معلومة

هل يمكن أن تكون هذه الصورة نتيجة لطخة ويسترن؟


أقوم حاليًا بالبحث عن التلاعب بالصور في علوم الحياة وتعثرت على لطخة ويسترن تبدو مشابهة جدًا للصورة أدناه.

لإنشاء الصورة ، قمت بقص اللطخة باستخدام أداة Fuzzy Select Tool الخاصة بـ GIMP ثم قمت بتعديل التباين المحلي للبقعة وكذلك الخلفية بشكل كبير. باستخدام Fuzzy Select Tool ، يتم أيضًا التقاط بعض وحدات البكسل من الخلفية الأصلية. هذا هو السبب في أن البقعة المعروضة لها خلفية أكثر إشراقًا حول الحواف. عادة لا أتوقع رؤية حواف مشرقة حول البقعة.

بينما أعرف كيف تبدو Western Blots عندما يتم التقاطها بكاميرا رقمية ، لا أعرف عن تقنيات مثل Chemiluminescent Blotting (أنا طالب جامعي في علوم الكمبيوتر). ربما هناك تقنية نشاف ينتج عنها صورة مثل تلك التي قمت بإنشائها.

هل من الممكن الحصول على نتيجة Western Blot مثل هذه دون تعديل غير مناسب للصورة؟


لا أعتقد أن لطخة جودة النشر مثل هذه القطعة الأثرية ، لكنني تمكنت من العثور على شيء مشابه عن طريق النشاف (وليس نفس التعريض الزائد) للهلام. إذا كنت تستخدم الكثير من الكاشف الأساسي أو الثانوي أو المتطور ، فيمكنك الحصول على إشارة HRP الخاصة بك "تحترق في" غشاء حيث تحصل على "نطاق سلبي" مميز.

أعني بالنطاق السلبي منطقة أكثر وضوحًا / بيضاء من الخلفية. يحدث هذا في الغالب عندما يكون لديك الكثير من الأجسام المضادة الثانوية. عادة عندما يحدث هذا ، يحترق مركز الفرقة في البداية حتى ترى مركزًا أبيض بحواف داكنة. وذلك فقط عندما تقوم بتصوير الغشاء وهو يحترق. غالبًا ما يكون الشريط بأكمله أبيض.

بعد المرور عبر غرب الطالب الذي يعمل معي ، وجدت هذه الصورة:

جاء مع تدوين واضح أنه تم حرقه وتجاهله (قال الطالب كان يتعلم كيفية التعامل مع الغرب في ذلك الوقت). إنها لطخة GAPDH لأولئك الذين يهتمون. عندما يحدث هذا ، يكون الأمر واضحًا لأنه يمكنك بعد ذلك رؤية الشريط بالعين المجردة على الغشاء. مرة أخرى سيكون هذا سببًا لعدم نشر اللطخة.

يمكن تحرير الصورة بشكل غير ضار عبر الضغط والشاشات والفلاتر وما إلى ذلك كما ذكر آخرون في التعليقات. هذه هي الطريقة الوحيدة التي يمكنني التفكير بها للحصول على صورة مماثلة تجريبياً. طريقة أخرى لا أعتقد أنه يجب الإبلاغ عن الصورة كما هي.


فيما يلي مثال على لطخة كيميائية:

بالنسبة لأولئك الذين يهتمون ، فإن العمود الأول على اليسار هو معيار الوزن ، والعمودان التاليان عبارة عن حبيبات مجمعة ، والباقي يزيدون أجزاء من فيروس نقص المناعة البشرية المنقى باستخدام جسم مضاد وحيد النسيلة للفأر (قفيصة).

هذه البقعة نظيفة جدًا (على الرغم من أنها كانت مخيبة للآمال جدًا بالنسبة لعملي ...) ولكن إليك واحدة تبدو أقل من مثالية ، وربما تشبه إلى حد كبير مثالك:

هذه هي lysates و pelleted طاف من Jurkat غير المصابة (يسار) و HIVIIIB (يمين) الثقافات المصابة ، تم اكتشافها باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ tsg101.

أتفق مع تعليق shigeta بأن صورتك قد لا تكون بالضبط ما أتوقعه ، لكن هذا لا يعني بالضرورة أنه تم بشكل ضار ؛ كما ترون ، يمكن أن يكون هناك قدر كبير من الاختلاف في كيفية ظهور البقع اعتمادًا على المعدات المستخدمة ونوع الغشاء والبروتين نفسه وما إلى ذلك. أحاول أن أكون متحفظًا جدًا مع مرشحات الصور ولكن هناك كثيرا يمكنك القيام به مع هؤلاء الأشخاص الذين يمكن أن يكونوا مظللين ولكنهم لا يصلون إلى مستوى Photoshop.


لطختي الغربية الفاشلة

خلفية عالية: من الصعب تحديد سبب ذلك بالضبط دون حدوث مشكلة في إطلاق النار على التجربة الفردية. لم أستخدم هذا الجسم المضاد لـ MLC ولا أعرف حتى ما إذا كنت تقوم بعمل النيترو السليلوز أو PVDF. بشكل عام ، يمكنك اللعب مع الحجب ، ومخففات الجسم المضاد ، والغسيل ، وما إلى ذلك لمحاولة تنظيف ذلك. (يجب أن أقول الخلفية العامة وليس النطاقات غير المحددة.)

