معلومة

نسب الامتصاص 260/280 و 260/230 للحمض النووي الريبي

نسب الامتصاص 260/280 و 260/230 للحمض النووي الريبي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد استخرجت الحمض النووي الريبي من خطوط خلوية مختلفة ، وأريد إجراء النسخ العكسي ثم PCR. للحصول على نتائج جيدة ، في أي مدى يجب أن تكون نسب الامتصاص 260/280 نانومتر و 260/230 نانومتر؟ وما هي الفكرة من قياس تلك النسب؟

حصلت على قيم لنسبة 260/280 من 2.1 إلى 2.13 وقيم لنسبة 260/230 من 0.98 إلى 2.01. هل هذه القيم مقبولة ، وما هي المعلومات التي يمكنني الحصول عليها منها؟


يمتص DNA و RNA عند 260 نانومتر. تمتص البروتينات عند 280 نانومتر. تعد النسبة 260/280 تقديرًا جيدًا لمدى نقاء عينتك. بالنسبة للحمض النووي الريبي ، يجب أن يكون 260/280 حوالي 2. إذا كان أقل ، فقد يكون هذا مؤشرًا على التلوث أو البروتينات أو الفينول أو الملوثات الأخرى في عينتك. تعد نسبة 260/230 مقياسًا ثانيًا لنقاء العينة ، حيث تمتص الملوثات عند 230 نانومتر (مثل EDTA). يجب أن تكون النسبة 260/230 أعلى من نسبة 260/280 ، حيث تكون عادة بين 2 و 2.2. قد تكون النسبة المنخفضة مؤشرا على التلوث.

في حالتك ، سأكون قلقًا بشأن نقاء العينة التي أعطتك نسبة 260/230 تبلغ 0.98. إذا كنت تستخدم nanodrop ، فإن النظر إلى قطعة الأرض يمكن أن يكون أيضًا مؤشرًا جيدًا على جودة عينتك. بالنسبة لعينة نقية ، من المتوقع ذروة محددة جيدًا (بدون أكتاف أو اهتزازات) عند 260 نانومتر.

ألق نظرة على دليل NanoDrop لمزيد من المعلومات.


نسب الامتصاص 260/280 و 260/230 للحمض النووي الريبي - علم الأحياء

استخراج الحمض النووي عالي الجودة من جوسيبيوم تشتهر الأنواع (القطن) بصعوبة بسبب احتوائها على نسبة عالية من السكريات والكينون والبوليفينول المستقلبات الثانوية الأخرى. هنا ، نصف إجراءً بسيطًا وسريعًا ومُعدَّلًا لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة من القطن ، وهو إجراء قابل للتحليلات النهائية. على عكس طرق CTAB الأخرى ، يكون الإجراء الموصوف سريعًا ، ويتجاهل استخدام النيتروجين السائل ، والفينول ، وتنبيذ فائق التدرج CsCl ، ويستخدم كواشف غير مكلفة وأقل خطورة ، ولا يتطلب سوى معدات معملية عادية. استخدم الإجراء التركيز العالي من كلوريد الصوديوم واستخدام PVP-10 للتخلص من المشاكل المرتبطة بالسكريات والبوليفينول ، على التوالي. كان متوسط ​​المحصول حوالي 10-15 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الجودة من 100 مجم من وزن الأنسجة ، وهو ما يكفي لمشاريع ، مثل رسم الخرائط الجينية أو تربية النباتات بمساعدة الواسمات. يمكن إجراء هذا البروتوكول في أقل من 3 ساعات ويمكن تكييفه لعزل الحمض النووي عالي الإنتاجية.

تم إعادة تصميم المخازن المؤقتة A و B من Paterson et al. (1993) و Porebski et al. (1997) ، على التوالي.

تمت إضافة ريبونوكلياز أ قبل استخلاص الكلوروفورم.

يتم وصف طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة لاستخراج الحمض النووي.


خلفية

البكتيريا الزرقاء هي بدائيات النوى سالبة الجرام التي تصنع الكلوروفيل أ وإجراء أكسدة الماء الضوئي [1]. نظرًا لأن لديهم متطلبات غذائية بسيطة ، لا يحتاجون إلا إلى الهواء والماء والأملاح المعدنية ، مع الضوء كمصدر وحيد للطاقة [2] ، فإن تطبيقها الصناعي المحتمل مهم - من على سبيل المثال إنتاج الهيدروجين [3 ، 4] لمختلف أغراض التكنولوجيا الحيوية [5].

من أجل تطوير إمكانات التكنولوجيا الحيوية هذه ، من المهم أن نفهم تمامًا الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء والبكتيريا الزرقاء. كجزء من هذه العملية ، يعد الحصول على بيانات موثوقة للتعبير الجيني أمرًا حيويًا. يتم استخدام العديد من الطرق ، من النشاف الشمالي إلى المصفوفات الدقيقة ، بشكل روتيني للحصول على مثل هذه البيانات. تعتمد صحة واستنساخ البيانات التي تم الحصول عليها على جودة الحمض النووي الريبي المستخرج ودرجة تلوث الحمض النووي الجيني. ومع ذلك ، فإن البكتيريا الزرقاء تمثل تحديات خاصة عندما يتعلق الأمر بعزل الحمض النووي - تمتلك هذه الكائنات مجموعة ممتدة من المستقلبات الثانوية [6] التي تضعف على سبيل المثال تحلل الخلايا وتنقية الحمض النووي [7].

من أجل تقييم جودة تحضيرات الحمض النووي الريبي ، يتم اتباع استراتيجيتين بشكل شائع: التحليل الطيفي والتحقق من سلامة الريبوسوم عن طريق الرحلان الكهربائي.

