معلومة

كيف تختلف المواد الهلامية SDS-PAGE في نظام Bis-Tris مقابل نظام Tris-Glycine؟

كيف تختلف المواد الهلامية SDS-PAGE في نظام Bis-Tris مقابل نظام Tris-Glycine؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يهاجر البروتين بشكل مختلف في هلام Bis-Tris و Tris-Glycine. كنت أشعر بالفضول لمعرفة الأسباب الحقيقية لذلك. هل ينتج عن أنظمة جل معينة دقة أكثر تشددًا من غيرها؟


يعتمد نظام SDS PAGE على حقيقة أن البروتين محوَّل ومُحاط بمزيل منظف سالب الشحنة SDS. هذا يلغي معظم الاختلافات في الشحنة والذوبان الخاص من بروتين إلى آخر ويعطي فصلًا معقولًا يعتمد فقط على حجم البروتين المرتبط بحجم جزيء SDS حول كل جزيء.

تتميز المخازن المؤقتة Bis-Tris و Tris-glycine بخصائص مختلفة تمامًا لتدريع الشحن. ثنائي (المعروف أيضًا باسم 2- [Bis (2-hydroxyethyl) amino] -2- (hydroxymethyl) -1،3-propanediol) يحتوي على أمين ثلاثي مع pKa 6.46 و pKb 7.54. الجلايسين هو zwitterion عند أي درجة حموضة بين 2.3 و 9.6. هذا يخلق اختلافًا في الطريقة التي يحمي بها المخزن المؤقت مذيلات SDS PAGE من بقية المجال الكهربائي ، مما يؤدي إلى إبطاء (ربما يبطئ الجلايسين الأشياء قليلاً) وقت الحل ، ولكن أيضًا يمنح micelles مزيدًا من الوقت للهجرة.

لذلك بالنسبة لأنظمة SDS PAGE ، فإن دقة الهلام لها على الأقل علاقة بحجم مسام الجل (بناءً على نسب الأكريلاميد و bis-acrylamide) ، كمية البروتين التي تضعها في حجم معين من التحميل حسنًا ، والاختلافات في حجم العصابات التي تربطها بفصلها. (يجب أن تكون محظوظًا جدًا لفصل النطاق 100.54 كيلو دالتون عن النطاق 100.85 كيلو دالتون ، ولكن 1.5 إلى 1.8 كيلو دالتون أسهل من 10 إلى 14 كيلو دالتون). ضع في اعتبارك أيضًا ضبط التيار أو الجهد لمصدر الطاقة. يعتبر نظام التخزين المؤقت أحد الاعتبارات فقط عند التخطيط لتجربتك ، وغالبًا ما لا يكون العامل الأساسي للجودة.


خلفية

الرقم الهيدروجيني للهلام الفاصل في SDS-PAGE "القياسي" (المعروف أيضًا باسم نظام Laemmli العازلة) هو تقريبًا 8-9 مما يؤدي إلى نزع الأمين وألكلة البروتينات ، بالإضافة إلى إعادة أكسدة السيستين المختزل أثناء الرحلان الكهربائي. ما يعنيه هذا هو أن البروتين الخاص بك سيشكل روابط متقاطعة لثاني كبريتيد أثناء حدث التراص لأن البروتين ينتقل إلى الهلام بعيدًا عن كاشف الاختزال في المخزن المؤقت للعينة ، ويتركز على تركيز عالٍ. المواد الهلامية المصنوعة من مادة الأكريلاميد المصبوبة في المحاليل القلوية تكون أيضًا غير مستقرة أثناء التخزين على المدى الطويل ، وتتحلل إلى حمض الأكريليك بعد شهر إلى شهرين مما يؤدي إلى فقدان حجم المسام وضعف الدقة والبروتينات المعدلة.

في هذا البروتوكول ، يتم قمع إعادة أكسدة السيستين في هلام عن طريق الصب والتشغيل تحت حمضية قليلاً (

الرقم الهيدروجيني 6.5) الظروف التي تفضل بروتون السيستين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تضمين عامل الاختزال ، بيسلفيت الصوديوم ، في المخزن المؤقت للتشغيل وسوف ينتقل إلى الجل ويحافظ على بيئة مختزلة. ميزة أخرى لنظام الهلام هذا هي أن بروتينات MW المنخفضة بالقرب من الجبهة العازلة لا تتسارع قرب نهاية المدى إلى نفس الدرجة كما هو الحال في Laemmli Buffers. والنتيجة هي دقة أعلى وتوزيع نطاق لا يختلف عن هلام التدرج.

تستخدم طبقات التراص والحل للهلام نفس المخزن المؤقت. يتيح ذلك صب المواد الهلامية وتخزينها لفترة طويلة (لا يفسد الانتشار كيمياء التراص). أيضًا ، يتم استخدام نفس المخزن المؤقت للتشغيل في كل من الكاثود والأنود.


عينة bis-Tris MES-Tris Gels الجل الأول من البروتينات النقية. الجل الثاني هو المجموع بكتريا قولونية المحللة مع البروتين المستحث وبدونه. لاحظ نطاق الفصل الواسع لعلامات الوزن الجزيئي.


المكونات الكيميائية وماذا تفعل

ماذا تفعل SDS بالضبط؟
تتكشف البروتينات. يؤدي تطبيق SDS على البروتينات إلى فقدها لهياكلها ذات الترتيب الأعلى وتصبح خطية. نظرًا لأن SDS أنيوني (مشحون سالبًا) ، فإنه يرتبط بجميع الشحنات الموجبة على البروتين ، مما يؤدي إلى تغطية البروتين بشحنة سالبة بشكل فعال.

لماذا نريد أن نغطي البروتين بشحنات سالبة؟
لإزالة الشحنة كعامل في هجرة البروتين من خلال الهلام. يرتبط SDS بالبروتينات ذات التقارب العالي وبتركيزات عالية. ينتج عن هذا أن جميع البروتينات (بغض النظر عن الحجم) لها شحنة سالبة صافية مماثلة ونسبة شحنة إلى كتلة مماثلة. بهذه الطريقة ، عندما يبدأون في التحرك عبر مادة هلامية ، فإن السرعة التي يتحركون بها ستعتمد على حجمهم ، وليس شحنتهم.

بعد التعرض لـ SDS ، هل حجم البروتين هو الشيء الوحيد الذي يؤثر على انتقاله من خلال الهلام؟
إنه إلى حد بعيد العامل الأكبر. ومع ذلك ، يمكن أن يرتبط SDS بشكل مختلف ببروتينات مختلفة. قد ترتبط البروتينات الكارهة للماء بالمزيد من SDS ، والبروتينات ذات التعديلات اللاحقة للترجمة مثل الفسفرة والجليكوزيل قد تربط أقل SDS. عادة ما تكون هذه التأثيرات ضئيلة ، ولكن ليس دائمًا ، ويجب أخذها في الاعتبار إذا كان البروتين الخاص بك يعمل بوزن جزيئي مختلف عما هو متوقع.

ماذا يوجد في المخزن المؤقت قيد التشغيل؟
تريس ، جلايسين ، و SDS ، الرقم الهيدروجيني 8.3. تريس هو المخزن المؤقت المستخدم لمعظم SDS-PAGE. إن pKa الذي يبلغ 8.1 يجعله مخزنًا مؤقتًا ممتازًا في نطاق 7-9 درجة الحموضة. هذا يجعلها خيارًا جيدًا لمعظم الأنظمة البيولوجية. يساعد SDS في المخزن المؤقت على إبقاء البروتينات خطية. الجلايسين هو حمض أميني تلعب حالة شحنته دورًا كبيرًا في هلام التراص. المزيد عن ذلك بعد قليل.

