معلومة

4.5 أ: الألياف الدقيقة - علم الأحياء

4.5 أ: الألياف الدقيقة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تستخدم الألياف الدقيقة ، وهي أنحف جزء من الهيكل الخلوي ، لإعطاء شكل للخلية ودعم جميع أجزائها الداخلية.

أهداف التعلم

  • وصف بنية ووظيفة الميكروفيلامين

النقاط الرئيسية

  • تساعد الألياف الدقيقة في حركة الخلايا وهي مصنوعة من بروتين يسمى الأكتين.
  • يعمل الأكتين مع بروتين آخر يسمى الميوسين لإنتاج حركات العضلات وانقسام الخلايا والتدفق السيتوبلازمي.
  • تحافظ الألياف الدقيقة على العضيات في مكانها داخل الخلية.

الشروط الاساسية

  • الأكتين: بروتين هيكلي كروي يتبلمر بطريقة حلزونية لتشكيل خيوط أكتين (أو خيوط دقيقة).
  • خيطي: لها شكل خيوط أو شعيرات
  • الميوسين: عائلة كبيرة من البروتينات الحركية توجد في الأنسجة حقيقية النواة ، مما يسمح بالحركة في العضلات

الميكروفيلامين

إذا تمت إزالة جميع العضيات من الخلية ، فلن يكون غشاء البلازما والسيتوبلازم هما المكونان الوحيدان المتبقيان. سيظل هناك داخل السيتوبلازم أيونات وجزيئات عضوية ، بالإضافة إلى شبكة من ألياف البروتين التي تساعد في الحفاظ على شكل الخلية ، وتأمين بعض العضيات في مواقع محددة ، والسماح للسيتوبلازم والحويصلات بالتحرك داخل الخلية ، وتمكين الكائنات وحيدة الخلية من التحرك بشكل مستقل. تُعرف هذه الشبكة من ألياف البروتين بالهيكل الخلوي. هناك ثلاثة أنواع من الألياف داخل الهيكل الخلوي: الخيوط الدقيقة ، والخيوط الوسيطة ، والأنابيب الدقيقة. من بين الأنواع الثلاثة لألياف البروتين في الهيكل الخلوي ، فإن الألياف الدقيقة هي الأضيق. تعمل في الحركة الخلوية ، ويبلغ قطرها حوالي 7 نانومتر ، وهي مصنوعة من خيطين متشابكين من بروتين كروي يسمى الأكتين. لهذا السبب ، تُعرف الخيوط الدقيقة أيضًا باسم خيوط الأكتين.

يتم تشغيل الأكتين بواسطة ATP لتجميع شكله الخيطي ، والذي يعمل كمسار لحركة بروتين محرك يسمى الميوسين. يمكّن هذا الأكتين من الانخراط في الأحداث الخلوية التي تتطلب الحركة مثل انقسام الخلايا في الخلايا الحيوانية والتدفق السيتوبلازمي ، وهو الحركة الدائرية للسيتوبلازم الخلوي في الخلايا النباتية. الأكتين والميوسين وفير في خلايا العضلات. عندما تنزلق خيوط الأكتين والميوسين عن بعضها البعض ، تنقبض عضلاتك.

توفر الألياف الدقيقة أيضًا بعض الصلابة والشكل للخلية. يمكنهم إزالة البلمرة (التفكيك) والإصلاح بسرعة ، وبالتالي تمكين الخلية من تغيير شكلها والتحرك. تستفيد خلايا الدم البيضاء (خلايا الجسم التي تقاوم العدوى) من هذه القدرة. يمكنهم الانتقال إلى موقع الإصابة وابتلاع العامل الممرض.