وصمة عار غير مستوية: لذلك يمكنني أن أرى أن الخلفية الخاصة بك تصبح أفتح وأن نطاقاتك تعمل بشكل جيد كما تبدأ في الانتقال إلى يسار أو يمين الصورة على MLC. في تجربتي هذا ناتج عن واحد أو مجموعة من ثلاثة أشياء. 1) النقل غير المتكافئ ، 2) اللطخة الثانوية أو الأولية غير المتساوية ، و 3) التطبيق السيئ لركيزة ECL الخاصة بك. أود 1) إعادة ECL فورًا عندما ترى هذا. إذا كان يبدو هو نفسه بالضبط فأنت تعلم أنه ليس كذلك. 2) أعد لطختي في نفس المرحلة الأولية وقم بحضانة أطول (س / س) أو شيء من هذا القبيل (لست متأكدًا مما فعلته هنا) للتأكد من أنني حصلت على بقعة جيدة من الأجسام المضادة ثم أعد إجراء المرحلة الثانوية وجميع الغسلات وفضح مرة أخرى. إذا كان لا يزال يبدو كما هو ، فمن المحتمل أنك حصلت على نقل سيء.

فقاعات. هل ترى كيف أن الشريط الموجود على الجانب الأيمن من الفقاعة العلوية ينثني على طول محيط الفقاعة؟ يحدث هذا بسبب فقاعة أثناء النقل ويشير إلى أن البقعة الخاصة بك قد استغلّت نوعًا ما في هذا الصدد. سوف تضطر إلى تكراره. كن أكثر حذرا من الفقاعات.

انحناء العصابات الخاصة بك ، تبتسم العصابات الخاصة بك قليلاً على اليمين. يمكن أن يكون الكثير من الأشياء. سأحاول ترك ممر فارغ في نهايات الجل الخاص بك وأملأ ذلك الممر الفارغ بمخزن التحميل المخفف في المخزن المؤقت للاستخراج بحيث يكون لديك حتى تركيزات أيونية عبر الهلام الخاص بك. يمكن أن يساعد كثيرا في ذلك. كما يمكنك تشغيله بجهد / أمبير أقل وأحيانًا يمكن أن يساعدك ذلك. كما يمكن أن تكون نتيجة الضغط المفرط على الجل أثناء النقل مما تسبب في تشوهه. كن حذرا من ذلك.

تلطيخ GAPDH غير متساوٍ. إما أنك لم تتحكم حقًا في التحميل أو أنك لم تقم بعمل جيد مع بقعة الأجسام المضادة / ECL. أعتقد أن الجسم المضاد / ECL. عليك توخي الحذر من ذلك أو لا يمكنك استخدامه لأنه ، على سبيل المثال ، ستبدو الكثافة النسبية أعلى للعصابات الموجودة على يسار الجل لأنها ستكون ذات صلة بـ GAPDH الخافت صناعياً وليست انعكاسًا للبروتين المحمّل .

هذا كل ما لدي الآن

عدل: من أجل الوضوح ولأن الوقت مبكر وأنا غبي

تعديل: أيضًا لإضافة هذا هو مجرد رأيي من النظر إلى تجربة لا أعرف المعلمات ولم أفعلها. سوف تحتاج إلى مشكلة في تصوير هذه الأشياء بنفسك


تنقية البروتين وتحليله: الجيل القادم من تقنيات النشاف الغربية

النشاف الغربي هو أحد أكثر التقنيات شيوعًا في البيولوجيا الجزيئية والبروتيوميات. نظرًا لأن النشاف الغربي هو بروتوكول متعدد الخطوات ، يمكن أن تحدث الاختلافات والأخطاء في أي خطوة مما يقلل من موثوقية هذه التقنية وإمكانية تكرار نتائجها. تشير التقارير الحديثة إلى أن بعض الخطوات الرئيسية ، مثل طريقة تحضير العينة ، وكمية ومصدر الجسم المضاد الأولي المستخدم ، بالإضافة إلى طريقة التطبيع المستخدمة ، تعتبر بالغة الأهمية لنتائج لطخة غربية قابلة للتكرار. المجالات المشمولة: في هذه المراجعة ، تم تلخيص التحسينات في مناطق مختلفة من النشاف الغربي ، بما في ذلك نقل البروتين والتحقق من صحة الجسم المضاد. تناقش المراجعة تقنيات النشاف الغربية الأكثر تقدمًا المتاحة وتسلط الضوء على العلاقة بين الجيل القادم من تقنيات النشاف الغربية وأهميتها السريرية. تعليق الخبراء: على مدى العقد الماضي ، تم إجراء تحسينات كبيرة في إنشاء تقنيات أكثر حساسية وآلية ومتقدمة من خلال تحسين الجوانب المختلفة لبروتوكول لطخة ويسترن. تم تطوير طرق جديدة مثل اللطخة الغربية ذات الدقة الخلوية المفردة ، والرحلان الكهربائي الشعري ، و DigiWest ، والنشاف الغربي الميكروفلويد الآلي ، والرحلان الكهربي الدقيق لتقليل المشكلات المحتملة المرتبطة بتقنية النشاف الغربي. تقدم التطورات المبتكرة في الأجهزة والحساسية المتزايدة للبقع الغربية إمكانيات جديدة لزيادة الآثار السريرية لللطخة الغربية.

