أن يخفف التأثير السلبي ويؤدي إلى زيادة النسخ. قد يكون هذا المنطق التنظيمي مناسبًا للتطور في السيناريو التالي: جزيء صغير من المواد الغذائية عادة ما يكون غائبًا عن البيئة. لذلك ، فإن الجينات التي تشفر الإنزيمات التي ستتحلل / تستخدم هذا الطعام يجب أن تبقى "متوقفة عن العمل" معظم الوقت للحفاظ على الطاقة الخلوية التي سيستخدمها تركيبها. يمكن تحقيق ذلك من خلال عمل منظم النسخ السلبي. عندما تظهر المواد الغذائية في البيئة ، سيكون من المناسب التعبير عن الإنزيمات المسؤولة عن معالجتها. يمكن أن تعمل المادة الغذائية بعد ذلك من خلال الارتباط بالمنظم السلبي ، وتغيير شكل TF ، مما يتسبب في إطلاقه من الحمض النووي وبالتالي تشغيل نسخ إنزيمات المعالجة.

نموذج تجريدي لوحدة نسخ عامة ينظمها منظم سلبي يتم تعديل نشاطه بواسطة جزيء صغير (يصوره نجم). في هذه الحالة ، يؤدي ارتباط الجزيء الصغير إلى إطلاق TF من الحمض النووي. Facciotti (العمل الخاص)

يمكننا النظر في نموذج ثان لكيفية تفاعل TF ذو التأثير السلبي مع جزيء صغير. في هذه الحالة ، فإن فريق العمل وحده غير قادر على ربط موقعه التنظيمي بالحمض النووي. ومع ذلك ، عندما يرتبط جزيء صغير بـ TF ، يحدث تغيير توافقي يعيد توجيه الأحماض الأمينية المرتبطة بالحمض النووي إلى الاتجاه "الصحيح" لربط الحمض النووي. يرتبط معقد الجزيء الصغير TF الآن بالحمض النووي ويعمل على التأثير سلبًا على النسخ.

نموذج تجريدي لوحدة نسخ عامة ينظمها منظم سلبي يتم تعديل نشاطه بواسطة جزيء صغير (يصوره نجم). في هذه الحالة ، يؤدي ارتباط الجزيء الصغير إلى ارتباط TF بالحمض النووي. Facciotti (العمل الخاص)

لاحظ كيف يمكن تعديل نشاط TF بطرق مختلفة بوضوح بواسطة جزيء صغير.اعتمادًا على منطق النظام التنظيمي ، يمكن أن يتسبب ارتباط هذه الإشارة الخارجية إما في ارتباط معقد الجزيء الصغير TF بالحمض النووي أو يمكن أن يتسبب ارتباط الجزيء الصغير في إطلاق معقد الجزيء الصغير TF من الحمض النووي. يمكن عمل نفس الأنواع من الأمثلة لمنظم إيجابي (حاول إنشاء واحد ، ورسم المكونات).

في كلتا الحالتين المقترحتين أعلاه ، سيعتمد ارتباط جزيء صغير بـ TF على مدى قوة تفاعل TF مع الجزيء الصغير. سيعتمد هذا على الأنواع والتوجه المكاني للمجموعات الوظيفية الكيميائية للبروتين والمجموعات الوظيفية التكميلية على الجزيء الصغير. لذلك لا ينبغي أن يكون مفاجئًا معرفة أن ارتباط الجزيء الصغير بـ TF سيعتمد على عوامل مختلفة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تركيز الجزيء الصغير و TF.

هل عامل النسخ منظم إيجابي أم سلبي؟

حل نقطة ارتباك مشتركة

في هذه المرحلة ، ليس من غير المألوف أن يشعر العديد من طلاب Bis2a بالارتباك قليلاً حول كيفية تحديد ما إذا كان عامل النسخ يعمل كمنظم إيجابي أم سلبي. غالبًا ما يأتي هذا الالتباس بعد مناقشة الأنماط المحتملة التي يمكن أن يؤثر فيها التحفيز (أي الجزيء الصغير) على نشاط عامل النسخ. هذا لايدعو للمفاجأة. في الأمثلة أعلاه ، يمكن أن يكون لربط جزيء المستجيب بعامل النسخ أحد تأثيرين مختلفين: (1) يمكن أن يؤدي ارتباط جزيء المستجيب إلى عامل نسخ مرتبط بالحمض النووي

إفراج

من موقع الربط الخاص به ، وإزالة الضغط على المروج ، و

تحول على

التعبير الجيني. (2) يمكن ربط جزيء المستجيب بعامل النسخ

تسبب في ربط TF

إلى موقع ارتباط الحمض النووي الخاص به ، مما يؤدي إلى قمع المحفز وبالتالي

ايقاف

التعبير الجيني. في الحالة الأولى ، قد يبدو أن الجزيء الصغير يعمل على تنظيم التعبير بشكل إيجابي لأنه يمنع النشاط الكيميائي الحيوي لـ TF (قدرته على ربط تسلسل معين وبالتالي منع تحميل البوليميراز) ، بينما في المثال الثاني الجزيء الصغير ينشط النشاط الكيميائي الحيوي لـ TF (مرة أخرى ، ارتباط DNA الخاص بالتسلسل الذي يمنع تحميل البوليميراز).

في كلا المثالين أعلاه ، يعمل صندوق التمويل كمنظم سلبي. لتحديد هذا

ننظر إلى ما يحدث عندما يرتبط TF بالحمض النووي

(سواء كان جزيء صغير مرتبطًا بـ TF أم لا). في كلتا الحالتين ، يؤدي ربط TF إلى DNA إلى كبح النسخ. ولذلك فإن صندوق الائتمان يعمل كمنظم سلبي. يمكن إجراء تحليل مماثل باستخدام TFs ذات التأثير الإيجابي - أي TFs التي تساعد على تعزيز تحميل البوليميراز عند المروج و / أو بدء النسخ.

لاحظ أنه في بعض الحالات ، قد يعمل TF كمنظم إيجابي في مروج واحد ومنظم سلبي في مروج مختلف ، لذا فإن وصف سلوك TF على أساس كل حالة مهم غالبًا (قراءة الكثير من الاسم الذي تم تعيينه يمكن أن تكون مضللة في بعض الأحيان). يمكن أن يعمل بروتين TF الآخر بالتناوب كمنظمين إيجابيين أو سالبين لنفس المروج حسب الظروف. مرة أخرى ، يُنصح بوصف سلوك فريق العمل على وجه التحديد لكل حالة. في هذا الفصل نحاول تجنب هذه الأمثلة الأكثر تعقيدًا.

اختبار جيني للوظيفة التنظيمية الإيجابية أو السلبية لـ TF

كيف يمكن تحديد ما إذا كان البروتين التنظيمي يعمل بطريقة إيجابية أم سلبية؟ الاختبار الجيني البسيط هو السؤال "ماذا يحدث للتعبير إذا كان البروتين التنظيمي غائبًا؟" يمكن تحقيق ذلك عن طريق إزالة الجين المشفر لعامل النسخ من الجينوم. إذا كان عامل النسخ يعمل بشكل إيجابي ، فإن وجوده مطلوب لتفعيل النسخ. في غيابه ، لا يوجد بروتين تنظيمي ، وبالتالي لا يوجد تنشيط ، والنتيجة هي مستويات نسخ أقل للجين المستهدف. والعكس صحيح بالنسبة لعامل النسخ الذي يتصرف بشكل سلبي. في حالة غيابه ، يجب زيادة التعبير ، لأن الجين الذي يحافظ على التعبير منخفضًا لم يعد موجودًا.

إنهاء النسخ وتدهور الحمض النووي الريبي

تدهور الحمض النووي الريبي

يمكن أن تختلف فترات حياة أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي في الخلية بشكل كبير ، من ثوانٍ إلى ساعات. يمكن أن يختلف متوسط ​​عمر الرنا المرسال بشكل كبير اعتمادًا على الكائن الحي. على سبيل المثال ، متوسط ​​عمر mRNA في بكتريا قولونية حوالي 5 دقائق. يبلغ عمر النصف من الرنا المرسال في الخميرة حوالي 20 دقيقة و 600 دقيقة للخلايا البشرية. بعض التدهور "مستهدف". أي أن بعض النصوص تتضمن تسلسلًا قصيرًا يستهدفها لإنزيمات RNA المهينة ، مما يسرع من معدل التحلل. لا يتطلب الأمر الكثير من الخيال لاستنتاج أن هذه العملية يمكن أيضًا ضبطها تطوريًا لجينات مختلفة. مجرد إدراك أن التحلل - وضبط التدهور - يمكن أن يكون أيضًا عاملاً في التحكم في تعبير الجين كافٍ لـ Bis2a.

ملخص تنظيم الجينات

لقد درسنا في النص السابق عدة طرق للبدء في حل بعض تحديات التصميم المرتبطة بتنظيم كمية النسخ التي يتم إنشاؤها لمنطقة ترميز واحدة من الجينوم. لقد نظرنا في المصطلحات المجردة في بعض العمليات المسؤولة عن التحكم في بدء النسخ ، وكيف يمكن جعلها حساسة للعوامل البيئية ، وبإيجاز شديد في العمليات التي تنهي النسخ وتعالج التدهور النشط للحمض النووي الريبي. لقد تجنبنا المزيد من كل من هذه العمليات يمكن ضبطها من الناحية الكمية بطبيعتها لتكون "أقوى" أو "أضعف". من المهم إدراك أن القيم الحقيقية لـ "القوة" (مثل قوة المروج ، ومعدلات التدهور ، وما إلى ذلك) تؤثر على سلوك العملية الكلية بطرق يحتمل أن تكون مهمة وظيفيًا.

أمثلة على تنظيم الجينات البكتيرية

يصف هذا القسم مثالين على تنظيم النسخ في البكتيريا. يتم تقديم هذه كأمثلة توضيحية. استخدم هذه الأمثلة لمعرفة بعض المبادئ الأساسية حول آليات تنظيم النسخ. كن على اطلاع في الفصل وفي المناقشة وفي أدلة الدراسة للحصول على امتدادات لهذه الأفكار واستخدمها لشرح الآليات التنظيمية المستخدمة لتنظيم الجينات الأخرى.

أمثلة على تنظيم الجينات في بكتريا قولونية

عادة ما يتم تنظيم الحمض النووي للبكتيريا والعتائق في كروموسومات دائرية واحدة أو أكثر في السيتوبلازم. يسمى التجميع الكثيف للحمض النووي الذي يمكن رؤيته في الصور المجهرية الإلكترونية بالجهاز النووي. في البكتيريا والعتائق ، غالبًا ما يتم تجميع الجينات ، التي يحتاج تعبيرها إلى تنسيق محكم (على سبيل المثال ، الجينات التي ترميز البروتينات التي تشارك في نفس المسار الكيميائي الحيوي) معًا بشكل وثيق في الجينوم. عندما يتم التحكم في التعبير عن جينات متعددة بواسطة نفس المروج ويتم إنتاج نسخة واحدة ، يتم استدعاء وحدات التعبير هذه أوبرا. على سبيل المثال ، في البكتيريا Escherschia coli يتم ترميز جميع الجينات اللازمة لاستخدام اللاكتوز بجانب بعضها البعض في الجينوم. يسمى هذا الترتيب اللاكتوز (أو لاك) مشغل. غالبًا ما يحدث في البكتيريا والعتائق أن ما يقرب من 50 ٪ من جميع الجينات يتم ترميزها في أوبرا لجينين أو أكثر.

دور المروج

المستوى الأول من السيطرة على التعبير الجيني هو في المروج نفسه. يقوم بعض المروجين بتجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA) ويحولون أحداث ربط بروتين الدنا إلى نسخ أكثر كفاءة من المحفزات الأخرى. يشار إلى هذه الخاصية الجوهرية للمروج ، وهي قدرته على إنتاج نسخة بمعدل معين ، على أنها قوة المروج. كلما كان المروج أقوى ، زاد إنتاج الحمض النووي الريبي في أي فترة زمنية معينة. يمكن "ضبط" قوة المروج بواسطة الطبيعة بخطوات صغيرة جدًا أو كبيرة جدًا عن طريق تغيير تسلسل المحفز للنيوكليوتيدات (مثل تحوير المحفز). ينتج عن هذا عائلات من المحفزات ذات نقاط القوة المختلفة التي يمكن استخدامها للتحكم في الحد الأقصى لمعدل التعبير الجيني لجينات معينة.

اتصال جامعة كاليفورنيا في ديفيس الجامعية

استخدمت مجموعة من طلاب جامعة كاليفورنيا في ديفيس المهتمين بالبيولوجيا التركيبية هذه الفكرة لإنشاء مكتبات ترويج اصطناعي للميكروبات الهندسية كجزء من مشروع تصميمهم لمسابقة iGEM لعام 2011.

المثال رقم 1: Trp Operon

منطق تنظيم التخليق الحيوي للتربتوفان

بكتريا قولونية، مثل جميع الكائنات الحية ، تحتاج إما إلى تصنيع أو استهلاك الأحماض الأمينية من أجل البقاء. الأحماض الأمينية التربتوفان هو أحد هذه الأحماض الأمينية. E. القولونيةيمكن إما استيراد التربتوفان من البيئة (تناول ما يمكنه تنظيفه من العالم من حوله) أو تصنيع التربتوفان من جديد باستخدام إنزيمات مشفرة بخمس جينات. يتم ترميز هذه الجينات الخمسة بجانب بعضها البعض في بكتريا قولونية الجينوم إلى ما يسمى ب التربتوفان (trp) مشغل (الشكل أدناه). إذا كان التربتوفان موجودًا في البيئة ، إذن بكتريا قولونية لا يحتاج إلى توليفها والمفتاح الذي يتحكم في تنشيط الجينات في trp تم إيقاف تشغيل operon. ومع ذلك ، عندما يكون توافر التربتوفان البيئي منخفضًا ، يتم تشغيل المفتاح الذي يتحكم في الأوبون ، ويبدأ النسخ ، ويتم التعبير عن الجينات ، ويتم تصنيع التربتوفان. انظر الشكل والفقرات أدناه للحصول على شرح آلي.

تنظيم trp أوبرون

يتم ترتيب خمس مناطق جينومية ترميز إنزيمات التخليق الحيوي للتربتوفان بالتتابع على الكروموسوم وهي تحت سيطرة مروج واحد. يتم ترميز جميع الإنزيمات الخمسة بواسطة نسخة واحدة - يتم تنظيمها في ملف أوبرون. فقط قبل منطقة الترميز هي موقع بدء النسخ. هذا ، كما يوحي الاسم ، هو المكان الذي يبدأ فيه بوليميراز الحمض النووي الريبي نسخة جديدة. تسلسل المروج هو مزيد من المنبع من موقع بدء النسخ.