تعبير بروتين الصدمة الحرارية 70 ، فسفرة الكيراتين وتكوين جسم مالوري في خلايا الكبد من فئران غريزوفولفين المسكرة

الكيراتين هي أعضاء في بروتينات الخيوط الوسيطة (IFs) ، والتي تشكل واحدة من عائلات البروتينات الهيكلية الخلوية الرئيسية الثلاث. في خلايا الكبد ، يعتقد أن الكيراتين 8 و 18 (K8 / 18) يلعبان دورًا وقائيًا ضد الإجهاد الميكانيكي والسموم. يُعتقد أن التعديلات اللاحقة للترجمة مثل الفسفرة والجليكوزيل تعدل وظائف K8 / 18. يستحث علاج الفأر بنظام غذائي يحتوي على الجريزوفولفين (GF) ، في خلايا الكبد ، تعديلات في التنظيم والتعبير والفسفرة لـ K8 / 18 IFs ويؤدي ، على المدى الطويل ، إلى تكوين K8 / 18 الذي يحتوي على مجاميع متطابقة شكليًا وكيميائيًا توجد أجسام مالوري في عدد من أمراض الكبد البشرية. كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقق من العلاقة بين مستوى وتوطين بروتين الصدمة الحرارية المحرض على الإجهاد 70 كيلو دالتون (HSP70i) ومستوى وتوطين الفسفرة K8 / 18 في كبد الفئران المصابة بـ GF. تمت دراسة دور هذه العمليات في تكوين أجسام مالوري أيضًا. أجريت التجربة بشكل متوازي على سلالتين مختلفتين من الفئران ، C3H و FVB / n.

نتائج

تسبب علاج GF في زيادة تعبير HSP70i و K8 فسفرة على سيرين 79 (K8 S79) و 436 (K8 S436) و K18 فسفرة على سيرين 33 (K18 S33) كما هو محدد بواسطة النشاف الغربي. باستخدام تلطيخ التألق المناعي ، أظهرنا أنه بعد العلاج ، كان HSP70i موجودًا في جميع خلايا الكبد. ومع ذلك ، تمت ملاحظة K8 S79 المفسفرة (K8 pS79) و K8 S436 (K8 pS436) فقط في مجموعات من خلايا الكبد أو في خلايا الكبد المعزولة. تمت زيادة K18 pS33 في جميع خلايا الكبد. HSP70i متحد مع MBs التي تحتوي على الفسفرة K8 / 18. لوحظ أن Phophorylation لـ K8 S79 في MBs الفئران C3H ولكنها لم تكن موجودة في FVB / n MBs.

الاستنتاجات

تشير نتائجنا إلى أن تسمم GF يمثل حالة إجهاد تؤثر على جميع خلايا الكبد ، في حين أن تحريض الفسفرة K8 / 18 لا يحدث في كل خلية كبدية. نستنتج أن، في الجسم الحي، لا توجد علاقة مباشرة بين الإجهاد الناجم عن GF و K8 / 18 الفسفرة في المواقع المدروسة. يشير نمط الفسفرة K8 / 18 إلى تنشيط مسارات إشارات الخلية المختلفة في مجموعات سكانية فرعية من خلايا الكبد. علاوة على ذلك ، تظهر نتائجنا أنه ، في الخلفيات الجينية المتميزة ، يمكن أن يكون تحريض الفسفرة K8 / 18 مختلفًا.


الملخص

عملية أساسية في توقع في الجسم الحي يتضمن النشاط الدوائي للجزيء المرشح تقييم الاستجابات المستهدفة باستخدام أنظمة النماذج المعمول بها. بينما تشتمل هذه النماذج إلى حد كبير على خلايا خالدة ، والتي غالبًا ما يتم تمريرها بشكل متسلسل كطبقات أحادية على ركائز صلبة بشكل موحد ويتم تعديلها للتعبير عن عنصر أو أكثر من مكونات مسار الاهتمام ، وأهمية هوية الخلية ، وعدم التجانس ، وثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد). ) السياق إلى الاستجابة المستهدفة يكتسب اهتمامًا متزايدًا. هنا ، نقوم بتقييم استجابات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الظهارية للماوس في ثلاثة أنظمة نموذجية متميزة: العضيات الأولية ثلاثية الأبعاد ، والخلايا الظهارية الأولية ثنائية الأبعاد ، والخلايا ثنائية الأبعاد الخالدة. على وجه التحديد ، نقوم بتقييم استجابات الكالسيوم داخل الخلايا لعدد من الإشارات خارج الخلية المتورطة في تنظيم وظيفة الخلية القاعدية (أو الظهارية العضلية). توفر هذه النتائج مزيدًا من الأفكار حول نوع الخلية والاستجابات الدوائية الخاصة بالسياق في الخلايا الظهارية للثدي وتسلط الضوء على الفرص والتحديات في اعتماد المعقد المعماري وغير المتجانسة. في المختبر المقايسات في البحث الدوائي.