الكلمات الدالة: النشاف الغربي المناعي تقنيات النشاف الغربي من الجيل القادم لإعداد عينة بروتين تنقية البروتين النشاف الغربي.


الجمع بين النتائج من المواد الهلامية المختلفة في لطخة ويسترن - (يونيو / 04/2008)

مرحبا جميعا،
أستخدم لطخة ويسترن لمقارنة مستويات بروتينات معينة في حالتين مختلفتين. أستخدم ألفا توبولين لتطبيع النتائج (باستخدام برنامج labworks). أتساءل كيف يمكنني دمج البيانات التي أحصل عليها من مجموعة تجارب إلى أخرى؟ افترض أن لدي 5 أنواع مختلفة من المواد الهلامية وبالتالي 5 أغشية مختلفة. كيف يمكنني الجمع بين نتائج بروتين معين من كل هذه الأغشية؟
شكرا
السايح

طالما لديك تطبيع التوبولين ، يجب أن تكون على ما يرام. بالنظر ، بالطبع ، إلى أن هذه هي نفس الخلايا ويتم علاجها بنفس الظروف. يمكنك قص ولصق ممرات اللطخة الغربية (مع الاحتفاظ بمسافات طفيفة بينهما) و / أو عمل رسم بياني بأرقام تقدير كمي كأشرطة منفصلة أو شريط واحد بأشرطة خطأ.

طالما لديك تطبيع التوبولين ، يجب أن تكون على ما يرام. بالنظر ، بالطبع ، إلى أن هذه هي نفس الخلايا ويتم علاجها بنفس الظروف. يمكنك قص ولصق ممرات اللطخة الغربية (مع الاحتفاظ بمسافات طفيفة بينهما) و / أو عمل رسم بياني بأرقام تقدير كمي كأشرطة منفصلة أو شريط واحد بأشرطة خطأ.

شكرا على الرد. ماذا لو تم استخدام وقت تعرض مختلف أو تركيز مختلف للأجسام المضادة لأغشية مختلفة (ينتج عنه قيم IOD مختلفة للمواد الهلامية المختلفة)؟ كيف تصحح ذلك؟ كيف ستتمكن من دمج جميع البيانات وعرضها في شريط واحد فقط؟

لا توجد مشكلة في التطبيع إذا تمت معايرة نظام Westernblot وتعرف أن المرحلة الخطية لأفلام التصوير الذاتي المناعي تصل إلى تشبع سريع نسبيًا يتم تحقيق خطي أعمق بواسطة مقياس الكثافة


أشياء للإعتبار

سواء كنت تستخدم فيلم الأشعة السينية أو مصور CCD لتصوير البقع ، فهناك بعض المعلمات التي يجب وضعها في الاعتبار. ربما يكون مصدر القلق الأكثر صلة هو حساسية التقنية التي تستخدمها: ما مدى سطوع إشارتك ، وما مدى صعوبة اكتشافها؟ ستعتمد قوة الإشارة على الكثير من المتغيرات ، بما في ذلك كمية البروتين الموجودة لديك وتركيزات الأجسام المضادة الأولية والثانوية التي استخدمتها. إذا كنت تستخدم فيلمًا ، فسيتم الضغط على سطح البقعة مباشرةً مقابل الفيلم ، لذلك سيتم اكتشاف أي إشارة قادمة. ومع ذلك ، إذا كنت تستخدم جهاز تصوير ، فيجب أن ينتقل الضوء من مرحلة التصوير إلى الكاشف ، والتي غالبًا ما تكون مسافة 12 بوصة أو أكثر. هذا يعني أنه يجب تعريض إشارة ذات قوة مماثلة لفترة أطول للحصول على نفس النتيجة النهائية (أو الصورة). لهذا السبب ، غالبًا ما توصي الشركات التي تصنع أجهزة تصوير CCD بحلول تطوير خاصة تولد إشارة أكثر إشراقًا.

للحصول على مقارنة مفصلة بين هاتين الطريقتين المختلفتين للتصوير ، ألق نظرة على هذه المقالة السابقة.


6 طرق لمنع نتائج لطخة غربية ضعيفة

يمكن أن تكون نتائج اللطخة الغربية هي أهم ما يميز اليوم ، أو أسوأ كابوس للعالم. لسوء الحظ ، عادةً ما يتضح أنه الأخير من الاثنين. بعد يوم طويل من العمل الشاق ، لا شيء يمكن أن يفسد اليوم أكثر من رؤية نتائج لطختك الغربية تظهر بشكل غير مقروء وغير قابل للقراءة. لحسن الحظ ، هناك العديد من الطرق لمنع البقعة الفوضوية وإصلاحها لضمان حصولك على أفضل النتائج الممكنة ، بدلاً من أن ينتهي بك الأمر بشيء مروع مثل الصورة أدناه. لتجنب هذه المواقف ، أوجزت بعض النصائح التي يجب وضعها في الاعتبار قبل الخضوع لاختبار لطخة غربية.