يتم أيضًا ترميز تسلسل DNA يسمى "المشغل" بين المحفز والأول trp جين الترميز. هذه المشغل أو العامل هو تسلسل الحمض النووي الذي سيرتبط به بروتين عامل النسخ التنظيمي.

بعض التفاصيل الإضافية المتعلقة بمواقع ربط TF

وتجدر الإشارة إلى أن استخدام مصطلح "المشغل" يقتصر على عدد قليل من الأنظمة التنظيمية ويشير دائمًا تقريبًا إلى موقع الربط لعامل النسخ الذي يعمل بشكل سلبي. من الناحية المفاهيمية ، ما تحتاج إلى تذكره هو أن هناك مواقع على الحمض النووي تتفاعل مع البروتينات التنظيمية مما يسمح لها بأداء وظيفتها المناسبة (مثل قمع أو تنشيط النسخ). سيتكرر هذا الموضوع عالميًا عبر علم الأحياء سواء تم استخدام مصطلح "المشغل" أم لا.

علاوة على ذلك ، في حين أن الأمثلة المحددة التي ستعرضها تصور مواقع ربط TF في مواقعها المعروفة ، فإن هذه المواقع ليست عالمية لجميع الأنظمة. يمكن أن تختلف مواقع ربط عامل النسخ في الموقع بالنسبة إلى المروج. هناك بعض الأنماط (على سبيل المثال ، غالبًا ما تكون الجهات التنظيمية الإيجابية في مقدمة المروج والهيئات التنظيمية السلبية ترتبط بالمجرى) ، ولكن هذه التعميمات ليست صحيحة بالنسبة لجميع الحالات. مرة أخرى ، الشيء الأساسي الذي يجب تذكره هو أن عوامل النسخ (سواء كانت إيجابية أو سلبية) لها مواقع ارتباط تتفاعل معها للمساعدة في تنظيم بدء النسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي.

توجد الجينات الخمسة اللازمة لتخليق التربتوفان في الإشريكية القولونية بجوار بعضها البعض في أوبرون trp. عندما يكون التربتوفان وفيرًا ، يرتبط جزيئان من التربتوفان بعامل النسخ ويسمحان لمركب TF-tryptophan بالارتباط عند تسلسل المشغل. هذا يمنع فعليًا بوليميريز الحمض النووي الريبي من نسخ جينات التخليق الحيوي للتربتوفان. عندما يكون التربتوفان غائبًا ، لا يرتبط عامل النسخ بالمشغل ويتم نسخ الجينات. Facciotti (العمل الخاص).

تنظيم trp أوبرون

عندما يكون التربتوفان موجودًا في الخلية فإنه يرتبط بـ trp بروتين مثبط. عندما يرتبط التربتوفان بعامل النسخ هذا ، فإنه يتسبب في تغيير توافقي في البروتين الذي يسمح الآن لمركب TF-tryptophan بالارتباط بـ trp تسلسل المشغل. إن ارتباط معقد التربتوفان - المكبّر عند المشغل يمنع فيزيائيًا بوليميراز الحمض النووي الريبي من الارتباط ونسخ جينات المصب. عندما لا يكون التربتوفان موجودًا في الخلية ، لا يرتبط عامل النسخ بالمشغل ؛ لذلك ، يستمر النسخ ، يتم نسخ جينات استخدام التربتوفان وترجمتها ، وبالتالي يتم تصنيع التربتوفان.

نظرًا لأن عامل النسخ يرتبط بشكل فعال بالمشغل للحفاظ على إيقاف تشغيل الجينات ، فإن trp يقال أن الأوبرا "منظم بشكل سلبي". البروتينات التي ترتبط بالمشغل لإسكات trp التعبير المنظمين السلبيين.

اقترح مناقشة

هل تعتقد أن تعبير البروتين trp repressor منظم بواسطة trp ، أم أن البروتين يتم التعبير عنه بشكل أساسي؟

مناقشة الاقتراح

لنفترض أن الطبيعة اتخذت نهجًا مختلفًا لتنظيم عامل trp. صمم طريقة لتنظيم التعبير عن مشغل trp بمنظم إيجابي بدلاً من منظم سلبي. (المحفز: يسأل الأساتذة هذا النوع من الأسئلة طوال الوقت في الامتحانات)

رابط خارجي

شاهد هذا الفيديو لمعرفة المزيد عن trp أوبرون.

المثال الثاني: ملف لاك أوبرون

الأساس المنطقي لدراسة لاك أوبرون

في هذا المثال ، ندرس تنظيم الجينات التي تشفر البروتينات التي يتمثل دورها الفسيولوجي في استيراد واستيعاب اللاكتوز ثنائي السكاريد ، لاك أوبرون. قصة تنظيم لاك operon هو مثال شائع يستخدم في العديد من فصول البيولوجيا التمهيدية لتوضيح المبادئ الأساسية لتنظيم الجينات المحرض. اخترنا وصف هذا المثال ثانيًا لأنه ، في تقديرنا ، أكثر تعقيدًا من المثال السابق الذي يتضمن نشاط عامل نسخ واحد يعمل بشكل سلبي. على النقيض من ذلك ، فإن تنظيم لاك يعتبر Operon ، في رأينا ، مثالًا رائعًا على كيفية استخدام النشاط المنسق لكل من المنظمين الإيجابي والسلبي حول نفس المروج لدمج مصادر مختلفة متعددة للمعلومات الخلوية لتنظيم التعبير عن الجينات.

أثناء استعراض هذا المثال ، ضع في اعتبارك النقطة الأخيرة. بالنسبة لمعظم مدربي Bis2a ، من المهم بالنسبة لك فهم كيفية منطق لاك Operon من حفظ جدول الإدخال / الإخراج المعروض أدناه. تتمثل فائدة فهم منطق تنظيم الجينات في أنه يمكن تطبيق المفاهيم على العديد من الأنظمة التنظيمية المختلفة. قد ينعكس هذا الهدف على الامتحانات.

استخدام اللاكتوز

اللاكتوز هو ثنائي السكاريد يتكون من الجلوكوز والسداسي الجالاكتوز. يوجد بشكل شائع في الوفرة العالية في الحليب وبعض منتجات الألبان. كما يمكن للمرء أن يتخيل ، يمكن أن يكون السكاريد مادة غذائية مهمة للميكروبات القادرة على استخدام سداسييها. القولونية قادر على استخدام العديد من السكريات المختلفة كمصادر للطاقة والكربون ، بما في ذلك اللاكتوز و لاك أوبرون هو هيكل يشفر الجينات اللازمة لاكتساب اللاكتوز ومعالجته من البيئة المحلية. ومع ذلك ، لم يتم مواجهة اللاكتوز بشكل متكرر بكتريا قولونية خلال تطورها وبالتالي جينات لاك يجب عادةً قمع أوبرون (أي "إيقاف") عند غياب اللاكتوز. يؤدي نسخ هذه الجينات عند غياب اللاكتوز إلى إهدار الطاقة الخلوية الثمينة. على النقيض من ذلك ، عندما يكون اللاكتوز موجودًا ، سيكون من المنطقي أن يتم التعبير عن الجينات المسؤولة عن استخدام السكر (أي "قيد التشغيل"). القصة حتى الآن مشابهة لقصة أوبرون التربتوفان الموصوف أعلاه. باستثناء ... يجب على الخلية التعرف على وجود جزيء صغير (اللاكتوز) بحيث يمكنه التبديل تشغيل إنتاج إنزيم لتحطيمه (وآخر لنقله إلى الخلية). في مشغل trp ، يجب أن تكون الخلية التعرف على وجود جزيء صغير (trp) لذلك يمكن التبديل إيقاف إنتاج الإنزيمات التي تنتجها.

سؤال: في كلتا الحالتين يتم استخدام بروتين مثبط. كيف يكون هذا ممكنا ، عندما يتم تحقيق نتائج متعارضة؟

ومع ذلك، هناك كمية الصيد. التجارب التي أجراها جاكوب ومونود في الخمسينيات أثبتت ذلك بوضوح بكتريا قولونية يفضل استخدام كل الجلوكوز الموجود في البيئة قبل أن يبدأ في استخدام اللاكتوز. هذا يعني أن الآلية المستخدمة لتقرير ما إذا كان يجب التعبير عن جينات استخدام اللاكتوز أم لا يجب أن تكون قادرة على دمج نوعين من المعلومات (1) تركيز الجلوكوز و (2) تركيز اللاكتوز. بينما يمكن تحقيق ذلك نظريًا بطرق متعددة ، فسوف نفحص كيف يمكن لاك ينجز Operon هذا باستخدام عوامل النسخ المتعددة.

المنظمون النسخ من لاك أوبرون

ال لاك مثبط - جهاز استشعار مباشر للاكتوز

كما لوحظ ، فإن لاك أوبرون عادة ما يكون منخفضًا جدًا أو لا ينتج نسخًا في حالة عدم وجود اللاكتوز. هذا يرجع إلى عاملين: (1) قوة المروج التأسيسية للأوبون منخفضة نسبيًا و (2) يؤثر الوجود المستمر لبروتين مثبط LacI سلبًا على النسخ. يرتبط هذا البروتين بموقع المشغل بالقرب من المروج ويمنع بوليميريز الحمض النووي الريبي من نسخ لاك جينات الأوبيرون. على النقيض من ذلك ، في حالة وجود اللاكتوز ، سيرتبط اللاكتوز ببروتين LacI ، مما يؤدي إلى تغيير تكوين يمنع مركب LacI-lactose من الارتباط بمواقع الارتباط الخاصة به. لذلك ، عندما يكون اللاكتوز موجودًا ، فإن اللاكتوز التنظيمي السلبي غير مرتبط بموقع الارتباط الخاص به ويمكن أن يستمر نسخ الجينات التي تستخدم اللاكتوز.

بروتين CAP - جهاز استشعار غير مباشر للجلوكوز

في بكتريا قولونية، عندما تنخفض مستويات الجلوكوز ، الجزيء الصغير AMP دوري (cAMP) يبدأ في التراكم في الخلية. cAMP هو جزيء إشارات شائع يشارك في استقلاب الجلوكوز والطاقة في العديد من الكائنات الحية. عندما تنخفض مستويات الجلوكوز في الخلية ، تسمح التركيزات المتزايدة لـ cAMP لهذا المركب بالارتباط بمنظم النسخ الإيجابي المسمى بروتين منشط الكاتابوليت (CAP) - يشار إليها أيضًا باسم CRP. يحتوي مجمع CAMP-CAP على العديد من المواقع الموجودة في جميع أنحاء بكتريا قولونية يقع الجينوم والعديد من هذه المواقع بالقرب من محفزات العديد من العوامل التي تتحكم في معالجة السكريات المختلفة.

في ال لاك operon ، يقع موقع ربط cAMP-CAP في بداية المروج. يساعد ربط cAMP-CAP بالحمض النووي على تجنيد بوليميريز RNA والاحتفاظ به في المروج. يؤدي زيادة شغل بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى مروجها ، بدوره ، إلى زيادة ناتج النسخ. في هذه الحالة ، يعمل بروتين CAP كمنظم إيجابي.

لاحظ أن مجمع CAP-cAMP يمكن ، في عوامل أخرى ، أن يعمل أيضًا كمنظم سلبي اعتمادًا على مكان موقع ربط مجمع CAP-cAMP بالنسبة إلى موقع ربط RNA polymerase.

وضع كل ذلك معًا: حث التعبير عن أوبرون lac

بالنسبة إلى لاك تفعيل الاوبون ، يجب استيفاء شرطين. أولاً ، يجب أن يكون مستوى الجلوكوز منخفضًا جدًا أو غير موجود. ثانيًا ، يجب أن يكون اللاكتوز موجودًا. فقط عندما يغيب الجلوكوز ويوجد اللاكتوز لاك أوبرون يتم نسخها.عندما تتحقق هذه الحالة ، يفصل مجمع LacI-lactose المنظم السلبي عن قرب المحفز ، ويحرر بوليميريز RNA لنسخ جينات الأوبرا. علاوة على ذلك ، يؤدي ارتفاع مستويات cAMP (التي تدل بشكل غير مباشر على انخفاض الجلوكوز) إلى تكوين مركب CAP-cAMP. يرتبط زوج محفز TF هذا الآن بالقرب من المروج ويعمل على تجنيد بوليميريز RNA بشكل إيجابي. هذا التأثير الإيجابي الإضافي يعزز إنتاج النسخ ويمكن استخدام اللاكتوز بكفاءة. يتم وصف المخرجات الآلية للتركيبات الأخرى من حالات الجلوكوز واللاكتوز الثنائية في الجدول أدناه وفي الشكل التالي.

جدول الحقيقة لـ Lac Operon: الإشارات التي تحفز أو تقمع نسخ lac Operon
يربط CAPاللاكتوزالقامع يربطالنسخ
+--+لا
+-+-بعض وليس كثيرا
-+-+لا
-++-نعم الكثير

يتم تنظيم نسخ أوبرون اللاكتوز بعناية بحيث يحدث تعبيره فقط عندما يكون الجلوكوز محدودًا ويكون اللاكتوز موجودًا ليكون بمثابة مصدر بديل للوقود.
الإسناد: Marc T. Facciotti (عمل خاص)


تنظيم التعبير عن جينات snRNA المنسوخة ببوليميراز RNA البشري

بالإضافة إلى جينات ترميز البروتين ، يقوم RNA polymerase II (pol II) بنسخ العديد من الجينات لـ RNAs غير المشفرة ، بما في ذلك جينات RNA الصغيرة النووية (sn). تعد snRNAs فئة مهمة من RNAs غير المشفرة ، والعديد منها يشارك في الربط المسبق للرنا المرسال. تتميز الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعبير عن جينات snRNA البشرية المنقولة بواسطة pol II بأنها أقل تميزًا من جينات ترميز البروتين ، وهناك اختلافات مهمة في التعبير عن هذين النوعين من الجينات. هنا ، نراجع ميزات الحمض النووي والبروتينات المطلوبة للنسخ الفعال لجينات snRNA والتكوين المشترك للنسخ 3-end للنصوص.

1 المقدمة

إن بوليميريز الحمض النووي الريبي II (بوليميراز II) مسؤول عن نسخ جميع الجينات المكوِّدة للبروتين البالغ عددها 25000 أو نحو ذلك في الجينوم البشري. يتم نسخ العديد من RNAs غير المشفرة ، بما في ذلك RNA الريبوزومي (r) ، ونقل (t) RNA ، و 7SK RNA الذي ينظم استطالة النسخ بواسطة pol II ، و spliceosomal U6 و U6atac النووية الصغيرة (sn) يتم نسخها بواسطة pol I أو pol III [1-4]. ومع ذلك ، يتم نسخ الرنا الميكروي غير المشفر والرنا النووي الصغير (sno) و snRNAs المتبقية بواسطة pol II [2،5،6]. SnRNAs عبارة عن رنا قصير (أقل من 350 نانومتر) يرتبط بالبروتينات لتكوين جزيئات بروتين نووي نووي صغيرة (snRNPs) [6].