من التحليل الطيفي ، يتم أخذ ثلاث قيم للامتصاص في الاعتبار - 230 و 260 و 280 نانومتر. يتم استخدام النسبة بين الامتصاصية عند 260 نانومتر و 280 نانومتر لتقييم نقاء الحمض النووي - بالنسبة للحمض النووي الريبي "النقي" ، من المتوقع أن تكون النسبة حوالي 2.0. قد تشير النسبة المنخفضة إلى وجود البروتينات والببتيدات التي تمتص حوالي 280 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع أن تكون النسبة بين الامتصاصية عند 260 نانومتر و 230 نانومتر 2.2 لعينات الحمض النووي "النقي". قد تكون النسبة المنخفضة نتيجة للتلوث بالببتيدات أو الفينولات أو المركبات العطرية أو الكربوهيدرات.

عادة ما يتم تصور سلامة الوحدات الفرعية للحمض النووي الريبوزي (23S ، 16S و 5S بدائيات النوى) ، ووجود / عدم وجود منتجات تدهور الحمض النووي الريبي منخفضة الوزن ووجود / عدم تلوث الحمض النووي الجيني باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام الاغاروز. من الناحية المثالية ، ينبغي ملاحظة جميع الوحدات الفرعية للحمض النووي الريبوزي المتوقع ، مع عدم وجود علامات على منتجات تحلل الحمض النووي الريبي أو وجود الحمض النووي الجيني.

يُعد استخراج غوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم [8 ، 9] ، المتاح تجاريًا على هيئة TRIzol (من Invitrogen) أو TRI Reagent (من مركز الأبحاث الجزيئية) ، طريقة شائعة الاستخدام لاستخراج الحمض النووي الريبي السيانوبكتيري. هذه الطريقة ، من هذه النقطة المشار إليها باسم Trizol ، ترتبط عادةً بضرب الخرزة من أجل التمزق الجسدي للخلايا. في العمل الحالي ، نقدم كاشف PGTX ، وهو بديل منخفض التكلفة لـ Trizol ، وتقييم استخدامه أثناء استكشاف متغيرات بروتوكول الاستخراج المختلفة.


سلامة العينة

يجب تقديم صورة هلامية مع جميع عينات الحمض النووي. يجب أن يحتوي الجل على سلم حجم ، والذي يجب أن يحتوي على علامة علوية أكبر من أو تساوي 40 كيلو بايت (على سبيل المثال NEB 1 كيلو بايت سلم DNA ممتد أو سلم تمديد DNA Invitrogen 1 كيلو بايت). يجب تشغيل الهلام ببطء وطويل بما يكفي بحيث يكون من الممكن تحديد ما إذا كان هناك أي DNA مقطوع في العينة. يعد وجود الحمض النووي المنفصمة مؤشرًا على أنه حتى الحمض النووي HMW في العينة يحتوي على الكثير من الضرر الذي لن يتم تصحيحه عن طريق إصلاح النك الأنزيمي.


نسب الامتصاص 260/280 و 260/230 للحمض النووي الريبي - علم الأحياء

في مهمة لجعل الكيمياء الحيوية ممتعة ومتاحة للجميع

هل تستمع إلى قمم جهاز الطيف عندما يحاولون التحدث؟ أم أنك تنظر فقط إلى الأعلى وتفترض أن مهمة التطهير قد اكتملت؟ قد تخبرك ذروة الذروة هذه بالتركيز - ولكن بقية الطيف يمكن أن تخبرك عن التلوث! وقد يتسبب هذا التلوث في حدوث تضخم يؤدي إلى المبالغة في تقدير تركيز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي / البروتين! هل انت في هذا الموقف؟ كيف علمت بذلك؟ انظر إلى النسبة 260/230 و 260/280 أمبير!

يمكن استخدام مقياس الطيف الضوئي & ldquolight حتى عمر الجزيئات التي تمنحنا الحياة & ndash نأمل للعالم & rsquos بهجة! غالبًا ما نستخدم التحليل الطيفي (مثل مقياس الطيف الضوئي NanoDrop) لقياس تركيزات الجزيئات مثل الأحماض النووية (DNA أو RNA) أو البروتينات و ndash عن طريق تسليط الضوء من خلال المحاليل المحتوية عليها ومعرفة مقدار الضوء المسروق على طول الطريق ، يمكننا احسب كم كان المحلول ممتلئًا بهذه الجزيئات.

هذا ممكن لأن الجزيئات المختلفة لها ميول مختلفة لامتصاص أطوال موجية مختلفة من الضوء إلى نطاقات مختلفة (أكثر في ثانية). إذا قمت بتألق جزيء و rsquos & ldquofavorite & rdquo الطول الموجي عنده ، فكلما زاد عدد الجزيئات الموجودة ، زادت سرقتها. يمكنك فقط قياس الامتصاصية لهذا الطول الموجي المفضل ، وإذا كان لديك عينة نقية وتعرف كم يحب الجزيء هذا الطول الموجي (معامل الانقراض) ، يمكنك حساب التركيز (باستخدام قانون يسمى قانون Beer & rsquos الذي نصل إليه) فقط باستخدام ذلك الطول الموجي للضوء.

ولكن هل عينتك نقية حقًا؟ إذا كانت الجزيئات الأخرى مثل هذا الطول الموجي أيضًا يمكن أن تضخم بشكل مصطنع تركيزك - ناهيك عن المشاكل الأخرى مع وجود جزيئات ملوثة حولها يمكن أن تتداخل مع الأشياء.

لذا (إن أمكن) يجب عليك أن تنظر فقط إلى قيمة امتصاص طول موجي واحد & ndash بدلاً من ذلك ، يمكنك معرفة المزيد إذا قمت بالقياس على كامل الأشعة فوق البنفسجية (UV) وأجزاء الضوء المرئي من طيف الإشعاع الكهرومغناطيسي (EMR). سيظهر كل طول موجي يتم امتصاصه كقمة كمقياس طيف امتصاص ، والذي يوضح مقدار الضوء في نطاق من الأطوال الموجية التي تم منعها من الوصول طوال الطريق عبر العينة إلى الكاشف على الجانب الآخر.