صور مثل هذه ترسل قشعريرة من خلال العمود الفقري.

1. اختر الغشاء المناسب للتطبيق الخاص بك

عادة ما يكون PVDF (بولي فينيلدين ديفلورايد) ونيتروسليلوز أكثر الأغشية شيوعًا لاختبار اللطخة الغربية. ومع ذلك ، كلاهما لهما خصائص مختلفة يمكنك الاستفادة منها اعتمادًا على نوع الاختبار. على سبيل المثال ، يعتبر PVDF الخيار الأكثر ديمومة ويمكنه التعامل مع إعادة الفحص بشكل أفضل من أغشية النيتروسليلوز ، والتي تكون هشة وبالتالي أكثر عرضة لفقدان الإشارة مرة واحدة بعد إعادة فحصها وتجريدها. إذا وجدت أنك تختبر باستخدام عدد كبير من البروتينات ، ولن يتطلب منك الاختبار تجريد الغشاء وإعادة فحصه ، فربما يمكنك تجربة غشاء النيتروسليلوز. على الرغم من أنها تعتبر حساسة لامتلاكها قدرة ربط أقل للبروتين مقارنة بـ PVDF ، إذا كان الاختبار الخاص بك يحتوي على نسبة عالية من البروتين ، فإن التحول إلى النيتروسليلوز يجب أن يساعد في تقليل احتمالية الحصول على إشارة غير محددة.

2. اتبع خطوات الغسيل والكشف بعناية.

يعد غسل الاختبارات بشكل صحيح خطوة أساسية للوصول إلى أفضل النتائج. في بعض الأحيان ، حتى أصغر التغييرات في هذه الخطوة يمكن أن تعني الفرق بين البقع عالية الجودة ومنخفضة الجودة. على سبيل المثال ، عادةً ما يكون Tween-20 هو محلول المنظف الموصى به للاستخدام ، ولكن التبديل إلى NP-40 (منظف أقوى) بدلاً من ذلك يمكن أن يكون حلاً مثاليًا لك لإزالة نطاقات الخلفية العالية.

3. حاول دائمًا استخدام أجسام مضادة عالية الجودة

تمامًا كما هو الحال مع أي "وصفة سرية" تجدها في مطعم ، يأتي "السر" عادةً من شراء المنتجات بأفضل جودة ممكنة. لسوء الحظ ، هناك شركات توزع الأجسام المضادة دون أن يتم اختبارها مسبقًا ، مما يتسبب في إجهاد غير ضروري للعملاء. من المهم دائمًا معرفة كيفية العثور على مورد جيد للأجسام المضادة.

في بعض الأحيان ، يعد خفض التكاليف شرًا ضروريًا ، ولكن يمكن أن يكون مقامرة بالنتائج التي ستحصل عليها. من الضروري اختيار مورد يمكنك الوثوق به ، ولهذا تخضع ABclonal لرقابة صارمة على الجودة مع جميع منتجات الكتالوج الخاصة بنا. إذا كنت مهتمًا ، فراجع قائمة كتالوج الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في مجالات البحث الشائعة التي تتراوح بين علم التخلق ، وتلف / إصلاح الحمض النووي ، والسرطان ، وعلم المناعة.

4. تأكد من أنك تستخدم سرعة الحضانة الصحيحة

من الضروري التأكد دائمًا من أن لديك سرعة اهتزاز صحيحة خلال فترة الحضانة. قد لا يكون الجسم المضاد قادرًا على الارتباط بشكل صحيح إذا تركته يهتز بسرعة كبيرة ، وجعله بطيئًا جدًا سيمنع الارتباط المنتظم للجسم المضاد. تأكد دائمًا من أن سرعة الاهتزاز لديك متوازنة قبل المضي قدمًا في الحضانة لتجنب هذا الخطأ السخيف من إضاعة الوقت بعيدًا عن بحثك.

5. استعادة إشارة محترقة

إذا سبق لك أن صادفت بقعًا غربية بيضاء محاطة بالأسود ، فأنت تعلم أن الشعور المخيف باكتشاف نتائجك انتهى بإشارة محترقة. قد يعني هذا أنك أضفت بعض الركيزة المضيئة الإضافية حول غشاءك أو نقل الكاسيت الذي يتسبب في تلف الإشارة. كحل سريع ، حاول إخراج الغشاء بعناية (ربما باستخدام بعض الملاقط) ثم تخلص من السائل الزائد برفق. تأكد أيضًا من تنظيف أي ركيزة متبقية على شريط النقل بمنشفة ورقية دون لمس الغشاء.

قد تكون الإشارة المحترقة أيضًا بسبب تركيزات البروتين العالية التي تفسد الركيزة المضيئة. إذا حدث هذا لاختبارك ، فيمكن استرداد الإشارة عن طريق معايرة محللة البروتين وتمييع الأجسام المضادة.

6. اختيار حق منع المخزن المؤقت.