ماذا يوجد في العينة العازلة؟
Tris-HCl ، SDS ، الجلسرين ، بيتا مركابتوإيثانول (BME) ، بروموفينول بلو. هذا هو المخزن المؤقت الذي تخلطه مع عينات البروتين الخاصة بك قبل تحميل الجل. مرة أخرى مع المخزن المؤقت Tris و pKa الخاص به. يقوم SDS بتغيير طبيعة البروتينات وجعلها خطية ، مما يؤدي إلى تغطيتها بشحنة سالبة. يقوم BME بتفكيك روابط ثاني كبريتيد في البروتينات لمساعدتها على دخول الهلام. يضيف الجلسرين كثافة للعينة ، مما يساعدها على الهبوط إلى قاع آبار التحميل ومنعها من الانتشار خارج البئر بينما يتم تحميل باقي الجل. بروموفينول بلو هي صبغة تساعد في تصور العينات في الآبار وحركتها عبر الهلام. يُعرف مخزن تحميل العينة أيضًا باسم Laemmli Buffer ، والذي سمي على اسم الأستاذ السويسري الذي اخترعه حوالي عام 1970.

ما هو في المواد الهلامية؟
Tris-HCl ، الأكريلاميد ، الماء ، SDS ، بيرسلفات الأمونيوم ، و TEMED. على الرغم من اختلاف قيم الأس الهيدروجيني ، إلا أن كلا من طبقات التراص وحل الهلام تحتوي على هذه المكونات. يوجد Tris و SDS للأسباب الموضحة أعلاه. يعمل بيرسلفات الأمونيوم و TEMED معًا لتحفيز بلمرة الأكريلاميد. تعمل أيونات الكلورين من Tris-HCl مع أيونات الجلايسين في هلام التراص. مرة أخرى ، المزيد في المستقبل.


تعتمد معرفة التدرج الذي تختاره على حجم البروتينات التي تحاول تصورها على هلامك. مع وضع الجدول 1 في الاعتبار ، إليك بعض السيناريوهات والمواد الهلامية المتدرجة المطابقة.

مجموعة من أحجام البروتيننسب منخفضة / عالية من مادة الأكريلاميدتطبيق
4 - 250 كيلو دالتون4% / 20%اكتشاف العمل كنت تبحث عن كل شيء تحت الشمس
10 - 100 كيلو دالتون8% / 15%نهج أكثر استهدافًا ، لكنك تريد تجنب المواد الهلامية المتعددة
50 - 75 كيلو دالتون10% / 12.5%أنت تحاول حل البروتينات ذات الحجم المماثل

تحديد حجم البروتين؟ - (26 فبراير 2008)

يعتمد ذلك على كيفية توصيل المونومرات إذا كانت ثنائيات على الإطلاق. إذا تم إرفاقها بواسطة روابط سيستين ، فلا يزال بإمكانك أداء SDS-PAGE. وإلا فإنه يعتمد على التقنيات المتاحة لك.
لا يوجد في بروتينات PAGE لا تنتقل وفقًا لكتلتها ، وهي خاطئة تمامًا & # 33 فهي تهاجر وفقًا لشحنتها الصافية وشكل هيكلها الثالث.

لا أوافق على أن تقدم PAGE أي معلومات مفيدة حول الحجم نظرًا لأن بروتين PAGE الأصلي المناسب لـ pI يعمل في الاحتفاظ بحجمه

ماذا تقصد؟ لم & # 39t أقول PAGE ، قلت PAGE

ومع ذلك ، من الموثوق به العثور على ظروف التشغيل الصحيحة ، ولا سيما نظام المخزن المؤقت الصحيح ، وهو عمل شاق

أنا لا أعرف الفرق بين هلام الأصلي الأزرق و regulare الذهاب اسأل mdfenko

قلت SDS-PAGE & # 33
إنها طريقة قياسية لتحديد الحجم ، لذا فهي قياسية بحيث يمكنك العثور عليها في كل كتاب نصي في الكيمياء الحيوية تقريبًا.
كما قلت PAGE فاز & # 39t تعطيك أي معلومات حول الحجم. إذا قمت بضبط الأس الهيدروجيني على pI ، فكيف تفترض أن البروتين سيتحرك في المجال الكهربائي؟ وتقرر هل تريد ضبط الرقم الهيدروجيني على pI لبروتين غير معروف أم علامة؟
استرجع كلماتك أو أرني مرجعًا.

كتبت في الأول من مايو: & quot إذا قمت بتشغيل PAGE فلن تعطيك أي معلومات مفيدة حول حجم البروتين الخاص بك. & quot

لذلك ، لقد قمت بمسح PAGE. إذا كنت تفكر من حيث SDS-PAGE ، فيجب تحديدها.

إن تشغيل PAGE الأصلي برقم هيدروجيني pI للبروتين محل الاهتمام في الواقع لا معنى له ولكني لم أوصي بذلك.

لا أوافق على أن تقدم PAGE أي معلومات مفيدة حول الحجم نظرًا لأن بروتين PAGE الأصلي المناسب لـ pI يعمل في الاحتفاظ بحجمه

ماذا تقصد؟ لم & # 39t أقول PAGE ، قلت PAGE

ومع ذلك ، من الموثوق به العثور على ظروف التشغيل الصحيحة ، ولا سيما نظام المخزن المؤقت الصحيح ، وهو عمل شاق

أنا لا أعرف الفرق بين هلام الأصلي الأزرق و regulare الذهاب اسأل mdfenko

قلت SDS-PAGE & # 33
إنها طريقة قياسية لتحديد الحجم ، لذا فهي قياسية بحيث يمكنك العثور عليها في كل كتاب نصي في الكيمياء الحيوية تقريبًا.
كما قلت PAGE فاز & # 39t تعطيك أي معلومات حول الحجم. إذا قمت بضبط الأس الهيدروجيني على pI ، فكيف تفترض أن البروتين سيتحرك في المجال الكهربائي؟ وتقرر هل تريد ضبط الرقم الهيدروجيني على pI لبروتين غير معروف أم علامة؟
استرجع كلماتك أو أرني مرجعًا.

كتبت في الأول من مايو: & quot إذا قمت بتشغيل PAGE ، فلن تعطيك أي معلومات مفيدة حول حجم البروتين الخاص بك. & quot

لذلك ، قمت أيضًا بمسح PAGE بشكل عام. إذا كنت تعتقد أنه من حيث SDS-PAGE ، فيجب تحديده.

إن تشغيل PAGE الأصلي برقم هيدروجيني pI للبروتين محل الاهتمام في الواقع لا معنى له ولكني لم أوصي بذلك.

لسوء الحظ ، فإن BN-PAGE ليست دقيقة في تحديد حجم البروتين ، وذلك لأنها تهاجر اعتمادًا على كمية الكوماسي التي ترتبط بها. يجب أن يكون لدى شخص ما في المبنى الخاص بك FPLC قديم مع عمود ترشيح جل. قم بتشغيل بعض المعايير وربما تكون هذه هي أفضل طريقة لتحديد الوزن الجزيئي. من المحتمل أن يكون HPLC أكثر دقة ولكن يصعب الحصول عليه.

لا أوافق على أن تقدم PAGE أي معلومات مفيدة حول الحجم نظرًا لأن بروتين PAGE الأصلي المناسب لـ pI يعمل في الاحتفاظ بحجمه

ماذا تقصد؟ لم & # 39t أقول PAGE ، قلت PAGE

ومع ذلك ، من الموثوق به العثور على ظروف التشغيل الصحيحة ، ولا سيما نظام المخزن المؤقت الصحيح ، وهو عمل شاق

أنا لا أعرف الفرق بين هلام الأصلي الأزرق و regulare الذهاب اسأل mdfenko

قلت SDS-PAGE & # 33
إنها طريقة قياسية لتحديد الحجم ، لذا فهي قياسية بحيث يمكنك العثور عليها في كل كتاب نصي في الكيمياء الحيوية تقريبًا.
كما قلت PAGE فاز & # 39t تعطيك أي معلومات حول الحجم. إذا قمت بضبط الأس الهيدروجيني على pI ، فكيف تفترض أن البروتين سيتحرك في المجال الكهربائي؟ وتقرر هل تريد ضبط الرقم الهيدروجيني على pI لبروتين غير معروف أم علامة؟
استرجع كلماتك أو أرني مرجعًا.