إن ارتفاع الذروة التي تركز عليها عادةً لجزيء معين هو المكان الذي يمتص فيه بشكل أفضل - & gt يتوافق هذا مع كمية الأشياء الموجودة (التركيز) (مع الأخذ في الاعتبار أن الجزيء واستعداد rsquos لامتصاص هذا الطول الموجي (معامل الانقراض). يمكن الحصول على الكثير من المعلومات حول النقاء من خلال النظر إلى المكان الذي * يجب أن & rsquot * تمتص الكثير من الضوء & ndash والنسب بين القمم يمكن أن تخبرك عن مدى نقاء هذه الأشياء

لإلقاء الضوء على سبب ذلك ، يتعين علينا أولاً التأكد من أننا & rsquore واضحين بشأن ما هو & ldquolight & rdquo & ndash لذا نظرة عامة سريعة & hellip

يمكن التفكير في الضوء (الإشعاع الكهرومغناطيسي) (EMR) على أنه حزم صغيرة من الطاقة تسمى الفوتونات التي تنتقل في موجات. الألوان المختلفة لها أطوال موجية مختلفة من الضوء مع طاقات الفوتون المختلفة (هذا صحيح أيضًا للألوان & ldquoinvisible & rdquo & ndash wavel أطوال خارج الطيف المرئي & ndash مثل موجات الراديو ، وهي ذات تردد منخفض وموجات فوق بنفسجية (UV) ذات تردد أعلى. يشير التردد إلى الكيفية غالبًا ما تأتي قمم الأمواج وترتبط مباشرة بالطاقة و ndash المزيد من الطاقة ، وتكرار أعلى ، وبما أن جميع EMR تنتقل بنفس السرعة الخطية ، يجب أن تقترب تلك القمم من بعضها البعض بحيث لا تتفوق القمم النشطة على المتخلفين. (لا تربك rsquot هذه القمم مع قمم الطيف).

كما وعدت أن أخبركم بالمزيد عن ذلك ، تمتص الجزيئات المختلفة أطوال موجية مختلفة من الضوء إلى نطاقات مختلفة ، ويمكن قياس ذلك من خلال رقم يسمى معامل الانقراض ، والذي يخبرك بمدى جودة امتصاص الجزيء للضوء ذي الطول الموجي المعين. المزيد عن * لماذا * هنا: http://bit.ly/2CfaXbJ

لكن الجزيئات تتكون أساسًا من الذرات (هذه هي الذرات الفردية و ldquoC & rdquos & amp & ldquoH & rdquos & amp & ldquoO & rdquos في الهياكل الكيميائية) وتتكون الذرات من نواة مركزية كثيفة حيث تتدلى البروتونات الموجبة الشحنة والنيوترونات المحايدة. والإلكترونات سالبة الشحنة تدور حولها في & ldquo سحابة إلكترونية. & rdquo تسود هذه الإلكترونات الشحنة المعاكسة للبروتونات في النواة. أحب أن أفكر في النواة على أنها مثل كلب مشاة يمشي بين مجموعة من الكلاب الإلكترونية النشطة. ولكن من الصعب أن تشعر بهذه الشحنة عندما تبتعد عن ذلك ، & ldquonot الشعور بالحب & rdquo كثيرًا ، فإن الإلكترونات الخارجية هي الأقل ولاءًا والأكثر نشاطًا (لا يتعين عليهم & rsquot & ldquowaste & rdquo بقدر الطاقة التي تقاوم هذا السحب). لذلك من المرجح أن يتفاعلوا مع الجزيئات الأخرى. نحن نطلق على هذه الإلكترونات النشطة والأبعد من الإلكترونات و rdquo و rdquo و rdquo و rdquo و rsquore تلك التي نهتم بها أكثر من معظم الوقت. هم & rsquore تلك التي يمكن أن تفعل أشياء مثل دمج المنازل مع الإلكترونات من ذرات أخرى لمنحك روابط تساهمية قوية أو & ndash كما هو مهم لهذه الحالة & ndash يمكنهم امتصاص الفوتونات.

* يمكنهم * ولكن هذا لا يعني أنهم * سوف * & ndash ما إذا كان الجزيء يمتص طولًا موجيًا معينًا من الضوء أم لا يتعلق بكمية الطاقة التي تمتلكها إلكترونات التكافؤ حاليًا ومقدار الطاقة التي يحتاجون إليها & ldquoget إلى المستوى التالي & rdquo & ndash لقد تحدثت عن وجود سحابة إلكترونية ، ولكن هذه السحابة تشبه منطقة سكنية و - هناك أماكن تحب الإلكترونات أن تتسكع فيها أكثر ، لذلك ، على الرغم من أنها & rsquore تتنقل باستمرار ، فلديك أكبر فرصة للعثور عليها في & ldquoelectron Houses & rdquo بشكل رسمي أكثر يشار إليها باسم ldquomolecular orbitals و rdquo

يمكنك التفكير في الأمر مثل الإلكترونات التي تحتاج إلى & ldquopay rent & rdquo في شكل طاقة للعيش في منازل مختلفة. وبفضل تلك الطاقة التي تسحب البروتونات التي كنت أتحدث عنها ، فإن المدارات البعيدة عن نوى الجزيئات & ndash في الضواحي & ldquoelectronic & rdquo & ndash تتطلب الإلكترونات لدفع إيجار أعلى (لديها طاقة أعلى) من تلك الأقرب منها. عادةً ما تعيش الإلكترونات فيها & ldquoground state & rdquo حيث يقومون & rsquore بقدر ما يمكنهم * بشكل مريح * الحصول عليه. لكن الوضع السكني لم يتم تعيينه في الحجر & ndash it & rsquos ممكن & ldquoupgrade & rdquo & ndash ولكن عليك أن تكون قادرًا على دفع الفرق في الإيجار. في و ldquoexact و rdquo التغيير. ويمكن أن تأتي أموال الطاقة هذه من فوتونات الضوء - ولكن هذا الضوء يجب أن يحتوي على الجزيء والطاقة المثلى.

بفضل تركيباتها الكيميائية الفريدة ، تحتوي الجزيئات المختلفة على منازل إلكترونية متباعدة بشكل مختلف مع اختلافات طاقة مختلفة فيما بينها ، وبالتالي فإن كمية الطاقة المطلوبة للإثارة تختلف من جزيء إلى آخر ، وللحصول على هذه الطاقة من الضوء ، فأنت بحاجة إلى ضوء مع الفوتونات التي تعطيك & ldquo بالضبط التغيير & rdquo لدفع فرق الإيجار. لذلك تمتص الجزيئات المختلفة أطوال موجية مختلفة من الضوء.