نتائج ومناقشة

توليد وتطور الأشكال الإسوية Tm.

عدد الجينات Tm يختلف من واحد واثنين في الفطريات شيزوساكارومايس بومب و خميرة الخميرة، على التوالي ، أربعة في الثدييات وستة في أسماك الحمار الوحشي (دانيو ريريو). 26 , 27 الجدول 1 يسرد الجينات المحددة في 6 أنظمة نماذج حيوانية تمت دراستها بشكل شائع مع موقع الكروموسوم والجينات الموجودة بالقرب من موقع Tm. ومن المثير للاهتمام ، أن موقع Tm تم العثور عليه بجوار عدد قليل من الجينات الشائعة بما في ذلك Talin و Rab8a. سينصب تركيز هذا التقرير في الغالب على جينات Tm الثدييات والأشكال الإسوية. يظهر تمثيل تخطيطي لتنظيم intronexon لجينات الثدييات الأربعة في شكل 1. يتم الحفاظ على التنظيم العام للإكسونات وأنماط التضفير في جينات الثدييات بين الثدييات والطيور والبرمائيات والأسماك. تتبع الجينات في الأنواع الأبسط مبادئ مماثلة ولكنها تختلف اختلافًا جوهريًا في تفاصيل exons البديلة وعلاقتها التطورية بالجينات المحددة في الفقاريات. تم تسمية جينات Tm البشرية TPM1 و TPM2 و TPM3 و TPM4 ، ومع ذلك ، نظرًا لعدم وجود تسمية موحدة لأسماء الجينات أو الأشكال الإسوية ، تم سرد الأسماء البديلة الموثقة في الأدبيات الجدول 2.

الأشكال 2-5 تبين ، لكل جين ، تسلسل الأحماض الأمينية لكل من الإكسونات مقارنة بين الثدييات والطيور والبرمائيات والأسماك. يتم عرض تسلسل الإجماع عبر الأنواع أسفل كل exon. الميزة الأكثر لفتًا للانتباه في هذه المقارنة هي الحفظ الاستثنائي للبنية الأولية عبر أكثر من 500 مليون سنة من التطور. هذا يؤكد أن هذه البروتينات تخضع لضغط انتقائي كبير للحفاظ على تسلسل أولي دقيق. من غير المحتمل أن يعكس الاختيار المتطلبات الهيكلية للحفاظ على الملف الملفوف نظرًا لوجود عدد قليل من متطلبات التسلسل الأساسي المطلق اللازمة لإنشاء ملف ملفوف. 28 بدلاً من ذلك ، من المرجح أن يعكس الاختيار متطلبات وظيفية محددة الشكل 1 ربما تكون مدعومة بسمات هيكلية دقيقة كما تم وصفها مؤخرًا في المرجع 29 و / أو الموضع في الأخدود الرئيسي لخيوط الأكتين. 30 ، 31