كتبت في الأول من مايو: & quot إذا قمت بتشغيل PAGE ، فلن تعطيك أي معلومات مفيدة حول حجم البروتين الخاص بك. & quot

لذلك ، لقد قمت بمسح PAGE. إذا كنت تفكر من حيث SDS-PAGE ، فيجب تحديدها.

إن تشغيل PAGE الأصلي برقم هيدروجيني pI للبروتين محل الاهتمام لا معنى له في الواقع ولكني لم أوصي بذلك.

شرح مذهل ، لا أحتاج لقول أي شيء يمكن للقراء قراءة النص المقتبس والحكم & # 33

من الصفحات الرئيسية لـ Invitrogen وجدت معلومات عن نظام Invitrogen BN-PAGE:

نظام NativePAGE ™ Novex® Bis-Tris Gel عبارة عن نظام جل مصغر من البولي أكريلاميد المصبوب مسبقًا يوفر طريقة حساسة وعالية الدقة لتحليل معقدات بروتين الغشاء الأصلي والبروتينات الأصلية القابلة للذوبان وتقديرات الكتلة الجزيئية وتقييم نقاوة المحتوى الأصلي. البروتينات. وهو يعتمد على تقنية الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأزرق الأصلي (BN PAGE) التي طورها Schagger و von Jagow (1-3).

ووصف العلامات:
معيار NativeMark ™ للبروتين غير الملوث هو علامة بروتين جاهزة للاستخدام للسماح بتقدير الوزن الجزيئي الدقيق للبروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام مع Tris-Glycine أو NuPAGE® Novex Tris-Acetate Gels.

لذا من هذا الوصف حصلت على فكرة أنه يمكن الاعتماد عليه لتقدير الوزن الجزيئي. ومقرها في كوماسي وهلام التدرج

من الصفحات الرئيسية لـ Invitrogen وجدت معلومات عن نظام Invitrogen BN-PAGE:

NativePAGE & # 8482 Novex® Bis-Tris Gel System عبارة عن نظام جل مصغر من البولي أكريلاميد المصبوب مسبقًا يوفر طريقة حساسة وعالية الدقة لتحليل مجمعات بروتين الغشاء الأصلي والبروتينات الأصلية القابلة للذوبان وتقديرات الكتلة الجزيئية وتقييم نقاء بروتينات أصلية. وهو يعتمد على تقنية الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأزرق الأصلي (BN PAGE) التي طورها Schagger و von Jagow (1-3).

ووصف العلامات:
معيار NativeMark & ​​# 8482 Unstained Protein Standard هو علامة بروتين جاهزة للاستخدام للسماح بتقدير دقيق للوزن الجزيئي للبروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام مع Tris-Glycine أو NuPAGE® Novex Tris-Acetate Gels.

لذا من هذا الوصف حصلت على فكرة أنه يمكن الاعتماد عليه لتقدير الوزن الجزيئي. ومقرها في كوماسي وهلام التدرج

ساريتا يا صديقي
ذهبت إلى موقع الويب الخاص بهم وقراءته ، لكنني حقًا لا يمكنني قبول اقتباس من موقع ويب كسبب علمي لم يذكروا لماذا وكيف أن PAGE مفيدة في تحديد الكتلة الجزيئية التي قالوها للتو وربما إذا طلبت المزيد من المعلومات الأشخاص داخل تلك الشركة يقولون لك أننا نعني هذا ونعني ذلك.
إذا أحلتني إلى مرجع مثل كتاب نصي مشهور (سترير ، فويت.) أو مقال لائق (طبيعة ، JBC.) سأستعيد كلماتي بشرف ولكن الحقيقة هي أن جميع المراجع الشهيرة تبكي أن PAGE فازت & # 39t يعطونك أي معلومات مفيدة حول الكتلة الجزيئية وعلى عكس الموقع الإلكتروني الذي يقدمونه مع الأسباب التي أشرت إليها في المنشورات السابقة.

من الصفحات الرئيسية لـ Invitrogen وجدت معلومات عن نظام Invitrogen BN-PAGE:

NativePAGE & # 8482 Novex® Bis-Tris Gel System عبارة عن نظام جل مصغر من البولي أكريلاميد المصبوب مسبقًا يوفر طريقة حساسة وعالية الدقة لتحليل مجمعات بروتين الغشاء الأصلي والبروتينات الأصلية القابلة للذوبان وتقديرات الكتلة الجزيئية وتقييم نقاء بروتينات أصلية. وهو يعتمد على تقنية الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأزرق الأصلي (BN PAGE) التي طورها Schagger و von Jagow (1-3).

ووصف العلامات:
معيار NativeMark & ​​# 8482 Unstained Protein Standard هو علامة بروتين جاهزة للاستخدام للسماح بتقدير دقيق للوزن الجزيئي للبروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام مع Tris-Glycine أو NuPAGE® Novex Tris-Acetate Gels.

لذا من هذا الوصف حصلت على فكرة أنه يمكن الاعتماد عليه لتقدير الوزن الجزيئي. ومقرها في كوماسي وهلام التدرج

ساريتا يا صديقي
ذهبت إلى موقع الويب الخاص بهم وقراءته ولكنني حقًا لا يمكنني قبول اقتباس من موقع ويب كسبب علمي لم يذكروا لماذا وكيف أن PAGE مفيدة في تحديد الكتلة الجزيئية التي قالوها للتو وربما إذا طلبت المزيد من المعلومات الأشخاص داخل تلك الشركة يقولون لك أننا نعني هذا ونعني ذلك.
إذا أحلتني إلى مرجع مثل كتاب نصي مشهور (سترير ، فويت.) أو مقال لائق (طبيعة ، JBC.) سأستعيد كلماتي بشرف ولكن الحقيقة هي أن جميع المراجع الشهيرة تبكي أن PAGE فازت & # 39t يعطونك أي معلومات مفيدة حول الكتلة الجزيئية وعلى عكس الموقع الإلكتروني الذي يقدمونه مع الأسباب التي أشرت إليها في المنشورات السابقة.

يتم توفير المراجع التي تطلبها على صفحة الويب من invitrogen:

تأكد من النقر فوق & اقتباس الكل & quot

من الصفحات الرئيسية لـ Invitrogen وجدت معلومات عن نظام Invitrogen BN-PAGE:

نظام NativePAGE ™ Novex® Bis-Tris Gel عبارة عن نظام جل مصغر من البولي أكريلاميد المصبوب مسبقًا يوفر طريقة حساسة وعالية الدقة لتحليل معقدات بروتين الغشاء الأصلي والبروتينات الأصلية القابلة للذوبان وتقديرات الكتلة الجزيئية وتقييم نقاوة المواد الأصلية. البروتينات. وهو يعتمد على تقنية الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأزرق الأصلي (BN PAGE) التي طورها Schagger و von Jagow (1-3).

ووصف العلامات:
معيار NativeMark ™ للبروتين غير الملوث هو علامة بروتين جاهزة للاستخدام للسماح بتقدير الوزن الجزيئي الدقيق للبروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام مع Tris-Glycine أو NuPAGE® Novex Tris-Acetate Gels.