إذا كنت تفضل تشبيه الكلب ، على المستوى دون الذري ، فإنه يشبه نوعًا ما مثل الكلب الذي يرى سنجابًا ، ويتحمس ، ويمد المقود ليبتعد بعيدًا. جزيئات مختلفة لديها إلكترونات التي تحمس بواسطة ldquodifferent السناجب و rdquo

سنجاب أو ضواحي ، يمكن للإلكترون المتحمس أن يبقى في هذا المدار الخارجي لفترة طويلة وسيعود إلى حالته الأرضية الأكثر راحة ، مما يعيد الطاقة التي امتصها. في التألق ، يتم إطلاق الطاقة الممتصة كفوتون آخر (ولكن ذو طاقة وطول موجي مختلف وأقل) ولكن في معظم الأوقات عندما يمتص الجزيء الضوء فإنه يخفيه فقط من طيف الإشعاع الكهرومغناطيسي (EMR) وبدلاً من إعطائنا الضوء ، يفقد الطاقة كحرارة ، إلخ.

لكن لا يزال بإمكاننا اكتشاف أن الضوء قد سُرق & ndash إذا كان يسرق الضوء من جزء الضوء المرئي من الطيف ، فيمكننا معرفة حدوث شيء بأعيننا المجردة. يتكون الضوء الأبيض من جميع ألوان قوس قزح ، وإذا سُرق لون واحد و rsquos (ممتص) ، فإننا نرى & ldquoleftovers & rdquo بلون مختلف. تساعدك عجلة الألوان في رؤية اللون الذي سيظهر به شيء ما إذا تم امتصاص اللون المقابل له.

لكن الجزيئات يمكنها أيضًا امتصاص الضوء الذي يمكننا رؤيته & ndash وغالبًا ما يتضمن ذلك الأشعة فوق البنفسجية! على الرغم من أنه يمكننا & rsquot رؤية الأشعة فوق البنفسجية ، إلا أن مقياس الطيف الضوئي يمكنه ذلك. حتى نتمكن من النظر إلى مطياف ونأمل أن نضحك أخيرًا.

لا تنزعج إذا رأيت قممًا متعددة و / أو واسعة & ndash لأن الجزيئات يمكن أن تحتوي على الكثير من الذرات مع الكثير من الإلكترونات ولأن هناك بعض المساحة & ldquowiggle & rdquo فيما يتعلق بمستويات الطاقة ، فإن الجزيئات لا تمتص فقط طول موجي واحد. غالبًا ما يكون لها طول موجي تمتصه بقوة أكبر ، مما يتوافق مع الإلكترون الذي يتم الترويج له بسهولة ، مع بعض الامتصاص المنخفض على كلا الجانبين (مثل منحنى الجرس) يتوافق مع اتساع التذبذب ومن ثم ربما بعض القمم الثانوية في مكان آخر تتوافق مع إلكترونات مختلفة يحصل على الترقية

يمكنك أن ترى هذا إذا نظرت إلى طيف امتصاص UV-Vis ، كما يمكنك الحصول عليه إذا كنت تستخدم مقياس طيف ضوئي مثل NanoDrop. في الأساس ، يسلط الضوء من خلال محلول ويقيس إلى أي مدى تمر الأطوال الموجية المختلفة (تنتقل) مقابل دون و rsquot تجعله يمر (يتم امتصاصه). نظرنا في كيفية تحويل هذا إلى تركيز مذاب (جزيئات مذابة) باستخدام قانون Beer & rsquos http://bit.ly/2N4nzXE

& epsilon = معامل الانقراض (ويعرف أيضًا باسم معامل الامتصاصية المولارية) & ndash خاص بجزيء معين ووحدات الطول الموجي الخاصة بـ L mol-1cm-1

c = التركيز (في mol / L) & ndash هذه مولارية & ndash a mole هو مجرد كيميائي & rsquos & ldquobaker & rsquos dozen & rdquo & ndash it & rsquos Avogadro & rsquos number (6.022 x 10 ^ 23) لشيء ما & ndash عدد جزيئات الذائبة أو دونات ، فقط .ly / 2r4RnrX

بالنسبة لقانون Beer & rsquos ، فأنت تحتاج فقط إلى الامتصاص بطول موجي واحد & ndash ، ولكن هناك الكثير لتتعلمه إذا نظرت إلى الطيف بأكمله (أو على الأقل قيمتين أساسيتين). نظرًا لأن الجزيئات لها أطياف متداخلة (على سبيل المثال ، يمتص كل من DNA و RNA الضوء بطول موجة 260 نانومتر) ، فأنت تنظر إلى النسب. النسبتان الأساسيتان عند تحليل جودة الحمض النووي (DNA أو RNA) هما 260/230 و amp 260/280.

من حيث الجزيئات الحيوية ، في 260 & ndash الماصات السائدة هي DNA & amp RNA & amp at 280 & ndash الممتص المهيمن هو البروتين

260/280: يخبرك عن البروتين والتلوث ldquocontamination & rdquo & ndash لقد وضعت التلوث في الاقتباسات لأنك إذا قمت بتحليل البروتين ، فإنه & rsquos DNA هو الملوث!

260/230: يخبرك عن & ldquocontamination & rdquo من البروتينات و / أو أشياء مثل الفينول أو الأملاح المتبقية من عملية التنقية.

يحتوي كل من DNA و RNA على 4 أحرف فقط ، وجميعهم يمتصون 260 نانومتر من الضوء ، ولكن الجزء الفريد من نوعه يقوم بامتصاص و ndash الأدينين والجوانين والسيتوزين والثيمين / اليوراسيل. هذه هي الحلقات العطرية (الحلقات العطرية هي حلقات حيث يوجد & rsquos بعض الإلكترونات المشتركة التي تعمل على استقرارها & ndash أكثر هنا: http://bit.ly/2Xj4Zyc). يقلل تحديد موقع الإلكترون هذا من خلال الرنين من تكلفة النقل (لتعزيز الإلكترون) ، لذلك غالبًا ما تكون الحلقات العطرية موجودة في أشياء مثل الأصباغ.