إذا كنت تريد التأكد من ظهور بقع نظيفة ، فإن اختيار عامل المنع المناسب للغرب الخاص بك هو السبيل للذهاب. في حين أن استخدام العوامل المعتمدة على الحليب هو الطريقة الشائعة للذهاب ، فمن المهم أن تتذكر أن هذه المخازن المؤقتة للحظر قد تحتوي على البيوتين الداخلي ، والبروتينات السكرية ، والإنزيمات التي يمكن أن تسبب مشاكل في الإشارة ، مما ينتج عنه خلفيات عالية. في هذه المواقف ، قد ترغب في استخدام بدائل مثل المخزن المؤقت لمنع BSA. قبل القيام بذلك ، تأكد دائمًا من التحقق مما إذا كان الجسم المضاد يحتاج إلى عامل منع مفضل وتركيز حتى يعمل بشكل جيد أثناء الاختبار. على الرغم من أن حل الحظر بنسبة 1-5٪ هو الأكثر موصى به في كثير من الأحيان ، تحقق دائمًا جيدًا قبل المضي قدمًا في الاختبار.


نأمل أن تكون هذه النصائح مفيدة لك ولشركائك في المعمل لتجنب لطخة غربية فقيرة أخرى قبيحة. لمزيد من القراءة والمزيد من النصائح المفيدة لأبحاثك وتجاربك ، تحقق من قائمة المدونات المنسقة هنا لمعرفة المزيد حول التقنيات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها التجريبية.

أيضًا ، إذا كنت مهتمًا بمراجعة خط منتجات Tanon للاختبارات الغربية الخاصة بك ، فانقر هنا.


أنواع مختلفة من الرحلان الكهربائي الهلامي للبروتينات

يمكن للمرء أن يختار من بين أنواع مختلفة من الرحلان الكهربائي للهلام للبروتينات اعتمادًا على المعايير التي يجب بها فصل البروتينات. بعض طرق الرحلان الكهربي شائعة الاستخدام هي: SDS-PAGE ، والتركيز الكهروضوئي الأصلي.

SDS- الصفحة:

هذه طريقة تغيير طبيعة لأنها تعالج البروتينات بمنظف SDS الأنيوني (كبريتات الصوديوم). يتم تدمير البنية الثانوية والثالثة من خلال هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك ، يربط SDS البروتينات وبالتالي يغطي شحناتها الكيميائية ، مما يؤدي إلى بروتينات سالبة الشحنة. لذلك يحدث الفصل التالي فقط بحجم سلاسل البولي ببتيد في هلام بولي أكريلاميد.

الموصى بها SDS-PAGE عازلة ومجموعات

الصفحة الأصلية:

يمكن فصل البروتينات الأصلية وغير المطوية وغير المشوهة باستخدام هذه الطريقة. تسمح هذه الطريقة بفصل البروتينات التي لا يمكن الوصول إليها بطرق أخرى. أحد الأمثلة على ذلك هو فصل البروتينات المعدلة وغير المعدلة من نفس النوع (على سبيل المثال ، حالة الفسفرة مقابل حالة البروتين غير المُفسفرة). يمكن أيضًا استخدام الصفحة الأصلية لتأكيد المطابقات ذات الصلة بيولوجيًا ، مثل الأشكال الثنائية أو الثلاثية أو الرباعية للبروتينات (على عكس SDS-PAGE ، والتي من شأنها فصل سلاسل الببتيد الفردية وسلاسل الببتيد المشوهة). يمكن لهذه الطريقة أيضًا اكتشاف مجمعات مختلفة من البروتينات المختلفة.

يعتمد الفصل باستخدام PAGE الأصلي على عدد من المعلمات مثل الشحنة, بحجم و هيكل ثلاثي الأبعاد من البروتين. هناك حاجة إلى مخزن مؤقت مناسب للحفاظ على طي ثلاثي الأبعاد للبروتين. تعتمد قابلية تطبيق المخزن المؤقت على نقطة تساوي الكهرباء وشحنات البروتين.

التركيز الكهروضوئي:

تعتمد هذه الطريقة على حقيقة أن البروتين له شحنة معينة عند قيم معينة للأس الهيدروجيني. اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني ، تساهم المجموعات الوظيفية الحمضية والأساسية بزيادة أو تقليل الشحنة الكلية للبروتين. تُعرَّف النقطة المتساوية بأنها النقطة التي تكون فيها الشحنة الإجمالية للجزيء صفراً ، لأن هناك كمية متساوية من الشحنات السالبة والموجبة في الجزيء.

هناك حاجة إلى مواد هلامية متدرجة خاصة للتركيز الكهروضوئي حيث يتغير الأس الهيدروجيني من الحمضي إلى الأساسي على طول التدرج داخل الهلام. بسبب الشحنة الكهربائية المتصلة بالهلام ، ينتقل البروتين إلى النقطة الموجودة في الهلام حيث تساوي شحنة الهلام شحنة البروتين ، والشحنة الإجمالية تساوي صفرًا ، أي النقطة المتساوية الكهربية. ومن ثم ، تُستخدم هذه الطريقة لفصل البروتينات بشحناتها ، وكذلك لتحديد نقطة تساوي الكهرباء للبروتين المستهدف. يحدث الانفصال بسبب شحنة البروتين أو بسبب عدد المجموعات الأساسية والحمضية التي يحتوي عليها البروتين.