لذا من هذا الوصف حصلت على فكرة أنه يمكن الاعتماد عليه لتقدير الوزن الجزيئي. ومقرها في كوماسي وهلام التدرج

ساريتا يا صديقي
ذهبت إلى موقع الويب الخاص بهم وقراءته ، لكنني حقًا لا يمكنني قبول اقتباس من موقع ويب كسبب علمي لم يذكروا لماذا وكيف أن PAGE مفيدة في تحديد الكتلة الجزيئية التي قالوها للتو وربما إذا طلبت المزيد من المعلومات الأشخاص داخل تلك الشركة يقولون لك أننا نعني هذا ونعني ذلك.
إذا أحلتني إلى مرجع مثل كتاب نصي مشهور (سترير ، فويت.) أو مقال لائق (طبيعة ، JBC.) سأستعيد كلماتي بشرف ولكن الحقيقة هي أن جميع المراجع الشهيرة تبكي أن PAGE فازت & # 39t يعطونك أي معلومات مفيدة حول الكتلة الجزيئية وعلى عكس الموقع الإلكتروني الذي يقدمونه مع الأسباب التي أشرت إليها في المنشورات السابقة.

يتم توفير المراجع التي تطلبها على صفحة الويب من invitrogen:

تأكد من النقر فوق & اقتباس الكل & quot

مرحبًا ، هل اهتممت بقراءة ملخص لتلك المقالات؟ إنهم يتحدثون عن الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد والجمع بين BN-PAGE و SDS-PAGE & # 33

الملخص
الرحلان الكهربي الأصلي الأزرق هو طريقة & quot؛ تحويل & quot؛ تم تطويرها لعزل معقدات بروتين الغشاء الأصلي من الأغشية البيولوجية التي تفصل أيضًا البروتينات الحمضية والبروتينات الأساسية القابلة للذوبان في الماء عند درجة حموضة ثابتة تبلغ 7.5. بالاشتراك مع البعد الثاني للرحلان الكهربي دوديسيل كبريتات الصوديوم ، فإنه يوفر طريقة تحليلية لتحديد الكتلة الجزيئية والحالة قليلة القسيمات للمجمعات غير المرتبطة ، وتكوين الوحدة الفرعية ، ودرجة النقاء والكشف عن المركبات الفرعية. تم تطبيق الطريقة لتحليل مجمعات السيتوكروم bc / bf. من خلال الجمع بين الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأصلي عديم اللون (CN-PAGE) مع BN-PAGE الأصلي الأزرق ، تم تطوير تقنية أصلية ثنائية الأبعاد مناسبة لإعداد مجمعات بروتين غشائية عالية النقاء.

كما توقعت ، إذا سألت أشخاصًا أكثر استنارة في الشركة ، سيقولون إننا نعني هذا ونعني ذلك ، ونعني ذلك بالاشتراك مع SDS-PAGE & # 33
فازت PAGE بنفسها & # 39t تعطيك أي معلومات حول الكتلة الجزيئية & # 33 تنحتها في عقلك & # 33 حالة مغلقة & # 33

من الصفحات الرئيسية لـ Invitrogen وجدت معلومات عن نظام Invitrogen BN-PAGE:

NativePAGE & # 8482 Novex® Bis-Tris Gel System عبارة عن نظام جل مصغر من البولي أكريلاميد المصبوب مسبقًا يوفر طريقة حساسة وعالية الدقة لتحليل مجمعات بروتين الغشاء الأصلي والبروتينات الأصلية القابلة للذوبان وتقديرات الكتلة الجزيئية وتقييم نقاء بروتينات أصلية. وهو يعتمد على تقنية الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأزرق الأصلي (BN PAGE) التي طورها Schagger و von Jagow (1-3).

ووصف العلامات:
معيار NativeMark & ​​# 8482 Unstained Protein Standard هو علامة بروتين جاهزة للاستخدام للسماح بتقدير دقيق للوزن الجزيئي للبروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام مع Tris-Glycine أو NuPAGE® Novex Tris-Acetate Gels.

لذا من هذا الوصف حصلت على فكرة أنه يمكن الاعتماد عليه لتقدير الوزن الجزيئي. ومقرها في كوماسي وهلام التدرج

ساريتا يا صديقي
ذهبت إلى موقع الويب الخاص بهم وقراءته ، لكنني حقًا لا يمكنني قبول اقتباس من موقع ويب كسبب علمي لم يذكروا لماذا وكيف أن PAGE مفيدة في تحديد الكتلة الجزيئية التي قالوها للتو وربما إذا طلبت المزيد من المعلومات الأشخاص داخل تلك الشركة يقولون لك أننا نعني هذا ونعني ذلك.
إذا أحلتني إلى مرجع مثل كتاب نصي مشهور (سترير ، فويت.) أو مقال لائق (طبيعة ، JBC.) سأستعيد كلماتي بشرف ولكن الحقيقة هي أن جميع المراجع الشهيرة تبكي أن PAGE فازت & # 39t يعطونك أي معلومات مفيدة حول الكتلة الجزيئية وعلى عكس الموقع الإلكتروني الذي يقدمونه مع الأسباب التي أشرت إليها في المشاركات السابقة.

يتم توفير المراجع التي تطلبها على صفحة الويب من invitrogen:

تأكد من النقر فوق & اقتباس الكل & quot

مرحبًا ، هل اهتممت بقراءة ملخص لتلك المقالات؟ إنهم يتحدثون عن الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد والجمع بين BN-PAGE و SDS-PAGE & # 33

الملخص
الرحلان الكهربي الأصلي الأزرق هو طريقة & quot؛ تحويل & quot؛ تم تطويرها لعزل معقدات بروتين الغشاء الأصلي من الأغشية البيولوجية التي تفصل أيضًا البروتينات الحمضية والبروتينات الأساسية القابلة للذوبان في الماء عند درجة حموضة ثابتة تبلغ 7.5. بالاقتران مع البعد الثاني للرحلان الكهربي دوديسيل كبريتات الصوديوم ، فإنه يوفر طريقة تحليلية لتحديد الكتلة الجزيئية وحالة قلة القسيمات للمجمعات غير المنفصلة ، وتكوين الوحدة الفرعية ، ودرجة النقاء والكشف عن المركبات الفرعية. تم تطبيق الطريقة لتحليل مجمعات السيتوكروم bc / bf. من خلال الجمع بين الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الأصلي عديم اللون (CN-PAGE) مع BN-PAGE الأصلي الأزرق ، تم تطوير تقنية أصلية ثنائية الأبعاد مناسبة لإعداد مجمعات بروتين غشائية عالية النقاء.

كما توقعت ، إذا سألت أشخاصًا أكثر استنارة في الشركة ، سيقولون إننا نعني هذا ونعني ذلك ، ونعني ذلك بالاشتراك مع SDS-PAGE & # 33
فازت PAGE بنفسها & # 39t تعطيك أي معلومات حول الكتلة الجزيئية & # 33 تنحتها في عقلك & # 33 حالة مغلقة & # 33

الآن ، إذا قرأت الورقة البحثية (1991) (وبشكل أكثر تحديدًا ، المناقشة) كنت سترى أن المؤلف كان يدعي إجراء تقدير للحجم. كان البعد الثاني هو رؤية الوحدات الفرعية للمجمعات قيد الدراسة.

حتى المواد الهلامية الأصلية يمكن أن تعطي بعض تقدير الحجم (والذي يمكن تحسينه باستخدام التدرج اللوني). ستسمح مصفوفة الهلام والمسامية للبروتينات الأصغر بالمرور أسرع من البروتينات الكبيرة بنفس الشحنة أو ما شابهها.