تمتص جميع هذه القواعد عند 260 ، ولكن بدرجات مختلفة- & gt إذا قمت بقياس نسب 260/280 لكل نيوكليوتيد بشكل منفصل ستحصل على: الجوانين: 1.15 الأدينين: 4.50 السيتوزين: 1.51 اليوراسيل: 4.00 الثايمين: 1.47

شيء واحد قد تلاحظه هو أن اليوراسيل (U) الموجود في الحمض النووي الريبي ولكن ليس الحمض النووي يحتوي على 260/280 أعلى بكثير من نظيره في الحمض النووي ، الثايمين (T) وندش نتيجة لذلك ، فإن الحمض النووي الريبي النقي لديه نسبة 260/280 أعلى من النقي. الحمض النووي

إذا كنت تأخذ المتوسط ​​المرجح للقواعد المختلفة في الاعتبار ، فيجب أن يكون للحمض النووي الريبي النقي نسبة A260 / A280 من

ضوء 260 نانومتر أكثر بمرتين من ضوء 280 نانومتر) وأمبير DNA مزدوج الشريطة ، والذي يمتص فقط

1.8 مرة أكثر عند 260 مقابل 280 ، يجب أن يكون لها نسبة A260 / A280 تبلغ

على الرغم من أن التركيبة الأساسية ستؤثر على معامل الانقراض الدقيق (قياس مدى جودة امتصاص شيء معين لطول موجي محدد وندش الشيء الذي تلتصق به في قانون Beer & rsquos لتحويل الامتصاص إلى تركيز ، فلا يزال بإمكانك تقدير معاملات الانقراض لـ & ldquogeneric & rdquo DNA & amp RNA

dsDNA: 50ng-cm / & microl - & gt A260 من 1.0 يتوافق مع 50ug / mL (ng / ul) من dsDNA النقي

ssDNA: 33ng-cm / & microl

RNA: 40ng- سم / وميكرول

من هذه القيم يمكنك أن ترى أن تقطّع السبل مهم. عندما يكون الحمض النووي مزدوجًا ، فإن قواعده (الأجزاء التي تمتص الضوء) تكون & ldquohidden & amp & ldquobusy & rdquo مرتبطة بالقاعدة الموجودة على الشريط الآخر. ولكن مع وجود حمض نووي منفرد تقطعت به السبل ، تكون القواعد في العراء وحرة في الامتصاص. نتيجة لذلك ، تحصل على تحول مفرط اللون - يمتص DNA أحادي السلسلة (ssDNA) المزيد من ضوء الأشعة فوق البنفسجية من الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) ويمتص النيوكليوتيدات الخالية من الأمبير بقوة أكبر من أي منهما.

تبلغ ذروة البروتينات 280 وأمبير 230. أجزاء البروتينات التي تمتص عند 280 هي حلقات عطرية (يبدو مألوفًا؟) 3 فقط من الأحماض الأمينية الشائعة البالغ عددها 20 تحتوي على هذه & ndash التربتوفان (Trp) و amp Tyrosine (Tyr) هما المساهمان الرئيسيان و ndash Trp the معظم ذلك & ndash Phenylalanine له حلقة أيضًا ، لكنه لا يمتص هنا كثيرًا. يمكن أن تمتص الروابط المتقاطعة Cysteine ​​أيضًا ، عند الاقتضاء & ndash والبروتينات المختلفة لها أعداد مختلفة من كل هذه. لذا تمتص البروتينات المختلفة ضوء 280 نانومتر بشكل مختلف ، وهو ما ينعكس بواسطة معاملات الانقراض المختلفة.

يمكنك حساب معامل الانقراض المقدر باستخدام أدوات برمجية مجانية على الإنترنت مثل Expasy ProtParam. أقول مقدرة لأن السياق مهم - البيئة المحلية حول الجزء الممتص يمكن أن تؤثر على مدى حرصها على امتصاص فوتون

تمتص البروتينات أيضًا عند 230 نانومتر وهذا الامتصاص من جزء العمود الفقري العام & ndash يتوافق مع الامتصاص بواسطة روابط الببتيد التي تربط الحروف. تحتوي روابط الببتيد هذه أيضًا على صدى ، ولكن ليس بقدر ما تفعل الحلقات ، وهي تمتص

نظرًا لأن الحمض النووي يمتص بقوة في UV260 ، حيث لا يكون البروتين و rsquot ، فمن السهل نسبيًا معرفة ما إذا كان لديك DNA في إعداد البروتين الخاص بك ، ولكن من الصعب معرفة ما إذا كان لديك بروتين في إعداد الحمض النووي الخاص بك & ndash 260 سوف يهيمن على نسبة 260/280

أنت أيضًا تريد إلقاء نظرة على قيم 260/230 - & gt للأحماض النووية النقية ، عادةً ما تكون

حتى الآن ، فإن & ldquocontaminants & rdquo نحن & rsquove التي ناقشناها هي جزيئات حيوية تمت تنقيتها مع الجزيء الذي قمت بتنقيته ، ولكن يمكن أن تأتي الملوثات أيضًا من المواد الكيميائية التي استخدمتها في عملية التنقية

أنت & ldquoblank & rdquo مقياس الطيف الضوئي قبل الاستخدام & ndash تأخذ طيف السائل الذي يتم إذابة الجزيئات فيه لاستخدامها كـ & ldquobackground & rdquo تقوم بطرح & ndash ، لكن لا يتضمن فراغك & rsquot أشياء يجب أن تكون موجودة بعد الآن & ndash المواد الكيميائية التي تم استخدامها في مرحلة ما في عملية التنقية يجب أن تختفي في النهاية

على سبيل المثال ، غالبًا ما تستخدم أملاح الفينول وأمبير شوتروبيك مثل غوانيدين عند تنقية الأحماض النووية ، مثل استخراج الفينول كلوروفورم أو تريزول (المزيد هنا: http://bit.ly/2Xj4Zyc)

هذه تمتص بقوة عند 230 نانومتر ، وهذا (بالإضافة إلى حقيقة أن البروتينات تمتص هناك أيضًا) هو السبب في أن نسبة 260/230 المنخفضة يمكن أن تكون مقلقة إذا كنت تبحث في تحضير الحمض النووي.