يمكن أيضًا دمج الطرق المذكورة أعلاه للهلام الكهربائي للبروتينات لفصل البروتينات. يعتمد اختيار الطرق على المتطلبات المحددة للتجربة.


قياس النتائج الجزيئية

عند البحث عن أدوية جديدة ، يواجه العلماء العديد من التحديات. لسبب واحد ، يجب أن يعمل الدواء و [مدش] بمعنى أنه يظهر فعاليته للحالة التي تم التخطيط لعلاجها ويحتاج العلماء إلى كشف آلية العمل. لفهم كيفية عمل الدواء حقًا ، يجب على العلماء استكشاف العواقب الجزيئية لإعطائه ، ويمكن استخدام النشاف الغربي في مثل هذه الدراسات.

على سبيل المثال ، استخدم فريق بحثي من مركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس في هيوستن النشاف الغربي لدراسة ردود الفعل المختلفة على البوبارليسيب (BKM120) في مرضى اللوكيميا. باختصار ، BKM120 يثبط phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) ، وهو جزء من مسار الإشارات الذي يتحكم في نمو وانتشار اللوكيميا. وفقًا للمعهد الوطني الأمريكي للسرطان ، فإن تأثير BKM120 و rsquos على PI3K و ldquom قد يؤدي إلى تثبيط نمو الخلايا السرطانية والبقاء على قيد الحياة في مجموعات الخلايا السرطانية المعرضة للإصابة. & rdquo

المادة ذات الصلة: نظام تحرير الجينات الخاص بالجسم و rsquos يولد الخلايا الجذعية لسرطان الدم

أجرى Naval G. Daver ، الأستاذ المساعد في قسم MD Anderson & rsquos لسرطان الدم وزملاؤه تجربة المرحلة الأولى على مرضى اللوكيميا لتحديد سمية الحد من جرعة BKM120. باستخدام النشاف الغربي ، أظهروا تثبيط علامات المرض فوق 50 في المائة في أكثر من نصف المرضى ، كما ورد في المجلة الأمريكية لأمراض الدم في عام 2016.

حتى عندما يجد الباحثون عقاقير تعمل من أجل الأمراض ، فإن هذا لا يعني أنها ستعمل دائمًا. يمكن أن تزداد مقاومة الأمراض ، بما في ذلك اللوكيميا ، للعلاج الذي أثبت في البداية فعاليته في المريض. على سبيل المثال ، درس فريق من العلماء الصينيين مقاومة الأدوية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) ووصف النتائج التي توصلوا إليها في عدد عام 2014 من بلوس واحد (الآن PLOS ONE) (دوى: 10.1371 / journal.pone.0105381). كما كتب العلماء: لا تزال مقاومة الأدوية تمثل عقبة رئيسية أمام العلاج الناجح لسرطان الدم النخاعي الحاد ، ولم يتم توضيح الآلية الأساسية بالكامل. وكشف عملهم أن الإفراط في التعبير عن الجين التنظيمي ، c-Myc ، يمكن أن يولد مقاومة للعلاج الكيميائي المخدرات. باستخدام تقنيات النشاف و [مدش] بالإضافة إلى تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل و [مدش] كشف هؤلاء العلماء أن الإفراط في التعبير عن c-Myc يقلل من عائلة من البروتينات الرابطة وأن زيادة هذه البروتينات نفسها يمكن أن تعيد فعالية دواء AML. وخلصوا إلى أن: & ldquo ؛ وهكذا ، أشارت دراستنا إلى أن c-Myc يمكن أن يكون هدفًا جديدًا للتغلب على مقاومة الأدوية ، مما يوفر نهجًا جديدًا في علاج AML. & rdquo بالنسبة للعديد من مرضى السرطان ، فإن إيجاد طرق لتوسيع فعالية العلاج يعني الفرق بين الحياة والموت ، وفهم الفروق الدقيقة الجزيئية التي تحرك المقاومة أو تعطلها يساعد علماء الأدوية على توفير هذه العلاجات المنقذة للحياة.


هل يمكن أن تكون هذه الصورة نتيجة لطخة ويسترن؟ - مادة الاحياء

اعتقدت اليوم أنني سأدخل في تفاصيل صغيرة حول واحدة من أكثر التقنيات التجريبية شيوعًا المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية - وهي الطريقة التي قمت بها عدة مرات هذا الصيف - لطخة غربية.

بشكل عام ، تعتبر البقع الغربية تقنية تُستخدم لتحديد وجود بروتين معين من عينة بيولوجية. على سبيل المثال ، لنفترض أنك أدخلت بلازميدًا يحمل جين هيدروجيناز الكحول إلى الإشريكية القولونية وتريد التحقق لمعرفة ما إذا كانت البكتيريا تقوم بنسخ الجين وترجمته. طريقة سهلة للتحقق من ذلك باستخدام لطخة غربية. الغربيون أيضًا تقنية تشخيصية مفيدة في المختبرات الطبية: يمكن للغرب أن يخبرك ما إذا كان حجم البروتين خاطئًا ، أو إذا كان بروتين معين من فيروس أو بكتيريا موجودًا في عينة من المريض.