محتويات

SDS-PAGE هي طريقة رحلان كهربائي تسمح بفصل البروتين بالكتلة. الوسط (يشار إليه أيضًا باسم ′ matrix) عبارة عن هلام متقطع قائم على البولي أكريلاميد. عادة ما يتم وضع بولي أكريلاميد-جل بين لوحين زجاجيين في جل بلاطة. على الرغم من استخدام المواد الهلامية الأنبوبية (في الأسطوانات الزجاجية) تاريخيًا ، إلا أنها سرعان ما أصبحت قديمة مع اختراع الألواح الهلامية الأكثر ملاءمة. [3] بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم). يرتبط حوالي 1.4 جرام من SDS بجرام واحد من البروتين ، [4] [5] [6] يتوافق مع جزيء SDS واحد لكل اثنين من الأحماض الأمينية. يعمل SDS بمثابة خافض للتوتر السطحي ، حيث يخفي الشحنة الذاتية للبروتينات ويمنحها نسب شحنة إلى كتلة متشابهة جدًا. إن الشحنات الجوهرية للبروتينات ضئيلة بالمقارنة مع تحميل SDS ، كما يتم تقليل الشحنات الموجبة بشكل كبير في نطاق الأس الهيدروجيني الأساسي للهلام المنفصل. عند تطبيق مجال كهربائي ثابت ، يهاجر البروتين نحو القطب الموجب ، ولكل منهما سرعة مختلفة ، اعتمادًا على كتلته. يسمح هذا الإجراء البسيط بالفصل الدقيق للبروتين بالكتلة.

يميل SDS إلى تكوين مذيلات كروية في المحاليل المائية فوق تركيز معين يسمى تركيز الميسيلار الحرج (CMC). فوق تركيز micellar الحرج من 7 إلى 10 مللي مولار في المحاليل ، يحدث SDS في وقت واحد كجزيئات مفردة (مونومر) وكمذيلات ، أسفل CMC SDS يحدث فقط كمونومرات في المحاليل المائية. في تركيز micellar الحرج ، تتكون micelle من حوالي 62 جزيء SDS. [7] ومع ذلك ، فإن مونومرات SDS فقط ترتبط بالبروتينات عن طريق التفاعلات الكارهة للماء ، في حين أن مذيلات SDS أنيونية من الخارج ولا تمتص أي بروتين. [4] SDS هو برمائي بطبيعته ، مما يسمح له بفتح كل من الأجزاء القطبية وغير القطبية من بنية البروتين. [8] في تراكيز SDS التي تزيد عن 0.1 ملي مولار ، يبدأ ظهور البروتينات ، [4] وأكثر من 1 ملي مولار ، يتم تغيير طبيعة معظم البروتينات. [4] نظرًا للتأثير القوي على تغيير طبيعة SDS والتفكك اللاحق لمجمعات البروتين ، لا يمكن تحديد الهياكل الرباعية بشكل عام باستخدام SDS. الاستثناءات هي البروتينات التي يتم تثبيتها عن طريق الربط التساهمي ، على سبيل المثال. -S-S- الروابط ومجمعات البروتين المقاومة لـ SDS ، والتي تكون مستقرة حتى في وجود SDS (الأخير ، مع ذلك ، فقط في درجة حرارة الغرفة). يتطلب الأمر طاقة تنشيط عالية لتدمير المجمعات المقاومة لـ SDS ، والتي يتم تحقيقها عن طريق التسخين. تعتمد مقاومة SDS على قابلية استقرار طية البروتين. على الرغم من أن البروتين الأصلي المطوي بالكامل والمقاوم لـ SDS لا يتمتع بثبات كافٍ في وجود SDS ، إلا أن التوازن الكيميائي للتمسخ عند درجة حرارة الغرفة يحدث ببطء. تتميز مجمعات البروتين المستقرة ليس فقط بمقاومة SDS ولكن أيضًا بالاستقرار ضد البروتياز وزيادة عمر النصف البيولوجي. [9]

بدلاً من ذلك ، يمكن أيضًا إجراء التحليل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد باستخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي الموجبة CTAB في صفحة CTAB-PAGE ، [10] [11] [12] أو 16-BAC في BAC-PAGE. [13]

تتكون طريقة SDS-PAGE من تحضير الهلام أو تحضير العينة أو الرحلان الكهربائي أو تلطيخ البروتين أو النشاف الغربي وتحليل نمط النطاقات المتولدة.

تحرير إنتاج الهلام

عند استخدام مخازن مختلفة في الهلام (الرحلان الكهربائي للهلام المتقطع) ، يتم تصنيع المواد الهلامية حتى يوم واحد قبل الرحلان الكهربائي ، بحيث لا يؤدي الانتشار إلى اختلاط المحاليل. يتم إنتاج الجل عن طريق البلمرة الجذرية في قالب يتكون من لوحين زجاجيين مغلقين مع فواصل بين الألواح الزجاجية. في الإعداد النموذجي للهلام المصغر ، يبلغ سمك الفواصل 0.75 مم أو 1.5 مم ، والتي تحدد قدرة التحميل للجيل. لصب محلول الهلام ، عادة ما يتم تثبيت الألواح في حامل يغلق مؤقتًا الجانب السفلي المفتوح من الألواح الزجاجية بالفواصل. بالنسبة لمحلول الهلام ، يتم خلط مادة الأكريلاميد على هيئة جيل مُشكل (عادةً 4٪ V / V في هلام التراص و 10-12٪ في هلام الفصل) ، وميثيلينبيساكريلاميد باعتباره رابطًا متقاطعًا ، أو مرصًا أو منفصلًا عن محلول جل ، وماء و SDS . عن طريق إضافة المحفز TEMED والبادئ الجذري لكبريتات الأمونيوم (APS) ، يتم بدء البلمرة. ثم يُسكب المحلول بين الألواح الزجاجية دون تكوين فقاعات. اعتمادًا على كمية المحفز والبادئ الجذري واعتمادًا على درجة الحرارة ، تستمر البلمرة ما بين ربع ساعة وعدة ساعات. يُسكب الجل السفلي (هلام الفصل) أولاً ويُغطى ببضع قطرات من كحول بالكاد قابل للذوبان في الماء (عادةً ما يكون البيوتانول المشبع أو الأيزوبروبانول) ، مما يزيل الفقاعات من الغضروف المفصلي ويحمي محلول الهلام من الأكسجين الكاسح الجذري. بعد بلمرة هلام الفصل ، يتم التخلص من الكحول وإزالة الكحول المتبقي بورق الترشيح. بعد إضافة APS و TEMED إلى محلول هلام التراص ، يتم سكبه فوق هلام الفصل الصلب. بعد ذلك ، يتم إدخال مشط عينة مناسب بين الألواح الزجاجية دون تكوين فقاعات. يتم سحب مشط العينة بعناية بعد البلمرة ، تاركًا جيوبًا لتطبيق العينة. للاستخدام اللاحق للبروتينات لتسلسل البروتين ، غالبًا ما يتم تحضير المواد الهلامية في اليوم السابق للرحلان الكهربائي لتقليل تفاعلات الأكريلاميد غير المبلمر مع السيستين في البروتينات.