نظرًا لأدوارها في الربط المسبق لـ mRNA ، فإن snRNAs U1 و U2 و U4 و U4atac و U5 و U11 و U12 pol II مطلوبة للتعبير عن جينات ترميز البروتين المحتوية على intron. يتضمن spliceosome الرئيسي U1 و U2 و U4 و U5 و U6 snRNPs ويتعرف على مواقع لصق GT / AG الأساسية التي تحيط بالإنترونات للتجميع بطريقة تدريجية مع pre-mRNA. بعض الإنترونات محاطة بدلاً من ذلك بمواقع لصق AT / AC ، والتي تقوم بتجنيد جزيء لصق صغير يحتوي بدلاً من ذلك على U11 و U12 و U4atac و U5 و U6atac snRNPs [7]. U7 snRNA مطلوب من أجل تشكيل ثلاثي نهاية للهيستون المنشط بالنسخ المتماثل [8] و U3 sn (o) RNA مطلوب لمعالجة الرنا الريباسي [9].

2. عناصر تسلسل الحمض النووي المتضمنة في التعبير عن جينات snRNA المنقولة بواسطة pol II

على الرغم من أن وظائف snRNAs مفهومة جيدًا ، إلا أن تنظيم تعبيرها لا يزال غير مميز بشكل كامل. تمتلك جينات snRNA البشرية بنية محفز أبسط بكثير من معظم جينات ترميز البروتين ، وهذا يشتمل على عنصر تسلسل بعيد (DSE) يعمل كمحسِّن وعنصر تسلسل قريب خاص بجين snRNA (PSE) وهو المروج الأساسي [2 ، 10،11] (الشكل 1). النسخ غير عديمة الأدينيلات وغير عديد الأدينيلات ، ويوجه 3-box تشكيل نهاية 3-من pre-snRNA ، والتي تتم معالجتها بشكل أكبر لإنتاج snRNA الناضج [10].

الشكل 1. التعبير عن جينات snRNA البشرية. عنصر التسلسل البعيد (DSE) وعنصر التسلسل القريب (PSE) هما عنصران محسن ومحفز ، على التوالي. المربع 3 هو عنصر معالجة الحمض النووي الريبي الخاص بجين snRNA. يمثل السهم موقع بدء النسخ وتشير الأرقام الموجودة أسفل السطر إلى الموضع التقريبي للعناصر فيما يتعلق بموقع بدء النسخ. يشتمل DSE على موقع الربط ATTTGCAT في أكتوبر 1 ، وثلاثة مواقع ربط Sp1 (G / T) (G / A) GGCG (G / T) (G / A) (G / A) (G / T) [13] و موقع ملزم للموظفين YY (A / T) CCC (A / G) N (A / C) AT (G / C) C (A / C) YYRCR [14]. تسلسل توافق تسلسل PSE هو TCACCNTNA (G / C) NNNAA (A / T) (G / A) N [2]. تسلسل الإجماع للمربع 3 هو GTTYN0-3أرياجا [15]. يتم تمثيل نسخة snRNA باللون الأخضر مع الغطاء في النهاية 5. يتم تصدير pre-snRNA إلى السيتوبلازم للنضج بواسطة 3 نهاية تشذيب ، غطاء ثلاثي الميثيل والتجميع مع بروتينات snRNP [6]. لوحظت وظائف snRNPs المختلفة بعد إعادة الاستيراد إلى النواة.

في الفقاريات ، يتم حفظ جينات snRNAs الرئيسية (U1 و U2 و U4 و U5) بشكل جيد باستخدام متواليات DSE و PSE و 3-box التي يمكن التعرف عليها [2] ، و ذبابة الفاكهة تحتوي جينات snRNA أيضًا على تسلسلات تشبه PSE [16]. غالبًا ما توجد جينات snRNA للفقاريات في نسخ متعددة. على سبيل المثال ، هناك أربع نسخ من جين U1 snRNA / جينوم أحادي الصبغة البشرية) [17] و 15 نسخة من جين U2 snRNA / جينوم أحادي الصيغة الصبغية البشرية) [18]. في المقابل ، فإن جينات snRNAs الصغرى (U11 و U12 و U4atac) عادة ما تكون جينات نسخة واحدة وهي مفقودة في العديد من اللافقاريات بما في ذلك Cnidaria و Annelida [19].

ميزة مهمة لجينات snRNA هي الاقتران الإلزامي بين عنصر معالجة RNA 3-box واستبدال محفز الجينات snRNA لمحفز جينات snRNA بمحفز لجين ترميز البروتين يؤدي إلى فشل تكوين نهاية RNA 3 [ 15،20].

تحتوي الجينات المنقولة من pol III لـ 7SK snRNA و U6 snRNA أيضًا على DSE و PSE ، ولكن بالإضافة إلى ذلك ، لديهم صندوق TATA عند −25 [2]. يؤدي وضع مربع TATA في اتجاه مصب PSE في جين snRNA نسخ pol II إلى تحويل النسخ من pol II إلى pol III [2] ، مع التأكيد على أن DSE و PSE يمكنهما العمل كعناصر مؤثرة لـ cis لأي من البوليميراز.

هنا ، نراجع ما هو معروف حاليًا عن التعبير عن جينات snRNA البشرية التي تم نسخها بواسطة pol II والآفاق المستقبلية لفهم كامل للآليات المعنية.

3. عوامل النسخ المرتبطة بجينات snRNA

ترتبط عوامل النسخ Oct1 و Sp1 و NF1 و Staf بالتسلسلات في DSE ، والتي لها خصائص مُحسِّن النسخ [2،21]. يعزز Oct1 التعبير الجيني للـ snRNA عن طريق تثبيت الارتباط لبروتين ربط PSE / عامل النسخ المرتبط بـ PSE / مركب البروتين المنشط snRNA ، PTF (المعروف أيضًا باسم PBP و SNAPc) [12،22،23] ، إلى PSE لكلا القطبين II - وجينات snRNA المنقولة بواسطة pol II من خلال التفاعل المباشر [12،24،25]. في المقابل ، يساعد PTF في تجنيد بروتين ربط TATA (TBP) والعوامل المرتبطة بـ TBP (TAFs) التي تشكل مركب snRNA TAF (snTAFc) إلى جينات snRNA المنقولة بواسطة pol II [22،26،27]. إن snTAFc على جين U2 snRNA ، والذي يتألف من TAF5 و TAF6 و TAF8 و TAF9 و TAF11 و TAF13 [27] ، هو مجموعة فرعية من TAFs الموجودة في TFIID ، وهو المركب المحتوي على TBP / TAF والمطلوب لنسخ العديد من ترميز البروتين. الجينات [28]. ومع ذلك ، يبدو أن جينات snRNA U1 و U4 و U5 و U11 لها مركب TAF مختلف ، والذي يتضمن TAF7 [29]. قد يساعد TAF7 في تجنيد المركب الوسيط الكبير متعدد الوحدات ، وهو أمر ضروري للنسخ الفعال لجينات snRNA [29]. تورط TAF7 أيضًا في تنظيم هروب المروج (انظر أدناه). ومع ذلك ، يبدو أن TAF7 غائب عن جينات U2 snRNA [27] ، مما يشير إلى أن هذه الجينات تستخدم آلية مختلفة لتجنيد الوسيط وهروب المروج. عوامل النسخ الجيني العامة لترميز البروتين TFIIA و TFIIB و TFIIE و TFIIF و TFIIH مطلوبة أيضًا لنسخ جينات snRNA [30،31]. يوضح الشكل 2 العوامل المشتركة بين جينات snRNA وجينات ترميز البروتين والعوامل الخاصة بكل فئة من فئات الجينات. كما هو مذكور أعلاه ، فإن DSE و PSE قابلان للتبادل بين جينات snRNA المنسوخة pol II و pol III [2]. ومع ذلك ، في ظل وجود صندوق TATA في المحفز ، يتم تجنيد مركب يحتوي على جزيء TBP خاص بالجين pol III- و snRNA [2].

الشكل 2. العوامل التي تنظم التعبير عن snRNA وجينات ترميز البروتين. باللون الأزرق هي العوامل التي لها أدوار في نفس حدث النسخ في كلا فئتي الجينات. باللونين الوردي والأصفر ، هناك عوامل تنفرد بها جينات ترميز البروتين وجينات snRNA ، على التوالي. تظهر العوامل التي تنظم كلا الجينين ولكن بخطوات مختلفة باللون الأرجواني [22 ، 24 ، 26-55].

هناك دليل على أن النواة بين DSE و PSE في جينات snRNA U1 و U2 و 7SK و U6 تجمع هاتين المنطقتين معًا ، مما يسهل التفاعل بين أكتوبر 1 و PTF [56-59]. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب PTF دورًا في استنفاد الهستونات من وحدة النسخ لجين U2 [32]. وبالتالي ، تلعب بنية الكروماتين دورًا في تنظيم التعبير عن جينات snRNA البشرية. يتم تنظيم التعبير عن جين U6 snRNA المنسوخ في pol III من خلال تفاعل بروتين مشارك في تعديل الكروماتين ، وهو بروتين ربط chromodomain-helicase-DNA 8 (CHD8) ، مع Staf [60]. كما ثبت أن CHD8 يتفاعل أيضًا مع الشكل المطول للبول II [60] ، فإنه قد ينظم أيضًا نسخ جينات snRNA المنسوخة للبول II.

4. فسفرة المجال الطرفي للكربوكسيل Pol II والتعبير الجيني snRNA

أكبر وحدة فرعية للثدييات pol II لها مجال طرفي كربوكسيل (CTD) يشتمل على 52 تكرارًا للإجماع على سباعي الببتيد Y1س2ص3تي4س5ص6س7. أثناء النسخ ، تساعد الفسفرة في CTD على تجنيد عوامل النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي في النقطة الصحيحة من دورة النسخ [61].

يتم فسفرة Ser7 أثناء نسخ جميع الجينات البشرية. ومع ذلك ، يبدو أن الفسفرة ضرورية فقط للتعبير عن جينات snRNA [33]. يتم فسفرة كل من Ser5 و Ser7 بواسطة الوحدة الفرعية kinase 7 المعتمدة على cyclin (CDK7) لـ TFIIH بعد وقت قصير من بدء النسخ [34] ويتوسط phospho-Ser7 (Ser7P) توظيف الفوسفاتاز الفوسفاتي Ser5 (Ser5P) RPAP2 [62]. RPAP2 ليس فقط مزيلات الفسفرة Ser5P بعد وقت قصير من بدء النسخ ولكنه يساعد أيضًا في تجنيد الوحدات الفرعية Int1 و Int4 و Int5 و Int6 و Int7 من مجمع متكامل متعدد الوحدات [62]. يتكون مجمع التكامل الكامل من 14 وحدة فرعية وهو مسؤول عن التعرف على انقسام 3 box و RNA الذي ينتج ما قبل snRNA [35]. ومع ذلك ، فإن الوحدة الفرعية الحفزية Int11 غائبة عندما يرتبط Integrator بـ RPAP2 [62] ، ومن المحتمل أيضًا أن يكون Int9 غائبًا لأنه يتفاعل بقوة مع Int11 [63]. الوحدة الفرعية كيناز CDK9 لعامل استطالة النسخ الإيجابي ب (P-TEFb) ، والتي تشارك في التعبير عن كل من جينات ترميز البروتين وجينات snRNA ، فسفوريلات Ser2 (Ser2P) من pol II CTD [61] و Ser7 تقوم الفسفرة Ser2 و Ser2 معًا بتجنيد الوحدات الفرعية المفقودة Int9 / 11 لتنشيط التعرف على 3 مربعات ومعالجة نهاية RNA 3 [64]. وفقًا لذلك ، فإن مثبطات CDK9 لها تأثير جذري على معالجة 3 نهاية للنسخ الجينية snRNA [36]. يظهر تسلسل الأحداث هذا في الشكل 3.

الشكل 3. أحداث الفسفرة Pol II CTD في نسخ الجينات snRNA. في البداية ، الوحدة الفرعية كيناز (CDK) 7 المعتمدة على السيكلين من TFIIH فسفوريلات Ser5 و Ser7. يتفاعل RPAP2 مع Ser7P. يقوم RPAP2 بدوره بتجنيد الوحدات الفرعية Integrator Int1 و Int4 و Int5 و Int6 و Int7. يتم تجنيد RPAP2 dephosphorylates Ser5P ، ويتم تجنيد عامل استطالة النسخ الإيجابي ب (P-TEFb) بواسطة آلية لا تزال غير معروفة. الوحدة الفرعية P-TEFb CDK9 فسفوريلاتس Ser2. تقوم الفسفرة المزدوجة على Ser2 و Ser7 بتجنيد Int9 / 11 ، مما يسمح بحدوث معالجة RNA [62].

يمكن أيضًا فسفرة Ser2 بواسطة CDK12 [65،66] وتؤثر ضربة قاضية CDK12 على التعبير الجيني لـ snRNA [67]. الفسفرة لعامل تحفيز حساسية DRB (DSIF) وعامل الاستطالة السلبي (NELF) بواسطة P-TEFb مطلوبان أيضًا للاستطالة المنتجة لجينات ترميز البروتين [37،38،68]. ومع ذلك ، فإن مثبطات CDK9 لها تأثير ضئيل على نسخ الجينات U1 و U2 [39].

بعد الشروع في نسخ الجينات المشفرة للبروتين ، يتم تجنيد آلية السد إلى نهاية 5 من النسخة الوليدة ويتم تنشيطها بشكل خيفي بواسطة Ser5P [69]. نظرًا لأن النسخ الجينية لـ snRNA يتم تحديدها أيضًا بشكل متزامن [70] ، فمن المحتمل أن يضمن Ser5P أيضًا تغطية ما قبل snRNAs.

5. دور الوسيط في التعبير عن جينات snRNA

تمت دراسة ارتباط مجمع الوسيط الكبير المكون من 26 وحدة فرعية بجينات ترميز البروتين جيدًا. يتم تجنيد هذا المركب في مجمع ما قبل البدء (PIC) ويمكن أن يرتبط بعدة عوامل نسخ في نفس الوقت. الوسيط له دور مهم كمنصة ملزمة للتفاعل بين عوامل النسخ المرتبطة بالتسلسلات في محفزات جينات ترميز البروتين والبول II [40].

يتكون مجمع Mediator من وحدات ، مع وحدة الرأس التي تضم الوحدات الفرعية Med6 و Med8 و Med11 و Med17 و Med18 و Med20 و Med22 [71]. وحدة الرأس مسؤولة عن التفاعل مع pol II CTD من خلال Med17 [72]. Med17 هي وحدة فرعية على "أنف" وحدة الرأس بينما تقع Med18 و Med20 على "الفك". من المتوقع حدوث طفرة في حلزون ألفا من Med18 لتقوية التفاعل بين الفك وبقية الوحدة. لذلك يُعتقد أن الفك هو العنصر المتحرك الذي ينظم الارتباط بـ pol II CTD [71]. قد يكون لهذه المرونة أيضًا دور في التفاعلات بين الوسيط والبول II وأيضًا بين عوامل الوسيط والنسخ مثل TFIIH [73] و TBP [74].