النظرية وراء Western Blotting بسيطة إلى حد ما. أولاً ، أنت بحاجة إلى عينة من البروتينات. يمكن الحصول عليها بعدة طرق ، لكن الطريقة الأكثر دراية بها هي من خلال استخدام الصوتنة. تنمو مزرعة من الخلايا التي (من المفترض) تعبر عن البروتين الذي تهتم به. من خلال تعريض هذه الخلايا لأصوات عالية التردد ، تتمزق الخلايا وتنسكب كل محتوياتها. يمكن للمرء بعد ذلك وضع العينة الصوتية في جهاز طرد مركزي ، بحيث تتجمع كل الحطام الخلوي معًا في الجزء السفلي من أنبوب الاختبار ، وتترك البروتينات الموجودة في الخلية تطفو في المادة الطافية.

الآن بعد أن تم عزل جميع البروتينات ، عليك فصلها جميعًا. يتم ذلك باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد. يشكل بولي أكريلاميد شبكة تنتقل عبرها البروتينات عند تطبيق تيار كهربائي. تنتقل البروتينات الأكبر عبر الهلام بشكل أبطأ من البروتينات الأصغر ، وهذا يسمح لنا بعد ذلك بفصل جميع البروتينات بناءً على حجمها. في هذه المرحلة ، يمكن استخدام صبغة البروتين لتلطيخ الجل. سيسمح لنا ذلك بتصور البروتينات الموجودة على الجل بسهولة. لسوء الحظ ، ما لم تكن تعمل مع عينة نقية من البروتين الذي تريده ، سترى مسحة كبيرة لأن الجل يحتوي على جميع البروتينات من الخلايا الصوتية. لتحديد وجود البروتين الذي تريده ، ستحتاج إلى طريقة لتصور البروتين الخاص بك على وجه التحديد وليس الباقي. يتيح لنا النشاف الغربي القيام بذلك بسهولة.

يمكننا أن نتخيل بشكل سريع أي بروتين نريده ، لكن المواد الهلامية المتعددة أكريلاميد لا تسمح لنا بالقيام بذلك. وبالتالي ، فإن الخطوة التالية هي نقل البروتينات إلى وسيط يمكننا استخدامه للبحث عن بروتين معين. مادة شائعة الاستخدام لهذا هو غشاء النيتروسليلوز. يحتوي النيتروسليلوز على خاصية مفيدة للغاية - إلى حد كبير يلتصق أي بروتين به مثل الصمغ (وهذا أيضًا يجعل التعامل معه صعبًا بعض الشيء ، لأنك لا تريد أن تلتصق به البروتينات من يديك وتفسد النتائج. باستخدام تيار كهربائي ، يمكنك إجبار البروتينات الموجودة في الجل على الانتقال إلى النيتروسليلوز ، ثم يجب أن يحتوي الغشاء على البروتينات المفصولة كما كانت على الجل.

أنت الآن جاهز لاكتشاف بروتينات معينة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام الأجسام المضادة ضد البروتين الذي تهتم به. تبيع العديد من الشركات أجسامًا مضادة للبروتينات شائعة الاستخدام. بدلاً من ذلك ، يمكنك تصميم البروتين الخاص بك بحيث يحتوي على "علامة" - سلسلة قصيرة من الأحماض الأمينية - في أحد طرفي البروتين الذي لا يوجد في البروتينات المنتجة بشكل طبيعي في الخلايا. يمكنك شراء الأجسام المضادة التي تتعرف على العلامات المختلفة ، وبالتالي ترتبط فقط بالبروتين الذي يهمك. سترتبط هذه الأجسام المضادة مباشرة بالبروتينات الموجودة على الغشاء. بعد ذلك ، يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية. هذه سوف ترتبط على وجه التحديد بالأجسام المضادة الأولى.

الأجسام المضادة الثانوية هي المفتاح لاكتشاف البروتين الخاص بك. يرتبط الأنزيم بالأجسام المضادة الثانوية. أي إنزيم متصل هو مسألة طريقة الكشف المستخدمة. توجد طرق متعددة للكشف ، ولكن أكثر الطرق شيوعًا هي الكشف عن اللمعان الكيميائي وإنتاج الصباغ. تعمل كلتا الطريقتين بطريقة مماثلة مرتبطة بالجسم المضاد وهو إنزيم يقوم بتحويل الركيزة إلى منتج عند تطبيقه على الغشاء. في حالة إنتاج الصباغ ، يكون المنتج عبارة عن صبغة يمكن رؤيتها بدقة على الغشاء. في حالة الكشف عن اللمعان الكيميائي ، ينتج عن التحويل من الركيزة إلى المنتج الضوء ، والذي يمكن اكتشافه على قطعة من فيلم الأشعة السينية. في كلتا الحالتين ، تكون النتيجة عبارة عن شريط مظلم يمثل البروتين الذي يهمك. عندما يكون هناك شريط مظلم ، يوجد جسم مضاد / إنزيم ثانوي حيث يوجد جسم مضاد ثانوي ، يوجد جسم مضاد أولي وحيث يوجد جسم مضاد أولي ، هناك بروتين مهم.