تريد أيضًا أن تنظر إلى الامتصاص عند 320 نانومتر. يخبرك هذا عن تعكر عينتك & ndash إذا كانت عينتك & ldquocloudy & rdquo & ndash جزيئات معلقة في المحلول يمكن أن تشتت الضوء ، مما يمنعه من الوصول إلى جميع جزيئاتك. لذلك يتم تعديل هذا ل.

لذلك بالنسبة للحمض النووي ، يمكنك الحصول على التركيز باستخدام هذه المعادلة: التركيز (ميكروغرام / مل) = (قراءة A260 وقراءة ndash A320) × عامل التخفيف × 50 ميكروغرام / مل


عزل الحمض النووي الريبي

لا يقوم المرفق بتنقية كاملة من الحمض النووي الريبي. نحن نطلب ما لا يقل عن 500 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لمراقبة الجودة وإعداد المكتبة لتسلسل Illumina. يوجد عدد من المجموعات والبروتوكولات التجارية الراسخة لمجموعة متنوعة من الأنواع وأنواع الأنسجة / الخلايا. يحتاج المحققون بعناية إلى تحديد أنسب الطرق لنوع الأنسجة / الخلية الخاصة بهم. يشجع المرفق الأساسي بشدة المشاريع التجريبية لتأكيد أن الطريقة المختارة ستخلق بشكل متكرر كميات كافية من إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأنسجة / الخلية المعنية. نظرًا للتنوع الهائل في أنواع الأنسجة / الخلايا ، يصعب علينا تقديم توصيات محددة. لأي شخص غير متأكد من المنتج الذي يختاره ، نشجعك بشدة على فحص المنتجات من Qiagen و Ambion (LifeTech) كنقطة انطلاق. تمتلك هذه الشركات مجموعة كبيرة ومتنوعة من المنتجات مع مخططات القرار لمساعدتك في اختيار المنتج المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كنت بحاجة إلى مشورة أكثر تفصيلاً ، فهناك أشخاص في الدعم الفني في هذه الشركات هم بالفعل خبراء في عزل الحمض النووي الريبي ولديهم خبرة واسعة في مساعدة العملاء على عزل الحمض النووي الريبي من كل الأنواع / الأنسجة / الخلايا التي يمكن تصورها. ومع ذلك ، لدينا بعض التوصيات العامة المتعلقة بتقنيات عزل الحمض النووي الريبي بناءً على تجربتنا.

لا نوصي باستخدام Trizol وحده لعزل الحمض النووي الريبي بالكامل ، لأن استخدام Trizol غالبًا ما ينتج عنه عينات ملوثة بالبروتينات والمواد العضوية التي يمكن أن تمنع عملية صنع المكتبة. نوصي بمنتجات مثل RNeasy ، وهي طريقة تنقية قائمة على العمود تنتج مستحضرات نقية جدًا من إجمالي الحمض النووي الريبي. لقد اكتشف العديد من عملائنا أنهم حصلوا على عوائد فائقة مع Trizol لذلك قاموا بإجراء عزل أولي مع Trizol متبوعًا بعملية تنظيف أخرى باستخدام مجموعة RNeasy. لقد لاحظنا أن هذا يؤدي إلى RNA نقي جدًا وقد تم استخدام هذه الطريقة بنجاح في RealTime PCR والمصفوفات الدقيقة و RNA-Seq.


عزل الحمض النووي الريبي عالي الجودة من ثمار الأفوكادو (بيرسي امريكانا مطحنة.)

تحتوي ثمار الأفوكادو على نسبة عالية من الكربوهيدرات والبروتينات الهيكلية وتحتوي أيضًا على مادة البوليفينول التي تتداخل مع عزل كمية وجودة عالية من الحمض النووي الريبي. كان الهدف من هذه الدراسة هو تحسين عزل الحمض النووي الريبي من ثمار الأفوكادو لنسخ الحمض النووي التكميلي (cDNA) لاحقًا. وصفنا بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي المستند إلى سيتيل ترايميثيل الأمونيوم (CTAB) الأمثل الذي يسمح بالاستخراج الفعال للحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من الجلد ولحم الفاكهة دون استخدام الفينول. إجمالي الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من هذا الإجراء ذو ​​جودة عالية وغير متحلل ، كما تم تقييمه بواسطة القراءات الطيفية والرحلان الكهربائي ، وتم استخدامه بنجاح في تخليق (كدنا). هذا هو التقرير الأول لاستخراج الحمض النووي الريبي الفعال من ثمار الأفوكادو.

يسلط الضوء

► وصفنا بروتوكولًا محسنًا قائمًا على بروميد سيتيل ترايميثيل الأمونيوم لاستخراج الحمض النووي الريبي من جلد ولحم فاكهة الأفوكادو. أظهر التقييم عن طريق القياس الطيفي والرحلان الكهربائي الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي (RNA) والتي أثبتت أنها مناسبة للنسخ إلى (كدنا). ► هذا أول تقرير عن عزل الحمض النووي الريبي الفعال من ثمار الأفوكادو.


التحليل البيولوجي

يعد نقاء (درجة التلوث) وجودته (سلامة أو سلامة) الحمض النووي الريبي من العناصر الأساسية للطرق التي تقيم التعبير الجيني ، مثل qPCR في الوقت الحقيقي والمصفوفات الدقيقة. تتطلب كلتا الطريقتين RNA عالي الجودة للنجاح. يمكن أن تؤدي العينة الملوثة إلى تثبيط المكونات الأنزيمية للنسخ العكسي (النسخ العكسي) وتفاعلات qPCR (البوليميراز). يمكن أن تؤدي العينة المتدهورة إلى بيانات مضللة وعدم تناسق في إمكانية التكاثر. لذلك ، من الأهمية بمكان تقييم ليس فقط كمية الحمض النووي الريبي ، ولكن النقاء والجودة قبل إجراء تجارب التعبير الجيني.