باستخدام خلاط التدرج ، يمكن صب المواد الهلامية المتدرجة مع تدرج من مادة الأكريلاميد (عادة من 4 إلى 12٪) ، والتي لها نطاق فصل أكبر للكتل الجزيئية. [14] أنظمة الهلام التجارية (تسمى المواد الهلامية مسبقة الصب) عادةً ما تستخدم المادة العازلة Bis-tris methane بقيمة pH تتراوح بين 6.4 و 7.2 في كل من هلام التكديس وجل الفصل. [15] [16] يتم تسليم هذه المواد الهلامية مسبوكة وجاهزة للاستخدام. نظرًا لأنها تستخدم عازلًا واحدًا فقط (الرحلان الكهربي المستمر للهلام) ولها درجة حموضة محايدة تقريبًا ، يمكن تخزينها لعدة أسابيع. يؤدي الرقم الهيدروجيني الأكثر حيادية إلى إبطاء التحلل المائي وبالتالي تحلل بولي أكريلاميد. علاوة على ذلك ، هناك عدد أقل من السيستين المعدلة بالأكريلاميد في البروتينات. [15] بسبب ثبات الأس الهيدروجيني في جمع وفصل الهلام لا يوجد تأثير تكديس. لا يمكن تلطيخ البروتينات الموجودة في المواد الهلامية BisTris بمجمعات الروثينيوم. [17] يحتوي نظام الهلام هذا على نطاق فصل كبير نسبيًا ، والذي يمكن أن يتنوع باستخدام MES أو MOPS في المخزن المؤقت الجاري التشغيل. [15]

تعديل إعداد العينة

أثناء تحضير العينة ، يُضاف المخزن المؤقت للعينة ، وبالتالي SDS ، إلى البروتينات ، ثم تُسخن العينة إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، أو بدلاً من ذلك 70 درجة مئوية لمدة عشر دقائق. يؤدي التسخين إلى تعطيل الهياكل الثانوية والثالثية للبروتين عن طريق تعطيل الروابط الهيدروجينية وتمديد الجزيئات. اختياريا ، يمكن شق جسور ثاني كبريتيد عن طريق الاختزال. لهذا الغرض ، يتم إضافة تقليل الثيول مثل β-mercaptoethanol (β-ME ، 5٪ من حيث الحجم) ، أو dithiothreitol (DTT ، 10 مللي مولار) أو ثنائي إريثريتول (DTE ، 10 مللي مولار) إلى المخزن المؤقت للعينة. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، يتم ضخ كل عينة في البئر الخاص بها في الهلام ، والذي كان مغمورًا سابقًا في محلول الرحلان الكهربائي في جهاز الفصل الكهربائي.

بالإضافة إلى العينات ، عادة ما يتم تحميل علامة حجم الوزن الجزيئي على الجل. يتكون هذا من بروتينات ذات أحجام معروفة وبالتالي يسمح بتقدير (مع خطأ ± 10٪) لأحجام البروتينات في العينات الفعلية ، والتي تهاجر بالتوازي في مسارات مختلفة من الهلام. [18] غالبًا ما يتم وضع علامة الحجم في الجيب الأول أو الأخير من الجل.

تحرير الكهربائي

للفصل ، يتم تحميل العينات المشوهة على هلام بولي أكريلاميد ، والذي يتم وضعه في محلول فصل كهربائي مع إلكتروليتات مناسبة. بعد ذلك ، يتم تطبيق جهد (عادة حوالي 100 فولت ، 10-20 فولت لكل سم طول هلام) ، مما يتسبب في هجرة الجزيئات سالبة الشحنة عبر الهلام في اتجاه الأنود الموجب الشحنة. يعمل الجل كمنخل. تهاجر البروتينات الصغيرة بسهولة نسبيًا عبر شبكة الهلام ، بينما من المرجح أن يتم الاحتفاظ بالبروتينات الأكبر وبالتالي تهاجر بشكل أبطأ عبر الهلام ، مما يسمح بفصل البروتينات عن طريق الحجم الجزيئي. يستمر الرحلان الكهربائي ما بين نصف ساعة إلى عدة ساعات حسب الجهد وطول الهلام المستخدم.

تشكل البروتينات الأسرع ترحيلًا (التي يقل وزنها الجزيئي أقل من 5 كيلو دالتون) الواجهة العازلة جنبًا إلى جنب مع المكونات الأنيونية للعازل الكهربائي ، والتي تنتقل أيضًا عبر الهلام. تكون مساحة واجهة المخزن المؤقت مرئية عن طريق إضافة صبغة أنيونية صغيرة نسبيًا بروموفينول الأزرق إلى المخزن المؤقت للعينة. نظرًا لصغر حجم جزيء البروموفينول الأزرق نسبيًا ، فإنه يهاجر أسرع من البروتينات. من خلال التحكم البصري في النطاق الملون المهاجر ، يمكن إيقاف الرحلان الكهربائي قبل الصبغة وأيضًا هاجرت العينات تمامًا عبر الهلام وتركه.

الطريقة الأكثر شيوعًا هي SDS-PAGE المتقطع. In this method, the proteins migrate first into a collecting gel with neutral pH, in which they are concentrated and then they migrate into a separating gel with basic pH, in which the actual separation takes place. Stacking and separating gels differ by different pore size (4-6 % T and 10-20 % T), ionic strength and pH values (pH 6.8 or pH 8.8). The electrolyte most frequently used is an SDS-containing Tris-glycine-chloride buffer system. At neutral pH, glycine predominantly forms the zwitterionic form, at high pH the glycines lose positive charges and become predominantly anionic. In the collection gel, the smaller, negatively charged chloride ions migrate in front of the proteins (as leading ions) and the slightly larger, negatively and partially positively charged glycinate ions migrate behind the proteins (as initial trailing ions), whereas in the comparatively basic separating gel both ions migrate in front of the proteins. The pH gradient between the stacking and separation gel buffers leads to a stacking effect at the border of the stacking gel to the separation gel, since the glycinate partially loses its slowing positive charges as the pH increases and then, as the former trailing ion, overtakes the proteins and becomes a leading ion, which causes the bands of the different proteins (visible after a staining) to become narrower and sharper - the stacking effect. For the separation of smaller proteins and peptides, the TRIS-Tricine buffer system of Schägger and von Jagow is used due to the higher spread of the proteins in the range of 0.5 to 50 kDa. [19]

Gel staining Edit

At the end of the electrophoretic separation, all proteins are sorted by size and can then be analyzed by other methods, e. ز. protein staining such as Coomassie staining (most common and easy to use), [20] [21] silver staining (highest sensitivity), [22] [23] [24] [25] [26] [27] stains all staining, Amido black 10B staining, [21] Fast green FCF staining, [21] fluorescent stains such as epicocconone stain [28] and SYPRO orange stain, [29] and immunological detection such as the Western Blot. [30] [31] The fluorescent dyes have a comparatively higher linearity between protein quantity and color intensity of about three orders of magnitude above the detection limit, i. ه. the amount of protein can be estimated by color intensity. When using the fluorescent protein dye trichloroethanol, a subsequent protein staining is omitted if it was added to the gel solution and the gel was irradiated with UV light after electrophoresis. [32] [33]

In Coomassie Staining, Gel is Fixed in a 50% ethanol 10% glacial acetic acid solution for 1 hr. Then the solution is changed for fresh one and after 1 to 12 hrs Gel is changed to a Staining solution (50% methanol, 10% Glacial acetic Acid, 0.1% Coomassie Brilliant Blue) followed by destaining changing several times a destaining solution of 40% methanol, 10% glacial acetic acid.

Analysis Edit

Protein staining in the gel creates a documentable banding pattern of the various proteins. Glycoproteins have differential levels of glycosylations and adsorb SDS more unevenly at the glycosylations, resulting in broader and blurred bands. [34] Membrane proteins, because of their transmembrane domain, are often composed of the more hydrophobic amino acids, have lower solubility in aqueous solutions, tend to bind lipids, and tend to precipitate in aqueous solutions due to hydrophobic effects when sufficient amounts of detergent are not present. This precipitation manifests itself for membrane proteins in a SDS-PAGE in "tailing" above the band of the transmembrane protein. In this case, more SDS can be used (by using more or more concentrated sample buffer) and the amount of protein in the sample application can be reduced. An overloading of the gel with a soluble protein creates a semicircular band of this protein (e. g. in the marker lane of the image at 66 kDa), allowing other proteins with similar molecular weights to be covered. A low contrast (as in the marker lane of the image) between bands within a lane indicates either the presence of many proteins (low purity) or, if using purified proteins and a low contrast occurs only below one band, it indicates a proteolytic degradation of the protein, which first causes degradation bands, and after further degradation produces a homogeneous color ("smear") below a band. [35] The documentation of the banding pattern is usually done by photographing or scanning. For a subsequent recovery of the molecules in individual bands, a gel extraction can be performed.