الطريقتان الرئيسيتان

هناك طريقتان للتطبيع عند تقييم لطخة غربية: الكشف عن البروتين الفردي والتطبيع الكلي للبروتين.

إلى حد بعيد ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا للكشف عن البروتين الفردي هي استخدام بروتينات التدبير المنزلي. إن وفرتها داخل عينة تعمل بمثابة وكيل لمجموع البروتين بأكمله. مفتاح النجاح في هذا النهج هو بناء التطبيع على بروتين يمكن أن يلعب دور المعيار الداخلي. هذا يعني أن بروتين التدبير المنزلي الخاص بك لن يكون هدفك ، ولكن يجب أن يظل موجودًا في كل مكان ويتم التعبير عنه باستمرار في عينتك. لحسن الحظ ، بفضل طبيعة بروتينات التدبير المنزلي ، تتوفر الأجسام المضادة لها بسهولة ويسهل اكتشاف البروتينات في كل مكان.

لكن الدكتور أوه يحذر من وجود قيود على استخدام الكشف عن بروتين واحد. يجب إنشاء عناصر تحكم إيجابية وسلبية بشكل منفصل ، ويجب اختبار مستويات التعبير البروتيني المتسقة عبر عينات مختلفة ، ويجب تأكيد استجابة إشارة خطية عددية عبر مجموعة من كميات تحميل البروتين (Janes 2015). كل ذلك ضروري ، ولكنه أيضًا شاق ويستغرق وقتًا طويلاً.

ومع ذلك ، عند إجراء تطبيع البروتين الكلي ، الكل يتم تصور البروتينات في العينة وتعمل وفرتها الإجمالية كأساس للتطبيع. يعد عدم الاعتماد على بروتين التدبير المنزلي خروجًا عن الأسبقية التاريخية التي تم استخدامها لتطبيع التدبير المنزلي لأكثر من 30 عامًا. ولكن ، غالبًا ما يثبت تطبيع البروتين الكلي أنه خيار أكثر دقة.

تذكر أن الغرض من التطبيع هو مراعاة الاختلافات في البروتين الكلي لكل عينة الناشئة عن خطأ تجريبي. ما هي أفضل طريقة لقياس هذه الاختلافات من قياس في الواقع مجموع وفرة البروتين لكل عينة؟ يتم تحقيق التطبيع الكلي للبروتين من خلال تلطيخ قابل للعكس (يحدث قبل الكشف المناعي) ، أو تلطيخ لا رجعة فيه (يحدث بعد الكشف عن المناعة) ، أو طرق خالية من البقع. وتطبيع البروتين الخالي من البقع فريد من نوعه.


محتويات

يشبه إجراء dot blot في الفكرة إجراء لطخة غربية ، مع ميزة السرعة العالية والتكلفة المنخفضة.

يتم أيضًا إجراء لطخات نقطية لفحص إمكانيات الارتباط لجسم مضاد. [2]

يتضمن بروتوكول لطخة النقطة العامة اكتشاف 1-2 ميكرولتر من العينات على غشاء النيتروسليلوز أو PVDF وتركه يجف في الهواء. يمكن أن تكون العينات على شكل طاف لزراعة الأنسجة ، أو مصل الدم ، أو مستخلصات الخلايا ، أو مستحضرات أخرى. [3]

يتم تحضين الغشاء في سد العازلة لمنع الارتباط غير المحدد. ثم يتم تحضينها بجسم مضاد أولي متبوع بجسم مضاد للكشف أو جسم مضاد أولي مترافق مع جزيء كشف (عادةً HRP أو فوسفاتيز قلوي). بعد ارتباط الجسم المضاد ، يتم تحضين الغشاء باستخدام ركيزة مضيئة كيميائيًا ويتم تصويره.

يتم إجراء لطخة نقطية بشكل تقليدي على قطعة من غشاء النيتروسليلوز أو غشاء PVDF. بعد أن يتم رصد عينات البروتين على الغشاء ، يتم وضع الغشاء في وعاء بلاستيكي ويتم تحضينه بالتتابع في محاليل مانعة للأجسام المضادة أو محلول شطف على شاكر. أخيرًا ، لتصوير اللمعان الكيميائي ، يجب لف قطعة الغشاء في فيلم بلاستيكي شفاف مملوء بركيزة الإنزيم.

تم استخدام جهاز التفريغ النقطي للمساعدة في تسهيل عملية الشطف والحضانة باستخدام التفريغ لاستخراج المحلول من أسفل الغشاء ، والذي يتم تجميعه بين عدة طبقات من الألواح لضمان الختم الجيد بين آبار العينة ، ومحلول النفايات ، و توصيل قوة الشفط. للكشف عن إشارة اللمعان الكيميائي ، يجب تفكيك الجهاز وإخراج الغشاء ولفه في فيلم بلاستيكي شفاف.


شاهد الفيديو: العلاج السحري لكل أنواع الحساسية و الهيستامين بدون أدوية (كانون الثاني 2022).