فيما يلي بعض حقائق الحمض النووي الريبي (من Alberts، B. et al. (1994) البيولوجيا الجزيئية للخلية):

  • تحتوي خلية الثدييات النموذجية على 10-30 بيكوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي
  • يوجد ما يقرب من 360.000 جزيء mRNA في خلية ثديية واحدة ، مع ما يقرب من 12000 نوع مختلف من mRNA لكل خلية
  • تشكل بعض mRNAs ما يصل إلى 3٪ من تجمع mRNA بينما يمثل البعض الآخر أقل من 0.01٪
  • قد يكون لهذه الأنواع منخفضة الوفرة من الرنا المرسال عدد نسخ يصل إلى 5-15 جزيء لكل خلية. ومع ذلك ، قد تمثل هذه الأنواع النادرة ما يصل إلى 11000 نوع مختلف من الرنا المرسال ، والتي تشكل 45٪ من سكان الرنا المرسال.

في ضوء ذلك ، تعتبر سلامة الحمض النووي الريبي مهمة بشكل خاص في تفاعل qPCR الخاص بك بحيث يتم تمثيل جميع أنواع الرنا المرسال بشكل كافٍ في عينة (كدنا) الخاصة بك.

ال نقاء يمكن تقييم RNA عمومًا عن طريق طرق القياس الطيفي ، تمتص جميع النيوكليوتيدات (وبالتالي ، RNA ، ssDNA ، و dsDNA) عند 260 نانومتر ، يمتص البروتين بقوة عند 280 نانومتر أو بالقرب منه ، والكربوهيدرات بالقرب من 230 نانومتر والفينول (كاشف TRIzol هو محلول الفينول) له قمتان للامتصاص عند 230 و

270 نانومتر. لذلك ، يمكن استخدام نسب الامتصاص عند 260/280 نانومتر و 260/230 نانومتر لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي: نسبة OD 260/280 نانومتر من 1.8-2.0 تدل على جودة عالية من الحمض النووي الريبي في حين أن قيم OD 260/230 نانومتر شائعة في نطاق 2.0-2.2 للحمض النووي الريبي عالي الجودة. إذا كانت النسبة أقل بشكل ملحوظ مما هو متوقع ، فقد تشير إلى وجود ملوثات تمتص عند 280 أو 230 نانومتر. يمكن أيضًا أن يؤدي تلوث الحمض النووي الجيني في إعداد إجمالي الحمض النووي الريبي إلى المبالغة في تقدير كمية الحمض النووي الريبي الموجودة. ومع ذلك ، فإن هذه القياسات الطيفية لا تقدم أي معلومات حول سلامة الحمض النووي الريبي.

نظرًا لأن الحمض النووي الريبي الريباسي (rRNA) يشكل أكثر من 80 ٪ من إجمالي عينات الحمض النووي الريبي ، فإن سلامة أنواع الرنا الريباسي الرئيسية (18S و 28S للثدييات الرنا الريباسي) تُستخدم بشكل روتيني لتقييم سلامة عينة الحمض النووي الريبي. يمكن للمرء أن يتخيل عصابات الحمض النووي الريبي 28S و 18S مع صبغة الفلورسنت (بروميد الإيثيديوم) بعد الرحلان الكهربائي على هلام الفورمالديهايد agarose. سيكون للحمض النووي الريبي عالي الجودة خلفية قليلة جدًا في الممر ، وسيكون النطاق الأعلى (28S) ضعف كثافة النطاق السفلي (18S) تقريبًا. هذه الطريقة شاقة للغاية (التعامل مع الجهاز والحفاظ على بيئة خالية من RNase) ، وتستغرق وقتًا طويلاً ، وتتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي من أجل التصور وليست كمية.

يقدم التحليل الحيوي باستخدام نظام التفريد الكهربائي ذو القاعدة السائلة الدقيقة معلومات عن كمية الحمض النووي الريبي ونقاوته وجودته. ال Agilent Bioanalyzer في المعامل الأساسية لهذا الغرض وبالنسبة للباحثين في مستشفى St. يتطلب الإجراء القليل جدًا من الحمض النووي (1 ميكرولتر) وله نطاق ديناميكي واسع حيث يمكن القراءة من نانوجرام (مجموعة RNA Nano الكلية) وصولاً إلى كميات بيكوغرام من الحمض النووي الريبي (مجموعة RNA Pico الكلية). يحسب المحلل الحيوي قياسين لجودة الحمض النووي الريبي (نسبة الحمض النووي الريبي 28S / 18S ورقم تكامل الحمض النووي الريبي ، RIN) كما أنه يمنحك تقديرًا أكثر دقة للـ mRNA لتطبيع قالب الحمض النووي الريبي الخاص بك في النسخ العكسي.

يتم إعطاء النتائج على شكل مخطط كهربية لتقدير الكميات وهلام للفحص البصري لجودة الحمض النووي الريبي. يتم تقريب كمية الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق أخذ المنطقة الواقعة تحت قمم 28S و 18S rRNA من المخطط الكهربائي ، (والذي يشكل حوالي 90٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي في عينتك). تنعكس الجودة في نسبة 28S / 18S وكذلك أ RIN (رقم سلامة RNA)، والذي يأخذ الأثر الكهربي بالكامل في الحسبان. تسمح خوارزمية برنامج RIN بتصنيف مجموع الحمض النووي الريبي النواة ، استنادًا إلى نظام الترقيم من 1 إلى 10 ، مع كون 1 هو الملف الشخصي الأكثر تدهورًا و 10 هو الأكثر سلامة.