Archiving Edit

After protein staining and documentation of the banding pattern, the polyacrylamide gel can be dried for archival storage. Proteins can be extracted from it at a later date. The gel is either placed in a drying frame (with or without the use of heat) or in a vacuum dryer. The drying frame consists of two parts, one of which serves as a base for a wet cellophane film to which the gel and a one percent glycerol solution are added. Then a second wet cellophane film is applied bubble-free, the second frame part is put on top and the frame is sealed with clips. The removal of the air bubbles avoids a fragmentation of the gel during drying. The water evaporates through the cellophane film. In contrast to the drying frame, a vacuum dryer generates a vacuum and heats the gel to about 50 °C.

For a more accurate determination of the molecular weight, the relative migration distances of the individual protein bands are measured in the separating gel. [36] [37] The measurements are usually performed in triplicate for increased accuracy. The relative mobility (called Rf value or Rm value) is the quotient of the distance of the band of the protein and the distance of the buffer front. The distances of the bands and the buffer front are each measured from the beginning of the separation gel. The distance of the buffer front roughly corresponds to the distance of the bromophenol blue contained in the sample buffer. The relative distances of the proteins of the size marker are plotted semi-logarithmically against their known molecular weights. By comparison with the linear part of the generated graph or by a regression analysis, the molecular weight of an unknown protein can be determined by its relative mobility. Bands of proteins with glycosylations can be blurred. [34] Proteins with many basic amino acids (e. g. histones) [38] can lead to an overestimation of the molecular weight or even not migrate into the gel at all, because they move slower in the electrophoresis due to the positive charges or even to the opposite direction. Accordingly, many acidic amino acids can lead to accelerated migration of a protein and an underestimation of its molecular mass. [39]

The SDS-PAGE in combination with a protein stain is widely used in biochemistry for the quick and exact separation and subsequent analysis of proteins. It has comparatively low instrument and reagent costs and is an easy-to-use method. Because of its low scalability, it is mostly used for analytical purposes and less for preparative purposes, especially when larger amounts of a protein are to be isolated.

Additionally, SDS-PAGE is used in combination with the western blot for the determination of the presence of a specific protein in a mixture of proteins - or for the analysis of post-translational modifications. Post-translational modifications of proteins can lead to a different relative mobility (i.e. a band shift) or to a change in the binding of a detection antibody used in the western blot (i.e. a band disappears or appears).

In mass spectrometry of proteins, SDS-PAGE is a widely used method for sample preparation prior to spectrometry, mostly using in-gel digestion. In regards to determining the molecular mass of a protein, the SDS-PAGE is a bit more exact than an analytical ultracentrifugation, but less exact than a mass spectrometry or - ignoring post-translational modifications - a calculation of the protein molecular mass from the DNA sequence.

In medical diagnostics, SDS-PAGE is used as part of the HIV test and to evaluate proteinuria. In the HIV test, HIV proteins are separated by SDS-PAGE and subsequently detected by Western Blot with HIV-specific antibodies of the patient, if they are present in his blood serum. SDS-PAGE for proteinuria evaluates the levels of various serum proteins in the urine, e.g. Albumin, Alpha-2-macroglobulin and IgG.

SDS-PAGE is the most widely used method for gel electrophoretic separation of proteins. Two-dimensional gel electrophoresis sequentially combines isoelectric focusing or BAC-PAGE with a SDS-PAGE. Native PAGE is used if native protein folding is to be maintained. For separation of membrane proteins, BAC-PAGE or CTAB-PAGE may be used as an alternative to SDS-PAGE. For electrophoretic separation of larger protein complexes, agarose gel electrophoresis can be used, e.g. the SDD-AGE. Some enzymes can be detected via their enzyme activity by zymography.

While being one of the more precise and low-cost protein separation and analysis methods, the SDS-PAGE denatures proteins. Where non-denaturing conditions are necessary, proteins are separated by a native PAGE or different chromatographic methods with subsequent photometric quantification, for example affinity chromatography (or even tandem affinity purification), size exclusion chromatography, ion exchange chromatography. [40] Proteins can also be separated by size in a tangential flow filtration [41] or an ultrafiltration. [42] Single proteins can be isolated from a mixture by affinity chromatography or by a pull-down assay. Some historically early and cost effective but crude separation methods usually based upon a series of extractions and precipitations using kosmotropic molecules, for example the ammonium sulfate precipitation and the polyethyleneglycol precipitation.

In 1948, Arne Tiselius was awarded the Nobel Prize in Chemistry for the discovery of the principle of electrophoresis as the migration of charged and dissolved atoms or molecules in an electric field. [43] The use of a solid matrix (initially paper discs) in a zone electrophoresis improved the separation. The discontinuous electrophoresis of 1964 by L. Ornstein and B. J. Davis made it possible to improve the separation by the stacking effect. [44] The use of cross-linked polyacrylamide hydrogels, in contrast to the previously used paper discs or starch gels, provided a higher stability of the gel and no microbial decomposition. The denaturing effect of SDS in continuous polyacrylamide gels and the consequent improvement in resolution was first described in 1965 by David F. Summers in the working group of James E. Darnell to separate poliovirus proteins. [45] The current variant of the SDS-PAGE was described in 1970 by Ulrich K. Laemmli and initially used to characterise the proteins in the head of bacteriophage T4. [1] This Laemmli paper is widely cited for the invention of modern SDS-PAGE, but the technique was actually invented by Jake Maizel, who was doing a sabbatical in the MRC laboratory when Laemmli joined the lab as a postdoctoral fellow. Maizel shared his prior technology with Laemmli and together they made further improvements. Laemmli and Maizel had planned to follow up with a Methods paper but this never materialized. Maizel recounts the history of development of SDS-PAGE in brief commentary. [46]


الملخص

When monoclonal antibodies (mAbs) are analysed by non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), method-induced artifacts are a frequent phenomenon. Previous studies suggested that incomplete denaturation and disulfide-bond scrambling are two main causes of artifact bands. Thus, in practice samples are normally heated and treated with alkylating agent iodoacetamide (IAM) before loading to promote denaturation and block free sulfhydryl groups, respectively. In this work, we further studied the major cause of artifact bands on non-reducing SDS-PAGE and ways of eliminating artifacts with two purified mAbs. In both cases, it was found that artifact bands on non-gradient Tris-glycine gels are mainly caused by incomplete denaturation under typical gel conditions. In general, heating minimizes artifact bands due to incomplete denaturation but it also generates some extra bands. Combining heating with IAM treatment achieved slightly better results than heating alone. As an alternative to heating, treating the samples with 8 M urea also allows close to complete denaturation of samples and thus minimizes artifact bands. In addition, we learned that untreated samples (samples that are not heated or treated with urea) may look different on Bis-Tris gel depending on gel composition (non-gradient vs. gradient) and the buffer used (MES vs. MOPS). In certain case, the apparent lack of artifact bands on gradient Bis-Tris gel may be in fact due to insufficient resolution. In conclusion, this study further confirmed that full-denaturation of sample is critical for minimizing/avoiding artifact bands on non-reducing SDS-PAGE.


Molecular mass versus molecular weight

Molecular mass (symbol m) is expressed in Daltons (Da). One Dalton is defined as 1/12 the mass of carbon 12. Most macromolecules are large enough to use the kiloDalton (kDa) to describe molecular mass. Molecular weight is not the same as molecular mass. It is also known as relative molecular mass (symbol Mr, where r is a subscript). Molecular weight is defined as the ratio of the mass of a macromolecule to 1/12 the mass of a carbon 12 atom. It is a dimensionless quantity.