تم وصف ارتباط الوحدات الفرعية الوسيطة بجينات snRNA لأول مرة فقط مؤخرًا. ترتبط Med1 و Med23 و Med26 بمجموعة فرعية من جينات snRNA (U1 و U4 و U5) وبمستويات أعلى بكثير من المنطقة المحفزة لبعض جينات ترميز البروتين [29]. ومع ذلك ، فإن تجارب ChIP لم تحدد منطقة جينات snRNA المرتبطة بالوسيط. Med26 مطلوب للتعبير عن جينات U1 و U2 و U4 و U5 و U11 [29] وهو ضروري لتوظيف معقد الاستطالة الصغير (LEC) [29]. ومن المثير للاهتمام أن Med26 يتفاعل أيضًا مع TAF7 ، الذي يقمع البدء ويمنع تجنيد LEC. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي TAF7 على تشابه في تسلسل البروتين مع EAF ، والذي يعد جزءًا من LEC. وفقًا لذلك ، تم اقتراح أن القوات المسلحة المصرية يمكنها انتزاع Med26 من TAF7 لتسهيل الاستطالة [29]. لذلك قد يعمل Med26 كمفتاح جزيئي يؤدي إلى الاستطالة بعد هروب المحفز ، على الأقل بالنسبة لجينات snRNA حيث يتم تجنيد TAF7.

6. مجمع الاستطالة الصغير واستطالة النسخ

يتم تنظيم التعبير الجيني ليس فقط عند بدء النسخ ، ولكن أيضًا أثناء الاستطالة. يتوقف Pol II مؤقتًا بعد وقت قصير من بدء نسخ جينات ترميز البروتين عند نقطة تفتيش استطالة مبكرة (EEC) بسبب عوامل الاستطالة السلبية ، NELF و DSIF. فسفرة pol II CTD و NELF و DSIF بواسطة الوحدة الفرعية CDK9 من P-TEFb تطلق pol II من المجموعة الاقتصادية الأوروبية للسماح باستطالة منتجة [68]. مركب يسمى مجمع الاستطالة الفائق (SEC) الذي يشتمل على عامل الاستطالة ELL و AFF1 و AFF4 و AF9 و ENL و P-TEFb يشارك في الاستطالة المنتجة لنسخ جينات ترميز البروتين [41].

بدلاً من SEC ، ينظم مركب آخر يحتوي على ELL على وجه التحديد استطالة نسخ جينات snRNA المنسوخة لـ pol II. يتألف LEC هذا من ELL و ICE1 و ECE2 و EAF و ZC3H8 [42]. لقد تم اقتراح أن يتم تجنيد ICE1 و ICE2 و ELL و EAF إلى المروج بواسطة مجمع Mediator [29]. لقد ثبت أن ICE1 هي الدعامة لتشكيل LEC وهي ضرورية لتوظيف المكونات الأخرى. يتفاعل ELL مع المجال الطرفي ICE1 N ، بينما يتفاعل ICE2 و ZC3H8 مع المجال الطرفي ICE1 C. بالإضافة إلى ذلك ، مطلوب ICE1 لتجنيد pol II [42]. تؤدي ضربة قاضية ELL إلى تغيير توزيع pol II على جينات snRNA نحو النهاية 5 ، كما هو متوقع من عامل يسهل استطالة النسخ [75]. لقد تم اقتراح أن ELL ضروري لضمان مستوى عالٍ من نسخ جينات snRNA [75]. وظيفة الوحدتين الفرعيتين ICE2 و ZC3H8 غير معروفة حاليًا.

لقد ثبت أن LEC يتأرجح مع coilin [42] ، والذي يوجد في أجسام Cajal ، حيث يحدث نضوج بروتين نووي نووي صغير (snRNP) [6]. يقوم ICE1 بتجنيد بروتين آخر ، USPL1 ، لأجسام Cajal. يتفاعل USPL1 أيضًا مع U1 و U2 snRNPs وتؤدي ضربة قاضية له إلى انخفاض مستويات snRNA [43]. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية الكامنة وراء تأثير ضربة قاضية USPL1 غير واضحة.

في الآونة الأخيرة ، تبين أن 7SK snRNP ، التي تتألف من 7SK RNA و MePCE و Larp7 ، تلعب دورًا في تجنيد LEC لجينات snRNA. الضربة القاضية لمكونات 7SK RNP تعطل سلامة LEC ، وتؤثر على توظيف pol II وتقلل من التعبير عن جينات snRNA [76]. كان هذا اكتشافًا مفاجئًا لأن 7SK RNP هو منظم سلبي لمركب CTD Ser2 kinase P-TEFb [68].

7. معقد التكامل وجينات snRNA

تم اكتشاف مجمع Integrator مؤخرًا أكثر من Mediator. إنه موجود فقط في metazoans وهو مجمع كبير من 14 وحدة فرعية وهو مطلوب للمعالجة 3 نهاية للنسخة السابقة من snRNAs المنقولة من pol II في البشر والذباب [33 ، 35 ، 44].

التكامل قادر على ربط pol II CTD فسفرته على كل من Ser2 و Ser7 [64]. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح أي الوحدات الفرعية تشارك في التعرف على Ser2P و Ser7P. Int11 هو نظير لـ CPSF-73 ، وهو المسؤول عن انقسام الحمض النووي الريبي الموجه بواسطة مواقع بولي (A) وإشارة معالجة الحمض النووي الريبي في هيستون المنشط قبل الرنا المرسال [77]. يؤدي استنفاد Int11 إلى تراكم snRNAs قبل U1 وما قبل U2 [32،35] ، وهو ما يتفق مع الدور التحفيزي المتوقع لهذه الوحدة الفرعية.

حتى الآن ، لم يتم العثور على وحدات التكامل الفرعية للتفاعل مباشرة مع الكروماتين. ومع ذلك ، تحتوي الوحدة الفرعية Int12 على مجال PHD (المجال المنزلي للنبات) ، وهو نموذج شائع للربط بالكروماتين يتعرف على الهيستونات الميثيلية [78]. الوحدتان الفرعيتان Int3 و Int6 هما أيضًا جزء من معقد آخر يشارك في الكشف عن فواصل حبلا مزدوجة للحمض النووي ، تسمى مستشعر الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل (SOSS) [79-83]. نظرًا لأن جينات snRNA يتم التعبير عنها بشكل كبير واستنفاد جين U2 snRNA على الأقل من الهستونات الكنسية [45] ، فقد تم اقتراح أن هذه الوحدات الفرعية التكاملية يمكن أن تساعد في منع تلف الحمض النووي الذي يتم تسهيله من خلال حالة الكروماتين المفتوحة بشكل أساسي [84].

تم العثور على Int5 مرتبطًا بكل من منطقة المروج الجيني snRNA و 3 box ، بينما يرتبط Int11 بشكل أساسي بالمربع 3 [62]. وبالتالي ، قد يكون المُدمج مجمعًا معياريًا يتجمع بطريقة تدريجية ، مع بعض الوحدات الفرعية التي تلعب دورًا مبكرًا في النسخ ، بينما ينشط البعض الآخر في معالجة نهاية RNA 3.

لقد ثبت أن Int4 يتفاعل مع NELF-A ويتفاعل Int6 مع الوحدة الفرعية Spt5 من DSIF [46]. في التعبير عن جينات snRNAs ، تم اقتراح DSIF لربط pol II قبل استطالة النسخ [46]. وبالتالي يمكن تجنيد عامل التكامل عن طريق الفسفرة pol II CTD وبالاشتراك مع DSIF.يمكن أن يساهم تجنيد NELF من خلال التفاعل مع RNA و Integrator في التعرف على 3 box من خلال منع توظيف عامل تحفيز الانقسام (CstF) متعدد الأدينيل [46]. ستسمح هذه الأحداث بعد ذلك للمتكامل بمعالجة نسخة snRNA الوليدة بشكل صحيح [46].

حتى وقت قريب كان يُعتقد أن Integrator معقد معالجة خاص بـ snRNA ، ولكن ثبت الآن أنه ينظم أيضًا التعبير عن جينات ترميز البروتين [47-49]. يتم تنظيم التعبير عن الجينات المبكرة الفورية (IEGs) التي يتم تنشيطها بواسطة عامل نمو البشرة (EGF) عن طريق التوقف المؤقت قبل الاستطالة ويتم التغلب على هذا التوقف المؤقت بواسطة تحريض EGF. ينظم الاستقراء EGF توظيف Integrator ، والذي يقوم بدوره بتجنيد SEC [47]. يلعب التكامل أيضًا دورًا في إطلاق التوقف المؤقت الذي تم إجراؤه بواسطة NELF أثناء نسخ الجينات البشرية وجينوم فيروس نقص المناعة البشرية [48 ، 49]. ومن المثير للاهتمام ، أن الجينات البشرية المستهدفة من قبل Integrator تمتلك 3 متواليات تشبه الصندوق بالقرب من نهاية الجينات ، وتظهر انخفاضًا في مستويات النسخ عند ضربة قاضية Int11 ، مما يشير إلى أن Int11 متورط أيضًا في إنتاج mRNA [48]. لذلك يبدو أن عامل التكامل يلعب أدوارًا رئيسية في التعبير عن جينات ترميز البروتين.

8. 3 ′ مربع وإنهاء نسخ الجينات snRNA

المربع 3 هو إشارة لمعالجة نسخ snRNA الوليدة ويستمر pol II في النسخ لبضع مئات من الأزواج الأساسية بعد المربع 3 قبل إنهاء النسخ [39]. كما ذكرنا سابقًا ، يربط Integrator DSIF و NELF و pol II ، ويتعرف على إشارة 3-box على RNA ويعالج النسخة الوليدة. يرتبط تكوين نهاية ما قبل snRNA 3 وإنهاء نسخ pol II على جينات snRNA ارتباطًا جوهريًا ، كما هو موضح في دراسة حديثة تسببت فيها ضربة قاضية للوحدتين الفرعيتين التحفيزيتين Int9 و Int11 في حدوث عيوب إنهاء [32]. NELF تشارك أيضًا في الإنهاء. إنه يتراكم في اتجاه المصب من 3 مربع من جين U2 snRNA وتؤدي ضربة قاضية أيضًا إلى حدوث خلل في الإنهاء [45]. يقع موقع ربط CTCF بالقرب من منطقة ارتباط NELF ، ويحدد منطقة مستنفدة للنيوكليوزوم تغطي وحدة النسخ [45]. يُعرف CTCF بأنه عامل النسخ لجينات ترميز البروتين من خلال عمله كعامل عازل ومنظم لبنية الكروماتين [85]. لقد ثبت أن CTCF يضع النوكليوسومات ويعيق استطالة القطب الثاني [50،86]. من خلال التصرف بهذه الطريقة ، يمكن لـ CTCF التحكم في بنية الكروماتين واستنباط إنهاء النسخ. لذلك قد تحتوي جينات U2 snRNA على نقطة تفتيش استطالة "متأخرة" حيث تبطئ النيوكليوزومات الموضوعة في CTCF pol II ، مما يسمح لـ NELF بإنهاء النسخ [45].

بالاتفاق مع هذه النتائج ، تشير دراسة حديثة إلى تورط CTCF في توظيف DSIF و NELF و P-TEFb في جين U2 snRNA [51]. تشير النتائج إلى نموذج يربط إنهاء النسخ بالتعرف على المربع 3. في هذا النموذج ، NELF مطلوب لإنهاء النسخ ، حيث ينتج عن الضربة القاضية عيوب إنهاء دون التأثير على تجنيد CTCF أو تشكيل نهاية RNA 3. بالإضافة إلى ذلك ، فسفرة P-TEFb pol II CTD على Ser2 ، مما يؤدي إلى توظيف الوحدات الفرعية Integrator 9/11 ، والتي يمكن أن تستخرج معالجة RNA مدفوعة بالصندوق 3 [51]. سيشرح هذا النموذج كيف يرتبط إنهاء النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي بإحكام أثناء التعبير عن جينات snRNA (الشكل 4).

الشكل 4. نموذج لإنهاء النسخ من جين U2 snRNA. يتم تمثيل نسخة snRNA باللون الأخضر مع الغطاء في النهاية 5 ويتم تمثيل النيوكليوسومات بالبراميل. يستمر Pol II في النسخ بعد المربع 3-box ويعالج Integrator RNA الناشئ بعد التعرف على 3-box. يتعرف CTCF على موقع ربط CTCF في اتجاه مجرى المربع 3 ويتحكم في إشغال النواة. يتم تجنيد عامل الاستطالة السالب (NELF) بواسطة عامل تحفيز حساسية DRB (DSIF) و CTCF في نهاية وحدة النسخ ويسبب إنهاء النسخ [51].

ومن المثير للاهتمام أن عوامل المعالجة النهائية لـ mRNA 3 Pcf11 و Ssu72 و Cstf64 ترتبط أيضًا بجينات snRNAs [32]. ومع ذلك ، فقد ثبت أن Pcf11 و Ssu72 يؤثران على إنهاء نسخ جينات snRNA بدلاً من المعالجة ثلاثية الأطراف.

9. اقتران بدء وتشكيل RNA 3 ′ نهاية

يتم التعرف على المربع 3 فقط إذا بدأ النسخ من محفز جيني snRNA المعتمد على pol II [15،20]. إذا تم استبدال PSE بمحفز جيني مشفر للبروتين ، تصبح النصوص أطول حيث يتم تجاهل إشارة 3-box ويتم نسخ pol II حتى يتم الوصول إلى موقع وظيفي متعدد الأدينيل [87]. لا تزال الآلية الكامنة وراء اقتران بدء النسخ وتشكيل نهاية RNA 3 غير مفهومة ولكنها قد تتضمن عامل المروج الخاص بجين snRNA أو مكونات جينات snRNA الخاصة بـ LEC. بدلاً من ذلك ، قد يتم التعرف على المربع 3 فقط في حالة عدم تعيين SEC.