التأكد من أن عينات الحمض النووي الريبي الخاصة بك قابلة للمقارنة من حيث النقاء والجودة سيضمن تقليل التباين عبر التكرارات البيولوجية. علاوة على ذلك ، فإن البدء بجودة منخفضة من الحمض النووي الريبي قد يؤثر سلبًا على نتائج التطبيقات النهائية التي تتطلب عمالة مكثفة وتستغرق وقتًا طويلاً وغالبًا ما تكون باهظة الثمن. يوصى باستخدام RIN أعلى من 5 كمقياس لسلامة الحمض النووي الريبي اللائق ، بينما يتم استخدام RIN أكبر من 8 كنزاهة مثالية لـ RNA للتطبيقات النهائية. يوصى باستخدام RNA مع RIN من & gt7 لتطبيقات qPCR النهائية. للحصول على مقالة شاملة تصف تأثير تكامل الحمض النووي الريبي على أداء PCR في الوقت الفعلي ، راجع مقالة Fleige and Pfaffl (ملف 224 kbpdf).

عينة مخطط كهربية من Agilent Bioanalysis (وجدول النتائج المقابل الذي يوضح رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) ونسبة الرنا الريباسي (28 ثانية / 18 ثانية) وتركيز الحمض النووي الريبي:

السيناريوهات المحتملة الأخرى التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي ونتائج qPCR:

جودة عالية من الحمض النووي الريبي الكلي السليم:

  • خط الأساس المسطح
  • قمم 18S / 28S منفصلة جيدًا
  • أكتاف قليلة جدا من القمم
  • لا توجد جزيئات rRNA صغيرة
  • محاذاة جيدة للعلامة السفلية
  • نسبة 28S / 18S جيدة
  • ارتفاع RIN (9.7)

مجموع الحمض النووي الريبي المتدهورة جزئيًا:

  • ارتفاع خط الأساس
  • قمم 18S / 28S مميزة ، ولكن غير منفصلة
  • نسبة 28S / 18S أقل
  • انخفاض RIN (7.7)

مجموع الحمض النووي الريبي المتحلل بالكامل:

  • لا توجد قمم ريبوسوم مميزة (18S / 28S)
  • تحويل القمم إلى نطاق الوزن الجزيئي المنخفض
  • تلطيخ بدرجة عالية من الوزن الجزيئي المنخفض
  • منخفض جدًا RIN (2.5)

Genomic contamination:

Trizol extracted total RNA:

  • Presence of small rRNA in fast region (25-30 s) which is usually eliminated from total RNA preps using column purification

Total Eukaryotic (nano) RNA ladder:

  • 6 distinct peaks, flat baseline
  • Used as quality control measure AND to assign migration of 18S and 28S peaks
  • 6 Peaks migrating (following 25 nt marker) at 200, 500, 1000, 2000, 4000 and 6000 nt

Depending on your predicted RNA yield, you can choose between several chips for bioanalysis. Here is an overview of the different kits available and highlighted are the kits available in the Keenan Research Centre for Biomedical Science Molecular Core:


Re : DO 260/280 et 260/230

en effet, c'est a.
les acides nucl iques absorbent MAJORITAIREMENT 260nm
les prot ines absorbent MAJORITAIREMENT 280nm ( cause des acides amin s aromatiques (Phe, Trp, Tyr)
les mol cules organiques (tampons, etc. ) absorbent MAJORITAIREMENT 230nm.

C'est pourquoi un mauvais ratio 260/280 (g n ralement < 1.9) indique une contamination par prot ines et un mauvais ratio 260/230 (g n ralement > 2) indique une contamination par mol cules organiques.

Maintenant si ta question est "Pourquoi on peut pas avoir un rapport de 10'000 si on a pas du tout de contaminant ?", alors l , sauf erreur de ma part, et c'est pourquoi j'ai accentu le "MAJORITAIREMENT", c'est que les acides nucl iques absorbent aussi un petit peu 230 ou 280, ce qui fait que la mesure de l'absorbtion 230 ou 280 n'est jamais de 0.


Expert Insight: FREE WEBINAR: A New Approach for DNA/RNA Sample Assessment Using the NanoDrop One


Experimental techniques such as PCR, qPCR, cloning, sequencing, and transfection require samples of known concentration and purity. The success of an experiment depends in part on the accurate evaluation of the nucleic acid sample.

Absorbance at 260nm is the most popular method for DNA and RNA quantification. However, residual chemicals from the nucleic acid extraction process as well as co-purified cell components can affect the A260 concentration result and the purity ratios (260/280, 260/230) don&rsquot tell the whole story about sample purity.

In an upcoming SelectScience ® webinar, Dr. Kodoyianni, Product Manager for the Thermo Scientific&trade NanoDrop&trade microvolume UV-Vis instruments, will discuss the important steps towards accurate nucleic acid quantification.

Plus, you&rsquoll hear about the Thermo Scientific&trade NanoDrop&trade One&trade Acclaro Sample Intelligence technology that uses powerful mathematical algorithms to identify contaminants and deliver accurate information about both concentration and purity for success in your downstream experiments.

In this webinar, you will learn:
&bull how contaminants in DNA and RNA samples can affect absorbance at 260 and concentration results
&bull how the purity ratios 260/280 and 260/230, although useful, don&rsquot tell the whole story about sample purity
&bull how the cutting-edge NanoDrop One Acclaro Sample Intelligence technology uses powerful chemometric algorithms to identify contaminants and provide corrected concentrations

Who should attend:
&bull Any scientist who works with DNA and RNA samples.
&bull Any scientist working with molecular biology techniques such as PCR, qPCR, cloning, sequencing, and transfection.


Unable to join us live? We can send you an on-demand link after the event. Sign up here for the on-demand version.


شاهد الفيديو: مقارنة بين الحمض النووي RNA,DNA أ. سعيد الحصري (قد 2022).


تعليقات:

  1. Pendragon

    إنها عبارة ممتازة ببساطة

  2. Mogis

    نعم ، يبدو بطريقة مغرية

  3. Kandiss

    برافو ، فكرتك أنها رائعة

  4. Keshura

    بطريقة رائعة!

  5. Shakajin

    يا له من موضوع فضولي



اكتب رسالة