When the literature gives a mass in Da or kDa it refers to molecular mass. It is incorrect to express molecular weight (relative molecular mass) in Daltons. Nevertheless you will find the term molecular weight used with Daltons or kiloDaltons in some literature, often using the abbreviation MW for molecular weight.


Antibody-purity analysis is critical to successful development of monoclonal antibody (MAb) biopharmaceuticals. Their manufacture involves processes of protein purification, formulation, and stability evaluation. All those processes need highly accurate and reproducible analytical results to support decisions made by product developers and manufacturers.

A common technology for antibody-purity analysis is sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this technique, a polypeptide chain binds SDS proportionally to its relative molecular mass. The detergent nature of SDS denatures proteins by disrupting their noncovalent bonds, thereby simplifying the molecular structure. Negatively charged SDS also acts to coat proteins consistently, allowing for electrically driven separation toward an anode (a positively charged electrode). With an SDS–protein constant-weight binding ratio of 1:1.4, intrinsic polypeptide charge becomes negligible. So the final separation of such proteins depends entirely on differences in the relative molecular mass of their denatured polypeptides.

PRODUCT FOCUS: MONOCLONAL ANTIBODIES

PROCESS FOCUS: MANUFACTURING

WHO SHOULD READ: ANALYTICAL, PRODUCT DEVELOPMENT

KEYWORDS: ELECTROPHORESIS, IGGS, DETERGENTS, GLYCOSYLATION

Because of its automated, quantitative nature, capillary electrophoresis (CE) technology is commonly used for antibody-purity analysis as well. In this technique, an antibody sample is mixed with a replaceable SDS-gel buffer and then electrophoresed through an SDS-gel filled capillary. To accomplish that, samples are injected into the capillary inlets capillary using high voltage. Protein migration through the separation matrix occurs in an anodic direction, and quantitative detection occurs near the distal end of the capillary using a UV absorbance detection system.

It is well known that CE provides high-resolution, quantitative analysis relative to SDS-PAGE. However, direct comparison of the two technologies is difficult unless standardized samples are used. Here we describe our direct comparison of CE and SDS-PAGE based on evaluating the same sample in both a normal and a heat-stressed state by both methods.

Experimental

SDS- الصفحة: We used an Invitrogen NuPAGE Mini-Gel electrophoresis system (Life Technologies) with 4–12% Bis-Tris gel and GelCode Blue stain to analyze a human IgG antibody sample and the same sample again after heat stress for 14 days at 45 °C. Samples were diluted to 0.2 mg/mL with water and further diluted to 0.15 mg/mL with 4× Invitrogen NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies). We conducted gel preparation, sample loading, and analysis all according to the gel-manufacturer&aposs suggested procedure (included in the box). Using Alpha View integration software (ProteinSimple), we imaged the resulting gel to quantify percent area for each band and assess molecular weight.

CE-SDS: We used a PA 800 plus capillary electrophoresis system (Beckman Coulter) to analyze the same samples as above, performing sample preparation and system operation as suggested by the system manuals. Antibody samples were diluted to 1.0 mg/mL with SDS sample buffer, and nonreduced samples were heated at 70 °C for three minutes before injection into a bare, fused-silica capillary at 5 kV for 20 seconds. The machine separated proteins in an electric field of 500 V/cm for 35 minutes. No gel staining or destaining was necessary, and UV detection at 220 nm recorded the amount of protein passing through the capillary window. Beckman Coulter 32 Karat software determined sample quantitations and migration times.

نتائج ومناقشة

Figure 1 compares the SDS-PAGE and CE-SDS analyses. In the gel image, lanes 1 and 12 are molecular-weight markers, lanes 2–6 are normal IgG samples, and lanes 7–11 are heat-stressed IgG samples. Normal IgG samples show a single major band at 150 kDa and a minor band at 130 kDa. Heat-stressed IgG samples show a major band at 150 kDa and four minor bands at 300, 130, 90, and 25 kDa. By comparison, CE-SDS results for both IgG and degraded IgG easily show high-resolution separation allowing for easy quantitation of degradation species attributable to a high signal-to-noise ratio.

Using an IgG standard, the PA 800 plus 32 Karat software can make peak assignments for CE-SDS electropherograms (Figure 2). As shown in the bottom electropherogram, the major impurities of normal IgG are a single light chain (LC) and a combination of two heavy chains and one light chain (2H 1L). As shown in the top electropherogram, the major impurities of degraded IgG are LC, two heavy chains (2H), 2H 1L, and nonglycosylated IgG.

Figure 3 shows band assignments based on molecular-weight markers for the SDS-PAGE separation compared with CE results. These data illustrate that signal-to-noise ratios for impurities seen from heat-stressed IgG are much lower in the scan from the gel than corresponding peaks in the CE-SDS electropherogram. It was difficult to perform autointegration for the SDS-PAGE impurity bands using the Alpha View software.

Figure 3 indicates that the CE-SDS also can detect nonglycosylated IgG easily, whereas SDS-PAGE cannot detect that species. This is a significant advantage of CE-SDS because glycosylated and nonglycosylated IgG often are functionally different, so these species must be separated from one another for accurate analysis. Other automated separations techniques — including chromatography methods — often are unable to effect such separations.

Assay reproducibility is a key attribute of analytical separations for quality control (QC) purposes, which are necessary for both interlab and intralab comparability documentation. Figure 4 shows reproducibility among four consecutive analyses of degraded IgG, which illustrates good overall reproducibility across the various fragments for the CE method.

A Superior Technology for IgGs

We found CE-SDS technology to be a much higher-resolving analytical separation option than SDS-PAGE for separation of a normal and heat-stressed IgG samples in purity determinations. We observed a significant difference in peak resolution and signal-to-noise ratio between the two methods. CE-SDS could detect nonglycosylated IgG, which was not resolved by SDS-PAGE. Because glycosylation is very important to IgG function, that separation capability of CE-SDS is significant enough to qualify the technique as a replacement for SDS-PAGE in this application, given the difficulty of quantitating nonglycosylated IgG by other methods.


Mass spectrometry of in-gel digests reveals differences in amino acid sequences of high-molecular-weight glutenin subunits in spelt and emmer compared to common wheat

High-molecular-weight glutenin subunits (HMW-GS) play an important role for the baking quality of wheat. The ancient wheats emmer and spelt differ in their HMW-GS pattern compared to modern common wheat and this might be one reason for their comparatively poor baking quality. The aim of this study was to elucidate similarities and differences in the amino acid sequences of two 1Bx HMW-GS of common wheat, spelt and emmer. First, the sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) system was optimized to separate common wheat, spelt and emmer Bx6 and Bx7 from other HMW-GS (e.g., 1Ax and 1By) in high concentrations. The in-gel digests of the Bx6 and Bx7 bands were analyzed by untargeted LC-MS/MS experiments revealing different UniProtKB accessions in spelt and emmer compared to common wheat. The HMW-GS Bx6 and Bx7, respectively, of emmer and spelt showed differences in the amino acid sequences compared to those of common wheat. The identities of the peptide variations were confirmed by targeted LC-MS/MS. These peptides can be used to differentiate between Bx6 and Bx7 of spelt and emmer and Bx6 and Bx7 of common wheat. The findings should help to increase the reliability and curation status of wheat protein databases and to understand the effects of protein structure on the functional properties.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


شاهد الفيديو: SDS-PAGE theory u0026 practice: into the buffer and behind the scenes! (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Parisch

    الآن أصبح كل شيء واضحًا ، شكرًا جزيلاً للمساعدة في هذا السؤال.

  2. Fyfe

    إنها ليست نكتة!

  3. Amitabha

    هذه الإجابة لا مثيل لها

  4. Vicq

    شخص ما لم يكن قادرا على القيام بذلك))))

  5. Caedon

    يتفق معك تمامًا. إنها الفكرة الجيدة. احتفظ به.



اكتب رسالة