10. الجينات الزائفة snRNA وجينات snRNA المتغيرة

باستثناء teleosts والطيور ، فإن جميع metazoans التي تمت دراستها حتى الآن لديها جينات خادعة مشتقة من جينات snRNA ، حيث تمتلك الثدييات عددًا كبيرًا [19]. تم إثبات أن بعض التسلسلات في الجينوم البشري التي كان يُعتقد سابقًا أنها جينات U1 snRNA الزائفة هي جينات حقيقية لها تسلسلات DSE و PSE و 3-box قابلة للتمييز ويتم نسخها بنشاط [17]. تم تسمية هذه الجينات بالجينات المتغيرة (v) U1 [17،88]. ومع ذلك ، تختلف تسلسلات DSE و PSE و 3-box لجينات vU1 snRNA بشكل كافٍ عن تسلسل الجينات U1 snRNA للإشارة إلى أنها منظمة بشكل تفاضلي. ومن المثير للاهتمام أن vU1 snRNAs يبدو أنه يتم التعبير عنه بشكل كبير في الخلايا الجذعية الجنينية [17]. U1b هو جين متغير للفأر U1 يتم التعبير عنه فقط في المراحل الجنينية المبكرة ، على الرغم من اختلاف snRNAs U1 و U1b بسبعة تغييرات أساسية فقط [89،90]. ومع ذلك ، يختلف مروج U1b اختلافًا كبيرًا عن محفز U1 [90]. على الرغم من أن وظيفة U1b لا تزال غير واضحة ، إلا أن هناك أوجه تشابه واضحة بين الماوس U1b و vU1 snRNAs البشري.

U5 المتغيرات snRNA في الإنسان و ذبابة الفاكهة كما تم وصفها [91،92]. المتغيرات تشكل مجمعات snRNP وظيفية مختلفة من المتعارف عليه U5 snRNP ويعتقد أنها تلعب أدوارًا في الربط [91]. ومن المثير للاهتمام ، أن المتغيرات U5 يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي أثناء التطور وقد تعزز التضفير الخاص بنسيج معين [92].

11. الخلاصة

تم تمييز دور عوامل النسخ العامة ، فسفرة CTD ومركب التكامل في التعبير عن جينات snRNA بشكل جيد في العقدين الماضيين. يوضح التوضيح الأخير لأدوار DSIF و CTCF و NELF في التعبير عن جينات snRNA كيف ترتبط المعالجة الثلاثية لنصوص snRNA بإنهاء النسخ. أيضًا ، تم إثبات أن عوامل المعالجة النهائية لـ mRNA 3 مثل Pcf11 و Ssu72 متورطة في إنهاء نسخ جينات snRNA. يمكننا الآن أن ندرك أن هناك العديد من عوامل النسخ التي تشترك فيها جينات ترميز البروتين وجينات snRNA ، على الرغم من أن بعضها يلعب أدوارًا مميزة في التعبير عن نوعي الجينات (الشكل 2).

على الرغم من كل هذه المعلومات الجديدة ، لا تزال هناك بعض الجوانب المهمة للتعبير عن جينات snRNA المنقولة بواسطة pol II والتي لا يزال يتعين توضيحها. على سبيل المثال ، كيف يكون الشروع في نسخ هذه الجينات مقترنًا بإحكام بتشكيل ثلاثي الأطراف للنصوص؟ لماذا يتم تنظيم التعبير الجيني U2 snRNA بواسطة آليات مختلفة عن جينات U1 و U4 و U5 snRNA؟ لماذا تتطلب جينات snRNA مركب استطالة معين يتم تجنيده بواسطة RNA غير مشفر؟ هل يختلف المركب الوسيط في جينات snRNA عن المركب الموجود في جينات ترميز البروتين؟ ولماذا ينشط بروتين معاملات فيروس الهربس VP16 فقط نسخ جينات تشفير البروتين وليس جينات snRNA [93] عندما يحدث التنشيط من خلال التفاعل مع TAF9 [94] و TFIIA [95]؟ ومع ذلك ، يتفاعل VP16 أيضًا مع Med25 [96] وليس من الواضح حاليًا ما إذا كان يتم تجنيده في جينات snRNA.

نأمل أن يوفر البحث المستقبلي الإجابات اللازمة لفهم كامل لتنظيم التعبير عن هذه الفئة المهمة من الجينات المنسوخة للبول II.

تضارب المصالح

نعلن أنه ليس لدينا مصالح متنافسة.

التمويل

ج. حصل على دعم من منحة علوم بلا حدود من CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) (201323/2015) من الحكومة البرازيلية. م. كان مدعومًا بجائزة Wellcome Trust Senior Investigator Award (WT106134AIA).


مناصب قيادية المجموعة

المعهد الأوروبي للكيمياء والبيولوجيا ، المعهد الأوروبي للشيخوخة والبيولوجيا (IECB، www.iecb.u-bordeaux.fr) هي حاضنة فريق بحثي وضعت تحت وصاية مشتركة من جامعة بوردو ، CNRS و INSERM. تستفيد من البيئة العلمية الفعالة لحرم بوردو في جنوب غرب فرنسا. عادة ما تكون فترة حضانة الفريق 10 سنوات ، ويتم اختيار الفرق من قبل مجلس استشاري علمي دولي. يستضيف المعهد حاليًا 14 مجموعة بحثية تعمل على تطوير مشاريعها البحثية في واجهة الكيمياء والبيولوجيا. يبحث IECB عن مرشحين أقوياء لشغل مناصب قيادية المجموعة ، مع إعطاء الأولوية للملفات التعريفية التالية:

واحد أو اثنان من علماء الأحياء الخلوية مهتم بالأسس الجزيئية ، على سبيل المثال ، دورة الخلية ، وموت الخلية ، وتنظيم الانتشار ، وتنظيم التعبير الجيني ، والسرطان ، وعلم المناعة ، وعلم الأحياء الدقيقة ...

كيميائي عضوي إصطناعي واحد مهتم بمجالات مثل ، على سبيل المثال ، البيولوجيا الكيميائية ، وتصميم الأدوية ، والمواد المستوحاة من المواد الحيوية والحفز ، والكيمياء فوق الجزيئية ، ومحاكيات البروتين ، وأوليغنوكليوتيدات الاصطناعية ...

نرحب أيضًا بالمرشحين الذين لديهم ملفات شخصية أخرى ومشاريع إبداعية في الواجهة بين الكيمياء والبيولوجيا. ستعطى الأولوية لأصالة المشروع والاهتمام بتطوير تعاون متعدد التخصصات مع مجموعات أخرى من المعهد والمختبرات الأخرى في حرم بوردو. في مجال بيولوجيا الخلايا السرطانية ، سيستفيد المرشحون المهتمون بالساركوما أو سرطان الكلى أو سرطان الثدي من سهولة الوصول إلى العينات السريرية.

سيكون لقادة المجموعة استقلالية كاملة لإدارة مجموعتهم البحثية. سيكون لديهم إمكانية الوصول إلى مرافق IECB في البيولوجيا الهيكلية والكيمياء الهيكلية والفيزياء الحيوية (NMR ، MS ، cryo-EM ، علم البلورات ، تخليق الببتيد وإنتاج البروتين ، SPR ، ...). من المتوقع في المقام الأول أن يكون المتقدمون في مرحلة مبكرة من حياتهم المهنية البحثية (مع 2-10 سنوات من الخبرة ما بعد الدكتوراه) على الرغم من أنه سيتم النظر في الطلبات العليا عالية الجودة أيضًا. سيُطلب من المتقدمين الذين تم اختيارهم التقدم بطلب للحصول على تمويل بدء التشغيل مثل برنامج ATIP -Avenir أو FRM “amorçage” أو دعم ANR أو ERC ، وسيتم دعمهم لتأمين منصب بحثي دائم في فرنسا إذا لم يكن لديهم بالفعل وظيفة . يجب أن يجيد المتقدمون اللغة الإنجليزية. معرفة اللغة الفرنسية ليست إلزامية.

المتقدمون مدعوون لتقديم قبل 1 يوليو 2021:

  • رسالة تغطية
  • مخطط بيولوجي موسع يصف خلفيتك وما يصل إلى خمسة إنجازات رئيسية (بحد أقصى 5 صفحات)
  • اقتراح بحث (بحد أقصى 5 صفحات)
  • سيرة ذاتية كاملة
  • أسماء واتصالات 2-4 حكام


دور هيستون أسيتيل و أسيتيل ترانسفيرازات في تنظيم الجينات

كريستينا واي لي ، باتريك أ.جرانت ، في علم الوراثة السمية ، 2019

الخلاصة ووجهات النظر

تعتبر أستلة الهيستون ونزع الأستلة من العوامل الحاسمة في العمليات الخلوية المختلفة بما في ذلك تجميع النوكليوسوم ، وطي الكروماتين ، وإصلاح تلف الحمض النووي ، والنسخ المناسب. علاوة على ذلك ، يلعب تنظيم أستيل الهيستون و نزع الأسيتيل دورًا مركزيًا في مسببات المرض والآثار الضارة للتعرضات الكيميائية. تنشأ العديد من هذه الأمراض من سوء تنظيم أستلة الهيستون بواسطة HAT ، ولكن يجب أيضًا ملاحظة أن HATs لا تقتصر على ركائز هيستون فقط. عوامل النسخ هي ركائز إضافية لأسيتيل HAT ، مثل Smads ، p53 ، و NF-B (Tu and Luo ، 2007 Gu and Roeder ، 1997 Pejanovic et al. ، 2012). تملي أستلة عوامل النسخ هذه القدرة على ربط الحمض النووي ، والتوطين النووي ، واستقرار البروتين ، والتفاعلات مع منظمات النسخ الأخرى. أدت أهمية أستلة الهيستون ونزع الأسيتيل في هذه الأمراض المختلفة إلى تركيز متضافر على HATs و HDACs وبروتينات "القارئ" المحتوية على البرومودومين كأهداف للتدخل العلاجي. حاليًا ، تُستخدم مثبطات HDAC لعلاج السرطان والالتهابات والاضطرابات العصبية المتنوعة (انظر المراجعة ، Zwergel et al. ، 2016 Adcock ، 2007 Didonna and Opal ، 2015). ظهرت بروتينات البرومودومين أيضًا كأهداف دوائية يمكن تثبيطها بدقة عالية في الاضطرابات البشرية مثل HIV-1 ونقص تروية عضلة القلب (Zeng et al. ، 2005 Mujtaba et al. ، 2006 Gerona-Navarro et al. ، 2011). كان استهداف القبعات أكثر صعوبة ، حيث إنها إنزيمات ثنائية الركيزة وأكثر صعوبة في الاستهداف بسبب الحجم ، واستقرار التمثيل الغذائي الضعيف ، ونقص نفاذية الخلايا لمثبطات الركائز الثنائية (Wapenaar and Dekker ، 2016). كما أظهرت مثبطات الجزيئات الصغيرة لـ HATs إلى حد كبير انتقائية ضعيفة للهدف. إجمالاً ، لا يزال هناك الكثير لنتعلمه حول كيفية تعديل هيستون أستلة / نزع الأسيتيل نسخ الجينات ، والاستجابة للعوامل البيئية ، والمرض في نهاية المطاف. سيمكن التوصيف الدقيق لإنزيمات HAT و HDAC من التطوير المستمر للمُعدِّلات القوية والانتقائية لأسيتيل الهيستون التي ستساعد على زيادة فهمنا للآليات الكامنة وراء تأثيرات التعرض للمواد الكيميائية وحساسيتها وتطوير تدخلات علاجية جديدة.


2.10: تنظيم التعبير الجيني - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يجوز إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من قبل المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة والتي يعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


مناقشة

قمنا بشكل منهجي بمراجعة الأدبيات التي راجعها الزملاء حول دور التعديل الوراثي في ​​مسببات اضطرابات المزاج والقلق الشائعة والانتحار. تم نشر واحد وعشرين بحثًا بين عام 2001 ، ونشر مشروع الجينوم البشري ، وعام 2011. وكانت غالبية الدراسات (12) التي وجدناها معنية بأدلة على التغيرات اللاجينية في أدمغة ما بعد الوفاة للمنتحرين ، مع مراعاة دراسات أخرى العوامل اللاجينية في مسببات الاكتئاب واضطراب ما بعد الصدمة واضطراب الهلع. ركزت التعددية على التنظيم اللاجيني للجينات المشاركة في استقلاب الأمين والقشرانيات السكرية والسيروتونين في إنتاج اضطرابات المزاج والقلق الشائعة ودراسات الانتحار واعتبرت أيضًا تعديلًا جينيًا لمجموعة متنوعة من الجينات الأخرى.

بالنظر إلى العدد القليل من الدراسات ، فإن استخلاص استنتاجات جوهرية حول كيفية عمل التعديلات اللاجينية في جينات معينة في مسببات الأمراض المعنية غير ممكن في هذه المرحلة. تتناسب مراجعتنا مع تجميع القيود المنهجية للأدبيات والتوصيات الموجودة حول كيفية تعامل الباحثين بشكل أفضل مع هذا المجال في الدراسات المستقبلية.

تظهر خمسة قيود منهجية لهذه الأدبيات من مراجعتنا. الأول هو أن الدراسات في هذا المجال قد عانت من أحجام عينات صغيرة ، والتي تشمل عواقبها نقص الطاقة وزيادة معدلات الاكتشاف الخاطئ. ثانيًا ، اقتصرت الدراسات الحالية على تقييم التعديل الوراثي اللاجيني في دماغ ما بعد الوفاة أو الدم المحيطي بعد تشخيص المرض ، واستخلاص الاستدلال من أي نوع من الأنسجة يمثل مشكلة. ثالثًا ، استخدمت الدراسات تقنيات مختلفة لتقييم التعديلات اللاجينية التي قد تؤدي إلى نتائج غير متجانسة. رابعًا ، قيمت دراسات قليلة السوابق البيئية للتعديلات اللاجينية في الدراسات الموجودة. خامساً ، يبدو أن هناك القليل من الإجماع فيما يتعلق بمقاربات الجينوم على مستوى الجينوم مقابل مقاربات الجينات المرشحة.

يتمثل القيد المنهجي الأول لهذه الأدبيات في استخدام أحجام عينات صغيرة في معظم الدراسات ، وهي مشكلة منتشرة في كل مكان في علم الأوبئة الجزيئي [33]. من بين الدراسات التي راجعناها ، اشتملت واحدة فقط على أكثر من خمسين حالة (على سبيل المثال ، الأشخاص مع النتائج). بمضاعفة أحجام العينات الصغيرة في الدراسات بشكل عام ، قمنا بمراجعة العديد من الدراسات التي قمنا بمراجعة التحليل اللاجيني المحدود لمجموعة فرعية من إجمالي مجتمع الدراسة. تحد أحجام العينات الصغيرة من قوة الدراسة ، وبالتالي تزيد من احتمالية الخطأ من النوع الثاني (على سبيل المثال ، نسبة النتائج السلبية الكاذبة) [33]. والأخطر من ذلك ، أن الدراسات ضعيفة القوة تزيد أيضًا من "معدل الاكتشاف الخاطئ" أو عدد النتائج المهمة التي تقع في الخطأ من النوع الأول (على سبيل المثال ، نسبة النتائج الإيجابية الخاطئة) ، كما هو موضح في المعادلة 1 [34-36].

^ تشير كلمة "سابقة" إلى نسبة الفرضيات المختبرة الصحيحة بالفعل.

في هذه المعادلة ، يتناسب معدل الاكتشاف الخاطئ عكسيًا مع الطاقة (1-بيتا) ، مثل أن الطاقة المنخفضة تؤدي أيضًا إلى ارتفاع معدل FDR ، مما يؤدي إلى ارتفاع الخطأ من النوع الأول. لذلك ، نظرًا لأحجام العينات الصغيرة المستخدمة في غالبية الدراسات التي قمنا بمراجعتها ، فمن المحتمل أن النتائج تعاني من نسب عالية من الخطأ من النوع الأول والنوع الثاني.

القيد الثاني هو استخدام الدماغ بعد الوفاة أو أنسجة الخلايا المحيطية لتحليلات الوراثة اللاجينية. سبعة من 21 دراسة قمنا بمراجعتها بتحليل التعديل اللاجيني في خلايا الدم المحيطية ، ودراسة واحدة حللت التعديل اللاجيني في الغشاء المخاطي الشدق. على الرغم من أن جميع الخلايا البشرية تحمل الهبة الكاملة من المواد الجينية ، فإن الخلايا تعدل التعبير الجيني لتؤدي وظائفها المتنوعة بكفاءة لأنها تتخصص ، وتؤدي إلى إسكات بعض الجينات بينما تنشط أخرى بما يتماشى مع مسؤولياتها الفسيولوجية. التعديل اللاجيني هو العملية الفسيولوجية التي يتم من خلالها إسكات الجينات أو تحضيرها للتعبير [37 ، 38].ترتبط الفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات القلق المزاجي والانتحار بالدماغ ، وبالتالي لا يزال من غير الواضح كيف يرتبط التعبير الجيني في الأنسجة المحيطية بالتعبير الجيني ذي المعنى الفسيولوجي في الدماغ. ومع ذلك ، فحتى دراسات الوراثة اللاجينية التي تستخدم أنسجة المخ بعد الوفاة تواجه تحديات. حللت ثلاث من الدراسات الـ 21 التي قمنا بمراجعتها أنسجة المخ بعد الوفاة. بينما قيمت هذه الدراسات التغيرات اللاجينية في العضو المناسب ، فإن تقييم أنسجة المخ بعد الوفاة يحمل تحدياته الخاصة. هذا يمثل مشكلة فيما يتعلق بالوقت بين التعرض والنتيجة ، لأن أدمغة ما بعد الوفاة ، بحكم التعريف ، لا يمكن حصادها إلا بعد الموت ، وبالتالي لا يمكن التحقق من التعديل اللاجيني إلا بعد حدوث النتيجة. علاوة على ذلك ، غالبًا ما ينطوي الموت على الحماض ، والذي قد يساهم في عدم استقرار المادة الوراثية [39-41] ، مما يزيد من احتمالية سوء تصنيف التعديل الوراثي فوق الجيني ويزيد من فرص النتائج الزائفة. لذلك ، هناك حاجة إلى المزيد من العمل لمساعدتنا على فهم الأهمية الفسيولوجية لكل من الأنسجة المحيطية وأنماط مثيلة الدماغ.

القيد الثالث للأدبيات هو أن الدراسات المنشورة استخدمت تقنيات معملية مختلفة لقياس درجة التعديل اللاجيني. فيما يتعلق بميثيل الحمض النووي وحده ، هناك عدد من المقايسات الخاصة بالجينات قيد الاستخدام حاليًا ، بما في ذلك طرق تسلسل الحمض النووي القائمة على تفاعل بيسلفيت ، والتي تشمل التسلسل الجيني لبي سلفيت PCR [42] و / أو PCR المحدد للميثيل [43] شاشات واسعة الجينوم ، مثل المصفوفات الدقيقة لجزيرة CpG [44] وتقنيات المسح الجينومي المعياري للميثيل (RLGS-M) [45] والترسيب المناعي للحمض النووي الميثلي (MeDIP) [46]. هناك عدد قليل من الدراسات التي قارنت بين حساسية وخصوصية كل طريقة ، على الرغم من أن دراسة حديثة قارنت بين فحصين على أساس تسلسل ثنائي كبريتات (متشابهة جدًا) وجهاً لوجه ووجدت فرقًا يصل إلى 18٪ في تحديد الميثيل. جزر CpG في التكرارات البيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية [47]. على حد علمنا ، لا توجد فحوصات "المعيار الذهبي" لمعظم الواسمات اللاجينية. لذلك ، قد يمثل الاستخدام التفاضلي للمقايسات مصدرًا لتحيز التصنيف الخاطئ في الدراسات ، مما سيؤدي في النهاية إلى زيادة معدل الخطأ من النوع الثاني في الأدبيات الموجودة.

رابعًا ، فشلت الدراسات في مراجعتنا إلى حد كبير في تقييم التعرض البيئي الذي يُعتقد أنه ينتج تغيرًا جينيًا كبداية. ثلاثة فقط من أصل 21 دراسة تمت مراجعتها هنا تضمنت أي تقييم للضغوط البيئية الشائعة فيما يتعلق بالتعديلات اللاجينية وعلاقتها بالمزاج المشترك واضطرابات القلق والانتحار [14 ، 19 ، 20]. يعد هذا قيدًا مهمًا ، حيث توجد بيانات وافرة توضح أهمية الضغوطات البيئية في مسببات هذه الاضطرابات [48]. دون تقييم الضغوطات البيئية الشائعة التي سبقت التعديلات اللاجينية ، فشلت دراساتنا في اختبار الفرضيات السائدة بشكل كافٍ حول الدور الوسيط للتغيرات اللاجينية بين البيئات والنتائج في اضطرابات المزاج والقلق الشائعة والانتحار.

القيد الخامس هو عدم وجود إجماع فيما يتعلق بنهج الجينوم على نطاق واسع مقابل مناهج الجينات المرشحة في دراسات الوراثة اللاجينية. استخدمت ثلاث من الدراسات التي قمنا بمراجعتها مقاربات على مستوى الجينوم [12 ، 30 ، 32] ، بينما تم تقييم الدراسات الـ 18 المتبقية من أجل التعديلات اللاجينية للجينات المرشحة. كلا النهجين لهما حدود. فيما يتعلق بالدراسات على مستوى الجينوم ، غالبًا ما تكون التحليلات (والنتائج) غير مركزة. على عكس دراسات الارتباط على مستوى الجينوم ، لا توجد طريقة متفق عليها لتحليل وتوليف البيانات أو لتعديل المقارنات المتعددة في دراسات الوراثة اللاجينية على مستوى الجينوم. على وجه الخصوص ، يمكن أن يكون التعديل المناسب للمقارنات المتعددة مشكلة ، مما يزيد من نسبة النتائج الإيجابية الكاذبة [49]. تستفيد مناهج الجين المرشح من كونها مدفوعة بالفرضية ، وبالتالي فهي أكثر قابلية للتصاميم الدراسية المدروسة والقائمة على النموذج. ومع ذلك ، فإن مناهج الجينات المرشحة تواجه قيودها الخاصة. من المرجح أن تسفر دراسات الجين المرشح عن نتائج سلبية عامة ، حيث تختبر هذه الدراسات فرضية واحدة فقط ، مقارنة بالدراسات على مستوى الجينوم والتي تختبر المزيد من الفرضيات العالمية حول دور التعديل اللاجيني في أى مكان في الجينوم الذي يؤثر على مخاطر النتائج ذات الأهمية. نظرًا لأن مناهج الجينات المرشحة من المرجح أن تسفر عن نتائج إجمالية سلبية ، فهناك احتمال كبير لتحيز النشر ، حيث من المرجح أن تكون الأدبيات حول تعديل الجين المرشح غنية للغاية للحصول على نتائج إيجابية [35].

قيود المراجعة

يجب أن يكون القارئ على دراية بالعديد من القيود عند النظر في نتائج مراجعتنا المنهجية. أولاً ، اقتصرت مراجعتنا على الأدبيات المنشورة التي راجعها النظراء. لذلك ، من المعقول أن اختيارنا للدراسات قد يكون عرضة لتحيز النشر ، مما يؤثر على صحة استنتاجاتنا. ثانياً ، قمنا بتنظيم الدراسات حسب النتيجة. قد يكون هذا المخطط التنظيمي أيضًا ، جزئيًا ، قد شكل الاستنتاجات المرسومة هنا. ومع ذلك ، نظرًا لأننا حصرنا استنتاجاتنا إلى حد كبير في الانتقادات المنهجية للأدبيات ، فمن غير المرجح أن يكون لأي من التقييدات تأثير كبير على تفسيرنا لنتائجنا. ثالثًا ، اقتصرت مراجعتنا على المؤلفات باللغة الإنجليزية المنشورة في مجلات مفهرسة في قاعدتي بيانات. من المعقول أننا ربما فاتنا الأدبيات حول الوراثة اللاجينية فيما يتعلق بالمزاج المشترك واضطرابات القلق والانتحار المنشورة بلغات أخرى أو في المجلات التي لم يتم فهرستها في MEDLINE أو PSYCHINFO. ومع ذلك ، فإن هذا أقل احتمالية ، حيث أن البحث التفصيلي في الاستشهادات للدراسات المشمولة لم يسفر عن دراسات أخرى لإدراجها في المراجعة.


مناقشة

كلمة تحذير.

ال في السيليكو تستند المعايير المقدمة هنا على شبكات ذات أنواع مماثلة من الخصائص الهيكلية والديناميكيات التنظيمية كما يحدث في شبكات الجينات البيولوجية. على وجه الخصوص ، تتوافق هياكل الشبكة مع وحدات شبكات الجينات المعروفة ، ويستند النموذج الحركي على نهج ديناميكي حراري (24) ، والذي ثبت أنه يوفر تقريبًا جيدًا لأنواع مختلفة من تنظيم النسخ (30). ومع ذلك ، فإن هذا التمثيل هو نموذج مبسط للآليات البيولوجية الحقيقية. علاوة على ذلك ، لم يتم نمذجة طبقات إضافية من التحكم ، مثل تنظيم ما بعد النسخ وحالات الكروماتين. على الرغم من أن هذه في السيليكو لا تحل المعايير بأي حال من الأحوال محل الحاجة إلى التوصيف الدقيق للأداء في الجسم الحي (12) ، فهي تظل أداة مهمة للتحقق بشكل منهجي وفعال من أداء طرق الاستدلال عبر العديد من الشبكات. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تكون الأساليب التي لا تحقق نتائج جيدة في هذه المعايير ، أسوأ حالًا مع الشبكات البيولوجية الحقيقية ، كما تمت مناقشته في نص SI.

قضية عامة من المعايير ، سواء كان ذلك في السيليكو أو في الجسم الحي ، هو أن الأداء المقاس للطرق يكون دائمًا خاصًا بالشبكات المعينة التي تم استخدامها ، ولا يعمم بالضرورة على شبكات أخرى غير معروفة ، والتي قد يكون لها خصائص مختلفة. في الواقع ، أحد الاستنتاجات الرئيسية لهذه الدراسة هو أن أداء طرق استدلال الشبكة الحالية يعتمد بشدة على خصائص الشبكة التي يتم استنتاجها. على سبيل المثال ، نظرًا لأنه تم العثور على الأساليب التي تحتوي على ملفات تعريف خطأ مختلفة جدًا عن عزر الشبكة ، فإن أداؤها يعتمد على عدد حالات كل نوع من أنواع التصميمات الموجودة في الشبكة.

وبالتالي ، يجب مراعاة الأداء العام (الدرجة) لطرق الاستدلال بحذر ، حيث قد يختلف على الشبكات ذات الخصائص المختلفة. ومع ذلك ، من المتوقع أن تكون الأخطاء المنهجية المحددة في تحليل فكرة الشبكة أقل تنوعًا في الشبكات المختلفة. على سبيل المثال ، من المتوقع أن تواجه الطريقة التي فشلت في التمييز بين التنظيم المباشر وغير المباشر (خطأ تسلسلي) صعوبات مماثلة أيضًا على شبكات الجينات البيولوجية.

لا يزال الاستدلال الموثوق لشبكة الجينات من بيانات التعبير الجيني يمثل مشكلة لم يتم حلها.

غالبًا ما تُعتبر الصعوبات الرئيسية في الهندسة العكسية لشبكة الجينات هي البيانات المحدودة ، والتي قد تترك مشكلة الاستدلال غير محددة (10) ، وصعوبة التمييز المباشر من التنظيم غير المباشر (خطأ التسلسل) (26). تم تطوير عدد من الأساليب للتغلب على هذه الصعوبات ، على سبيل المثال ، تم اقتراح الارتباط الجزئي (26) وطرق أخرى (6 ، 27) لمواجهة أخطاء التتالي المحتملة. ومع ذلك ، فإن نتائج تجربة المجتمع المذكورة هنا تلفت الانتباه إلى صعوبات إضافية يجب التغلب عليها من أجل استدلال موثوق به لشبكات الجينات.

لقد قدمنا ​​بيانات أكثر وأفضل مما هو متاح عادة في التجارب البيولوجية الحقيقية ، ومع ذلك فإن الأداء العام لـ 29 طريقة استدلال شبكية مطبقة لم يكن مرضيًا. نجحت الطريقة الأفضل أداءً (29) بشكل جيد ، نظرًا لأنها تستند إلى ربما أبسط نموذج لجميع طرق الاستدلال المطبقة (انظر نص SI). ومع ذلك ، لم يستطع التمييز بين التنظيم المباشر وغير المباشر. على الرغم من معدل الخطأ المتزايد هذا في نموذج التتالي ، إلا أنه كان يتمتع بأداء إجمالي أفضل بشكل ملحوظ من الأساليب الحديثة الأخرى القائمة على نماذج أكثر تقدمًا أو احتمالية أو ديناميكية. على الرغم من أن البعض كان أكثر قوة في مواجهة خطأ التسلسل ، إلا أنهم تأثروا بشدة بالأخطاء المنهجية الأخرى ، ولا سيما خطأ المروحة في. نتوقع أن تكون هذه الأخطاء أكثر وضوحًا في التطبيقات البيولوجية الحقيقية ، مما يشير إلى أن أداء طرق الاستدلال بشبكة الجينات قد يكون مبالغًا في تقديره سابقًا بسبب الافتقار إلى معايير صارمة ومعمية.

استنتاج.

لقد قدمنا ​​إطارًا لتقييم الأداء النقدي لطرق الاستدلال بشبكة الجينات. لقد سمح لنا إطار العمل هذا بمقارنة عدد كبير من طرق الاستدلال - المطبقة بشكل مستقل من قبل فرق مختلفة - على شبكات قياس أداء متعددة. بالإضافة إلى تقييم الدقة الكلية ، قمنا بتقييم أداء طرق الاستدلال على أشكال الشبكة الفردية. كشف هذا التحليل أن طرق الاستدلال الحالية تتأثر ، بدرجات مختلفة ، بثلاثة أنواع من أخطاء التنبؤ المنهجية: خطأ التوزيع (التنبؤ غير الصحيح للتفاعلات بين الجينات المحكومة) ، خطأ المروحة (التنبؤ غير الدقيق للتنظيم التوافقي) ، والخطأ التعاقبي (الفشل في التمييز بين التنظيم المباشر وغير المباشر). يعد التمييز بين التنظيم المباشر وغير المباشر من الصعوبات المعروفة في الاستدلال الشبكي (6 ، 26 ، 27) ، ولكن لم يتم تقييمه كميًا. يتيح تحليل فكرة الشبكة تحديد مدى جودة حل هذه الصعوبة بطرق مختلفة. علاوة على ذلك ، كشفت عن نوعين آخرين من الأخطاء المنهجية ، خطأ المروحة وخطأ التوزيع ، وهما مهمان بنفس القدر للجودة الإجمالية للتنبؤات.

كانت إحدى الصعوبات التي واجهها المشاركون في تحدي DREAM هي أنهم لم يعرفوا تفاصيل النموذج الحركي الذي تم استخدامه لتوليد بيانات التعبير الجيني. هذه الصعوبة أكثر وضوحًا في التطبيقات البيولوجية ، حيث تكون آليات وحركية تنظيم الجينات الكامنة وراء بيانات التعبير أكثر تعقيدًا ، كما أنها غير معروفة مسبقًا. وبالتالي ، فإن طرق الاستدلال ملزمة بعمل افتراضات مبسطة. ومع ذلك ، فقد تبين أن الافتراضات غير الدقيقة تؤدي إلى حدوث أخطاء في التنبؤ المنتظم ، مما أثر بشكل عميق على أداء طرق استدلال الشبكة المطبقة (انظر أيضًا نص SI). وبالتالي هناك حاجة لتطوير طرق الاستدلال التي لها أداء أكثر قوة على الرغم من عدم اليقين بشأن نوع الآليات ("النموذج") التي تقوم عليها البيانات. لقد أظهرنا أن أحد الأساليب الممكنة لتحقيق هذا الهدف هو الجمع بين التنبؤات من طرق الاستدلال التكميلية لتشكيل "تنبؤات مجتمعية" أكثر قوة ودقة. نحن مقتنعون بأن الفهم الأفضل لقدرات وقيود طرق الاستدلال الحالية سيمكن من تطوير مناهج فريدة من شأنها أن تجعل حلم الاستدلال الدقيق عالي الإنتاجية لشبكات الجينات حقيقة.


تنظيم التعبير الجيني للخيوط الوسيطة

توجد بروتينات الخيوط الوسيطة (IF) في كل خلية تقريبًا وكل نسيج من الكائنات الحية الأعلى ويتم تنظيم تعبيرها بشكل كبير خلال مراحل مختلفة من نمو الخلية وتطورها وتمايزها. يصف هذا الفصل خلفية عامة ودراسات حول تنظيم الجينات K5 و K14. كما يعرض إجراءات لتحديد التنظيمي رابطة الدول المستقلة عناصر اختبار النشاط التنظيمي رابطة الدول المستقلة ، وتحديد وتحليل عوامل النسخ الملزمة لـ رابطة الدول المستقلة عناصر. توفر عائلة الجينات IF نظامًا نموذجيًا مثيرًا للاهتمام لدراسة العمليات المتنوعة للتطور والتمايز في أنواع الخلايا المختلفة. في العديد من هذه الخلايا ، لا توفر بروتينات IF دعامة ميكانيكية فحسب ، بل تشارك أيضًا في العديد من العمليات الخلوية الديناميكية. على الرغم من أن العديد من المناطق التنظيمية لجينات IF قد تم تحديدها ، إلا أن معظمها لا يزال غير مستكشَف لذلك ، فإن الدراسات المستمرة حول تنظيم التعبير الجيني IF أمر مهم ، ويجب أن يؤدي إلى فهم أفضل لتنظيم الخصائص المهمة للخلية أو الأنسجة مثل مصير الخلية وشكلها وتطورها وتمايزها.


النتائج

يتغير التعبير الجيني في RAW 264.7 الضامة استجابةً لـ CpG-DNA

تشير دراساتنا السابقة إلى أن CpG-DNA يمكن أن يتآزر مع LPS للحث على إنتاج TNF-α و NO من RAW 264.6 الضامة [16 ، 17] ، مما يشير إلى أن CpG-DNA و LPS يستخدمان مسارات إشارات مختلفة لتنشيط التعبير الجيني. لمزيد من تحليل العواقب العالمية لإشارات CpG-DNA و LPS ، أجرينا دراسات لتحديد ملامح التعبير الجيني في RAW 264.7 الضامة استجابة لـ CpG-DNA أو LPS باستخدام تقنية ميكروأري قليل النوكليوتيد. لرصد التغييرات التي يسببها CpG-DNA في ملامح التعبير الجيني في RAW 264.7 الضامة ، تم تحضير تحقيقات cRNA المعالجة بالبيوتين باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي المعزول من RAW 264.7 الضامة التي عولجت لمدة 6 ساعات مع وسط الثقافة وحده ، وسط يحتوي على 30 ميكروغرام / مل CpG المحتوية على ODN T3 ، أو ODN C3 غير المحتوية على CpG. تم بعد ذلك تهجين تحقيقات cRNA مع المصفوفات الدقيقة لجينوم الفئران Mu11K التي تحتوي على أكثر من 11000 جين كامل الطول وتسلسل EST على شريحتين فرديتين. بعد التهجين والغسيل ومسح المصفوفات ، تم جمع بيانات الفلورسنت وتحويلها إلى ترددات جينية (مستويات التعبير) كما هو موضح في المواد والطرق. تم عرض النصوص المكتشفة ، المسماة "الحاضر" ، في مخططات تبعثر ثنائية الأبعاد مع مقارنات نموذجية من ملفين لعينات المعالجة والمراقبة. كما هو موضح في الشكل 1 أ، التحكم ، غير CpG-ODN C3 (المربعات الزرقاء) أو التعبير الخاضع للتنظيم (المربعات الحمراء) لعدد صغير جدًا [26] من الجينات ، وأغلبية أنواع mRNA "الحالية" (5184 جينًا في عينات ثلاثية) يبقى دون تغيير (المربعات الخضراء). بعد التحليل الإحصائي ، لم تستوف أي جينات معايير الاختيار المزدوج لأكثر من شقين ، و ص & lt 0.05 (الجدول 1). في المقابل ، فإن ODN T3 المحتوي على CpG (الشكل 1 ب) عدل بشكل كبير التعبير عن عدد أكبر نسبيًا من الجينات. من بين 5112 جينًا في المتوسط ​​"موجود" في عينات ثلاثية ، تم تحديد 107 جينة على أنها مستحثة أكثر من شقين ، وبعد التحرير ، حقق ما مجموعه 106 جينة معايير الاختيار المزدوج لأكثر من شقين ، و ص & lt 0.05 (الجدول 1). من بين هؤلاء ، تم تنظيم 79 جينًا. تضمنت هذه الجينات 69 جينًا معروفًا (الجدول 2 ، مظلل باللون الوردي) يشفر السيتوكينات ، والكيموكينات ، ومستقبلات سطح الخلية ، وعوامل النسخ ، وبروتينات الإشارات داخل الخلايا ، والبروتينات المرتبطة بتكاثر الخلايا / التمايز ، والإنزيمات ، وغيرها ، بالإضافة إلى 10 ESTs التي لا يمكن تحديد التسلسلات كاملة الطول من خلال تحليل بلاست (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى الجينات التي تم تنظيمها بواسطة CpG-DNA ، تم تحديد ثلاثة جينات (الجدول 3 ، مظلل باللون الوردي) وواحد EST (غير موضح) على أنه يتم تنظيمه بواسطة CpG-DNA بأكثر من شقين. توفر هذه البيانات نظرة عامة عالمية على التغييرات في أنماط التعبير الجيني في اتجاه مسار إشارات CpG-DNA (TLR9). تحدد بياناتنا أيضًا لأول مرة عددًا من الجينات الجديدة التي تم قمعها بشكل كبير في البلاعم بعد التحفيز باستخدام CpG-DNA.

التعبير عن الجينات في البلاعم غير CpG-DNA و CpG-DNA والمعالجة بـ LPS. تم رسم تكرارات الجينات (مستويات التعبير عن الجينات ، جزء في المليون) في RAW 264.7 الضامة المعالجة بـ non-CpG-DNA (A) و CpG-DNA (B) و LPS (C) مقابل ترددات الجينات في البلاعم المعالجة بالثقافة متوسط ​​وحده. كل مربع يرمز إلى جين مميز. نسبة ذ- قيمة المحور س-قيمة المحور لكل مربع تساوي تحريض الطية لجين معين. المربعات (الخضراء) التي تقع على الأقطار هي جينات لم يتم تنظيمها لأعلى أو لأسفل. تمثل المربعات الزرقاء الجينات التي يتم تنظيمها بشكل كبير تمثل المربعات الحمراء الجينات التي يتم تنظيمها بشكل كبير وتمثل المربعات الصفراء الجينات المكبوتة بشكل هامشي فقط وفقًا للمعيار المزدوج ، أكثر من ضعفين ، و ص & لتر 0.05. لذلك ، لم يتم تضمين هذه الجينات لتحليل البيانات في هذا التقرير.

غير CpG 1 CpG-DNA 1 LPS 1
ضعفين 26 279 749
P & lt 0.05 2 72 377 1277
ضعفان + P & lt 0.05 0 107 511
تم تحريره 3 0 83 263
  • 1 تعبير متعلق بعناصر تحكم الوسائط.
  • 2 اختبار t للطالب ، ثنائي الذيل مع تغاير غير متكافئ.
  • 3 بعد إزالة الجينات التي تم تحديدها على أنها "غائبة" أو تم تسميتها عدة مرات على المصفوفات.

يتغير التعبير الجيني في RAW 264.7 الضامة استجابةً لـ LPS

يعتبر العديد من الباحثين أن LPS من البكتيريا سالبة الجرام هو عامل تنشيط البلاعم النموذجي. على عكس CpG-DNA ، الذي يستخدم TLR9 للإشارة ، فقد ثبت أن LPS المعوي يعتمد تمامًا على TLR4. لذلك كان من المهم ربط التعبير عن جينات البلاعم استجابةً لـ CpG-DNA بتلك التي يسببها LPS. لرصد التغييرات في ملامح التعبير الجيني في RAW 264.7 الضامة استجابةً لـ LPS ، تمت معالجة الضامة بمتوسط ​​وحده أو بجرعة تحفيز مثالية تبلغ 100 نانوغرام / مل LPS لمدة 6 ساعات. تم بعد ذلك عزل مجموع الحمض النووي الريبي لتحليلات ميكروأري بشكل أساسي كما هو موصوف لتحليل الجينات التي يسببها CpG-DNA. كما هو مبين في الشكل 1C ، LPS up-regulated (المربعات الزرقاء) و down-regulated (المربعات الحمراء) عدد أكبر من الجينات من CpG-DNA. من بين 4947 جينًا في المتوسط ​​تم اكتشافها على أنها "موجودة" في عينات ثلاثية ، تم تغيير التعبير عن 511 جينًا بأكثر من الضعف مع ص & لتر 0.05. بعد التحرير ، تم تحديد 263 جينًا على أنها تغيرت أكثر من شقين استجابةً لـ LPS (الجدول 1). من بين هؤلاء ، وجد أن 192 جينًا (الجدول 2) خاضعة للتنظيم بشكل كبير ، وأن 71 جينًا (الجدول 3) خضع للتنظيم بشكل كبير.تتضمن تلك الجينات التي زاد تعبيرها 168 جينًا معروفًا ، وكما هو متوقع ، فإنها تشفر عددًا كبيرًا من السيتوكينات ، والكيموكينات ، ومستقبلات سطح الخلية ، وعوامل النسخ ، وبروتينات الإشارات داخل الخلايا ، والبروتينات المرتبطة بتكاثر الخلايا / التمايز ، والإنزيمات ، والأورام- البروتينات ذات الصلة (الجدول 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم تنظيم 24 جينًا ولكن لم يتم تحديدها بعد من خلال تحليل بلاست (البيانات غير معروضة). من بين 71 جينًا تم قمعها بواسطة LPS ، هناك 52 جينًا معروفًا ، والتي تشفر في المقام الأول البروتينات والإنزيمات المرتبطة بتكاثر الخلايا / التمايز (الجدول 3) ، والجينات الـ 19 المتبقية هي حاليًا تسلسلات EST غير معيّنة (غير معروضة). لا توفر هذه البيانات نظرة عامة شاملة على ملفات تعريف التعبير الجيني التي يسببها LPS في الضامة RAW 264.7 ولكن أيضًا تحدد عددًا كبيرًا من الجينات التي يتم تنظيمها بواسطة LPS.

مقارنة لمحات التعبير الجيني في البلاعم المعالجة بـ CpG-DNA و LPS

نظرًا لأنه تم الإبلاغ عن استخدام CpG-DNA و LPS لمستقبلات سطح الخلية للجهاز المناعي الفطري (TLR9 ​​و TLR4 ، على التوالي) التي تشترك في درجة عالية من التماثل [24] ، قمنا بعد ذلك بمقارنة ملفات تعريف التعبير الجيني في CpG-DNA - والضامة RAW 264.7 المعالجة بـ LPS مع توقع تحديد المدى الذي يمكن أن يستخدم فيه CpG-DNA و LPS مسارات إشارات متشابهة أو مميزة تؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني. تم سرد جميع الجينات التي تم تعديلها بأكثر من شقين في الضامة المعالجة بـ CpG-DNA- و LPS ومحاذاة في الجدولين 2 و 3. كما هو موضح في الجدول 2 ، جميع الجينات المستحثة في RAW 264.7 الضامة بواسطة CpG-DNA كانت أيضًا إلى حد مشابه أو أكبر بواسطة LPS (مظلل باللون الوردي). علاوة على ذلك ، تم أيضًا تنظيم جميع الجينات التي تم قمعها بواسطة علاج CpG-DNA بدرجة مماثلة بواسطة علاج LPS (الجدول 3 ، مظلل باللون الوردي). لتوضيح هذه النتائج بشكل أكبر ، قمنا باختيار الجينات بشكل عشوائي ضمن المجموعات الوظيفية "Chemokine and cytokine" و "الاستجابة المناعية" (الجدول 2) ورسمنا متوسط ​​مستويات التعبير عن هذه الجينات في CpG-DNA- ، CpG المتوسط ​​وغير CpG -الضامة المعالجة بـ DNA- و LPS في الشكل 2 أو 2ب. تم أيضًا تحفيز جميع الجينات التي يسببها CpG-DNA إلى حد مماثل أو أكبر بواسطة LPS (انظر الجينات في الأجزاء اليسرى من الشكل 2 أ و 2 ب). تشير هذه البيانات إلى أنه بالمقارنة مع LPS ، فإن CpG-DNA لا يحفز أي مجموعة فريدة من الجينات. تشتمل الجينات المحفزة لـ CpG-DNA على مجموعة فرعية فقط من الجينات المحفزة بـ LPS ، مما يشير إلى أن إشارات CpG-DNA لا تشغل سوى مجموعة فرعية من مسارات الإشارات التي يسببها LPS.

مقارنة بين مستويات التعبير عن الجينات في البلاعم CpG-DNA والمعالجة بـ LPS. تم رسم مستويات التعبير عن جينات "Chemokine and cytokine" (A) و "الاستجابة المناعية" (B) للمجموعات الوظيفية (الجدول 2) في البلاعم المعالجة بـ CpG-DNA جنبًا إلى جنب مع مستويات التعبير عن هذه الجينات نفسها في الوسط- ، الضامة غير CpG-DNA ، والمعالجة بـ LPS. تمثل البيانات متوسط ​​مستويات التعبير للعينات الثلاثية - الانحرافات المعيارية من أحد تحليلين منفصلين. السائل الدماغي النخاعي ، عامل تحفيز المستعمرات.

يتغير التعبير الجيني الخاص بـ LPS في الضامة RAW 264.7

للتأكيد كذلك على أن LPS يستخدم مسارات إشارات مميزة مقارنةً بـ CpG-DNA ، حددنا تلك الجينات التي تم تحفيزها أو قمعها بواسطة LPS ولكن لم تتغير بشكل كبير بواسطة علاج CpG-DNA. تم سرد هذه الجينات في الجدولين 2 و 3 وتم تمييزها باللون الأخضر الفاتح. من بين 193 جينًا مستحثًا بواسطة LPS ، تم العثور على 109 جينًا لا يتم تنظيمها بشكل كبير بواسطة CpG-DNA (الجدول 2 ، مظلل باللون الأخضر الفاتح) من 71 جينًا تم قمعها بواسطة LPS ، لم يتم قمع 67 جينًا بشكل كبير بواسطة CpG-DNA العلاج (الجدول 3 ، مظلل باللون الأخضر الفاتح). لذلك ، أظهر عدد كبير من الجينات تنظيمًا خاصًا بـ LPS. لتوضيح هذه النتائج بشكل أكبر ، اخترنا عشوائياً الجينات ضمن المجموعات الوظيفية "Chemokine and cytokine" و "الاستجابة المناعية" (الجدول 2) ورسمنا مستويات التعبير عن هذه الجينات في الوسط ، non-CpG-DNA- ، CpG-DNA - ، والضامة المعالجة بـ LPS في الشكل 2 و A و B. على الرغم من أن التعبير الناجم عن CpG-DNA و LPS عن بعض الجينات الشائعة (انظر الأجزاء اليسرى من الشكل 2 أ و 2 ب) ، فإن عددًا من الجينات يظهر تحريض خاص بـ LPS [على سبيل المثال ، ينظم التنشيط ، T الطبيعي المعبر عنه وإفرازه (RANTES) ، إنترلوكين (IL) -1A ، البروتين المحفز IFN 10 (IP-10) ، PBEF ، و IL-18 في الشكل 2A الناجم عن IFN مع ببتيد رباعي (IFIT) 1 ، IFIT2 ، IFIT3 ، والماوس الناجم عن IFN- جاما (MG) 11 في الشكل 2 ب]. تعزز هذه النتائج الفرضية القائلة بأن LPS ينشط مسار (مسارات) إشارات إضافية غير مرتبطة بإشارة CpG-DNA (TLR9- بوساطة).

التحقق من نتائج ميكروأري باستخدام RT-PCR

على الرغم من أن دراساتنا السابقة أظهرت أن تحليل ميكروأري قليل النوكليوتيد عالي الكثافة هو تقنية قوية وحساسة ودقيقة يمكن من خلالها تحديد التعبير عن الجينات التي تنظمها جزيئات التأشير [33] ، فقد أجرينا تجارب إضافية لتأكيد التعبير عن بعض ما تم اكتشافه الجينات باستخدام RT-PCR شبه الكمي. تم العثور على جميع نتائج RT-PCR (البيانات غير معروضة) لتكون متوافقة مع نتائج ميكروأري. إدخال المعلومات الشكل 3 عرض بعض هذه النتائج التمثيلية RT-PCR. تم أيضًا تنظيم الجينات التي تم تحديدها على أنها خاضعة للتنظيم الأعلى أو السفلي بواسطة CpG-DNA و LPS في دراسات المصفوفة الدقيقة أيضًا في تحليلات RT-PCR (راجع الجينات في الشكل 3 لنفس الجينات في الجدولين 2 و 3).

تحريض الجينات المختلفة بواسطة CpG-DNA و non-CpG-DNA و LPS. تم تحفيز الضامة باستخدام وسط مستنبت وحده ، وسط يحتوي على 30 ميكروغرام / مل CpG- أو غير CpG-DNA ، أو 100 نانوغرام / مل LPS لمدة 6 ساعات قبل عزل RNA لتحليل RT-PCR لمستويات mRNA للجينات المختلفة كما هو موصوف في المواد والطرق. تظهر البيانات 4 من 14 جينًا تم تضخيمها بواسطة RT-PCR. تم تضخيم الرنا المرسال لجين بيتا-أكتين واستخدامه كعنصر تحكم داخلي.


صفحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس

يدرس مختبري كيف تتطور التسلسلات الجينومية التي تتحكم في وظيفة التعبير الجيني. نحن مدفوعون بالرغبة في فهم الأساس الجزيئي للتنوع العضوي ، والاعتقاد بأن العديد من الاختلافات في علم وظائف الأعضاء والتشكل والسلوك تنشأ من التغييرات في تنظيم الجينات. هدفنا النهائي هو أن نكون قادرين على تفسير المعلومات التنظيمية المشفرة في الحمض النووي الجيني ، حتى نتمكن بشكل روتيني من تحديد التسلسلات التنظيمية ، وتمييز وظيفتها ، والتنبؤ بعواقب اضطرابها ، وإعادة بناء كيفية تطورها.

نحن مختبر حسابي وتجريبي هجين يجمع بين التحليل الحسابي والتجريبي على نطاق الجينوم لتنظيم الجينات في ذبابة الفاكهة سوداء البطن و خميرة الخميرة مع تحليل شامل لبيانات التسلسل المقارن والتحليل التجريبي للأنواع المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بأنظمة النموذج هذه. نحن نركز على نطاقات زمنية تطورية قصيرة حيث من الممكن الجمع بين تغييرات محددة في تسلسل الجينوم مع تعديلات في تنظيم الجينات والتعبير عنها.

المشاريع الحالية

التوصيف التجريبي لتنظيم الجينات في D. melanogaster الأجنة

لتوفير أساس تجريبي متين لدراساتنا التطورية ، نحن نعمل مع العديد من المعامل الأخرى في بيركلي لتشريح التعبير الجيني والتنظيم بشكل منهجي في وقت مبكر D. melanogaster الجنين. لكل من عوامل النسخ الأربعين تقريبًا الحاسمة في تشكيل الأنماط الأمامية والخلفية والظهرية والبطنية ، تتمثل أهدافنا في: 1) قياس تقارب العوامل في المختبر لكل من تسلسلها المستهدف المحتمل ، 2) تحديد المناطق الجينومية المرتبطة حسب كل عامل في الأجنة الحية ، 3) تحديد نمط التعبير عن العامل وأهدافه في ثلاثة أبعاد بدقة خلوية. أنا وأعضاء مختبري نشارك بنشاط في الأجزاء التجريبية للمشروع ونقوم بتحليل هذه البيانات.

نمذجة القيود التطورية على التسلسلات التنظيمية حقيقية النواة

لدينا الآن بيانات تسلسل مقارن مكثفة لفراشات الفاكهة (12 جينوم ذبابة الفاكهة) والخمائر (العديد من الجينومات الفطرية) ، ونستخدم هذه البيانات لتوصيف كيف لبنات البناء الفردية للتسلسلات التنظيمية (مواقع ربط عامل النسخ) والهياكل عالية الرتبة (على سبيل المثال التنموية. معززات) تتطور. نحن مهتمون بشكل خاص بفهم كيفية تأثير الاختيار للحفاظ على مواقع ربط عامل النسخ على تطور التسلسلات المستهدفة ، وكيف ترتبط المرونة الشاملة التي تظهر في تنظيم معززات النمو بوظيفتها.

توصيف ونمذجة اختلاف شبكة النسخ داخل وبين أنواع ذبابة الفاكهة

يقوم مختبري بتطبيق طرق التصوير الفلوري عالية الدقة التي تم تطويرها من أجل D. melanogaster لتحليل التعبير الجيني بشكل منهجي ، وتشريح الشبكات التنظيمية ، في أخرى ذبابة الفاكهة الأنواع وفي العديد من السلالات الفطرية D. melanogaster. البيانات التجريبية التفصيلية التي ننتجها D. melanogaster، وتسلسل الجينوم لـ 12 نوعًا من ذبابة الفاكهة هي مورد هائل لدراسة تطور تنظيم الجينات. ومع ذلك ، من الصعب دراسة التغييرات في التسلسل دون فهم السياق الذي توجد فيه هذه التسلسلات وكيف تؤثر هذه التغييرات على الوظيفة. في حين أنه من غير العملي تكرار كل تجربة يتم إجراؤها في D. melanogaster في كل سلالة وأنواع أخرى ، نقوم بتوسيع عدة فئات من التجارب إلى سلالات وأنواع مختارة حتى نتمكن من فهم التباين التنظيمي بشكل أفضل في كل من مستوياته المتعددة: كيف يؤثر اختلاف التسلسل على الارتباط ، وكيف يؤثر اختلاف الربط على التعبير ، وكيف يختلف التعبير يؤثر على النمط الظاهري.

استخدام تطور التسلسل التنظيمي لتوضيح آليات تنظيم الجينات

للاستفادة من تنوع التسلسل خارج جنس ذبابة الفاكهة ، نقوم بترتيب المواقع المهمة من الناحية التنموية من عدة عائلات ذبابة غير ذبابة الفاكهة لتوفير رؤى حول المبادئ الأساسية لتنظيم الجينات. نحن مهتمون بشكل خاص بالتسلسلات التنظيمية التي خضعت لعمليات إعادة ترتيب واسعة النطاق في ذخيرة مواقع الربط الخاصة بها دون تغيير وظيفتها. على الرغم من ملاحظة عمليات إعادة ترتيب واسعة النطاق بين التسلسلات التنظيمية ذبابة الفاكهة ، يجب أن تكون هناك حدود لهذه اللدونة. بمرور الوقت ، سوف تتراكم التسلسلات التنظيمية فقط تلك التغييرات في ذخيرة مواقع الربط الخاصة بها والتي تتوافق مع الأحداث الكيميائية الحيوية المعقدة المطلوبة لإنتاج مخرجاتها التنظيمية المحددة. لذلك نعتقد أن جمع وتوصيف التسلسلات التنظيمية ذات الوظائف المتشابهة ولكن التسلسلات المتنوعة سيؤدي في النهاية إلى فهم أفضل للمبادئ الكيميائية الحيوية التي تربط تكوين وتنظيم التسلسلات التنظيمية بوظيفتها. لإجراء مثل هذا التحليل ، نقوم حاليًا بتسلسل 20 موقعًا مستهدفًا من 6 أنواع في كل من عائلات Sepsidae (ذباب الراية) و Tephritidae (ذباب الفاكهة الحقيقي) و Diopsidae (ذباب ساق العين). اخترنا هذه الأصناف ، التي تباعدت عن ذبابة الفاكهة بين 100 و 150 مليون سنة ، لتوفير التوازن الأمثل بين تباعد التسلسل والاختلاف الوظيفي. نحن نكمل تحليل التسلسل بالتحليل التجريبي للتطور في الأنواع المختارة من كل تصنيف ، ودراسة نشاط المعززات من هذه الأنواع في D. melanogaster الأجنة ، والاختبار المكثف للفرضيات المتعلقة بوظيفة التسلسل التنظيمي والتطور.

منشورات مختارة

[نسخ من جميع الأوراق متوفرة في rana.lbl.gov]

بولارد دا ، موسى آم ، آير في إن وآيزن إم بي (2006). انتشار الخلاف بين أشجار الجينات وشجرة الأنواع في ذبابة الفاكهة: دليل على عدم اكتمال فرز النسب. علم الوراثة PLoS 2(10): e173.

موسى AM ، بولارد DA ، Nix DA ، Iyer VN ، Li XY ، Biggin MD ، Eisen MB (2006). معدل دوران واسع النطاق لمواقع ربط عامل النسخ الوظيفي في ذبابة الفاكهة. PLoS علم الأحياء الحسابي 2(10): e130.

بولارد DA ، موسى AM ، Iyer VN و Eisen MB. الكشف عن حدود الحفاظ على العناصر التنظيمية وتقدير الاختلاف باستخدام محاذاة متعددة زوجية ومتعددة. المعلوماتية الحيوية BMC 7(1):376.

شيانغ دي واي ، نيكس دا ، شولتزابيرجر آر كيه ، جاسش إيه بي ، آيزن إم بي (2006). متطلبات بنية المروج المرنة لتوظيف المحفز. علم الأحياء الجزيئي BMC 7(1):16.

Gasch AP و Moses AM و Chiang DY و Fraser HB و Berardini M و Eisen MB (2004). حفظ وتطور رابطة الدول المستقلة- نظم التنظيم في الفطريات Ascomycete. بلوس علم الأحياء 2(12): إي 398.

Moses AM و Chiang DY و Pollard DA و Iyer VN و Eisen MB (2004). MONKEY: تحديد مواقع ربط عامل النسخ المحفوظة في محاذاة متعددة باستخدام نموذج تطوري ملزم خاص بالموقع. بيولوجيا الجينوم 5(12): R98.

Berman BP و Pfeiffer BD و Laverty TR و Salzberg SL و Rubin GM و Eisen MB و Celniker SE (2004). التحديد الحسابي للمعززات التنموية: حفظ ووظيفة مجموعات مواقع ربط عامل النسخ في ذبابة الفاكهة سوداء البطن و ذبابة الفاكهة الزائفة. بيولوجيا الجينوم 5(9): R61.

Moses AM و Chiang DY و Kellis M و Lander ES و Eisen MB (2003). ضع تباينًا محددًا في معدل التطور في مواقع ربط عامل النسخ علم الأحياء التطوري BMC 3(19).

Berman BP و Nubu Y و Pfeiffer BD و Tomancak P و Celniker SE و Levine M و Rubin GM و Eisen MB (2002). استغلال مجموعات موقع ارتباط عامل النسخ للتعرف عليها رابطة الدول المستقلة- الوحدات التنظيمية المشاركة في تشكيل الأنماط في ذبابة الفاكهة الجينوم. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية 99, 757-62.


شاهد الفيديو: ضبط التعبير الجيني في حقيقيات النواة - GENE EXPRESSION REGULATION IN EUKARYOTES (كانون الثاني 2022).