ينتج تنوع التسلسل بين الأشكال الإسوية من تباعد التسلسل بين exons البديل في نفس الجين وبين نفس exons في جينات مختلفة (الشكل 6). تُظهر مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية لكل من الجينات البشرية الأربعة ، exon by exon ، أن هناك درجة عالية من التشابه التسلسلي بين الجينات على الرغم من أن هذا يختلف بين exons (الشكل 6 أ). تظهر بعض exons ، مثل 1a و 2b و 3 و 4 و 5 و 6b و 7 و 8 و 9a درجة عالية من التشابه بين الجينات بينما تُظهر exons 1b و 6a و 9c و 9d اختلافات جوهرية من المتوقع أن تساهم في الشكل الإسوي تشعب (الشكل 6 أ). يأتي أكبر مصدر لاختلاف التسلسل الأساسي من استخدام المروج البديل والربط البديل. هناك نوعان من N-termini التي تنتج عن استخدام مختلف المروجين (رسم بياني 1). يؤدي Exon 1a بالإضافة إلى exon 2a أو 2b إلى ظهور الطرف N من تروبوميوسين عالي الوزن الجزيئي (حوالي 284 aa). يتم اشتقاق الطرف N البديل من استخدام exon 1b ويؤدي إلى الأشكال الإسوية LMW الأقصر (حوالي 248 aa). بالإضافة إلى اختلاف الطول الواضح بين اختيارات N-terminus ، هناك أيضًا اختلاف كبير في التسلسل (الشكل 6 ب) بين هذه N-termini البديلة. وبالتالي فإن التشابه بين الجينات لنفس الإكسونات أكبر بكثير مما هو عليه بين الإكسونات البديلة في نفس الجين. وينظر هذا الاتجاه أيضًا إلى exons 6a مقابل 6b وأيضًا بالنسبة لـ exons C-terminal 9a و 9b و 9c و 9d. في كلتا الحالتين ، يكاد يكون من المستحيل اكتشاف أي تماثل بين exons البديل في نفس الجين (الشكل 6 ب). قدم هذا الاختلاف استراتيجية فعالة لتوليد الأجسام المضادة التي تتعرف على مجموعات فرعية معينة من الأشكال الإسوية (انظر أدناه).

حدد تحليل RT-PCR أكثر من 40 Tm من الأشكال الإسوية التي تم ترميزها بواسطة جينات الثدييات. 5 ، 32 ، 33 الدليل على وجود النصوص المكتشفة على مستوى تحليل اللطخة الشمالية أو الأكثر تفضيلاً على مستوى البروتين موجود بالفعل فقط لنصف هذه الأشكال الإسوية والأغلبية مدرجة في الجدول 2. يشار إلى الأشكال الإسوية Tm الموجودة بالاشتراك مع الجهاز الانقباضي لخلايا العضلات الهيكلية والقلبية والملساء باسم Tms العضلية بينما يشار إلى الأشكال المرتبطة بالهيكل الخلوي لجميع الخلايا باسم الأشكال الإسوية للهيكل الخلوي (غالبًا ما يشار إليها ، بشكل غير صحيح ، على أنها غير عضلية الأشكال الإسوية في الأدب).

يشار إلى TPM1 و TPM2 أيضًا باسم الجين αTm و βTm على التوالي 34 (رسم بياني 1). تم العثور على جين TPM1 بواسطة RT-PCR لترميز 20 شكلًا إسويًا في أنسجة الفئران البالغة والخلايا المستنبتة. من بين الأشكال الإسوية المشفرة αTm المعبر عنها في العضلات المخططة ، و TPM1κ المكتشف حديثًا في قلوب الإنسان ، 35 الأشكال الإسوية المخصبة بشكل تفضيلي في الجهاز العصبي المركزي ، TmBr1 و TmBr2 و TmBr3 و Tm2 و Tm3 و Tm5a و Tm5b. تم اكتشاف الرموز الجينية TPM2 للعضلة الهيكلية βTm الإسوي ، وحتى الآن ، تم اكتشاف شكل إسوي هيكلي خلوي واحد فقط ، Tm1. تم العثور على Tm1 أنه يتم تنظيمه بشكل كبير في الخلايا المحولة ، وقد تبين أن استعادة التعبير Tm1 يعكس التحول في الخلايا المحولة ras. 36 رموز الجينات TPM3 للشكل الإسوي للعضلات الهيكلية بطيئة النتوء (αسTm) وما لا يقل عن 9 أشكال إسوية للهيكل الخلوي LMW يشار إليها باسم Tm5NM1 إلى Tm5NM11. 33 ، 37-39 الأشكال الإسوية NM3 و NM6 متطابقة على مستوى البروتين ولكن لها 3′UTRs فريدة من نوعها ، والأمر نفسه ينطبق على الأشكال الإسوية NM5 و NM11 (رسم بياني 1). يوجد جين TPM4 40 ، 41 رمزًا للشكل الإسوي للهيكل الخلوي Tm4 و HMW Tm4 الموجود في العديد من الأنواع ولكن ليس القوارض. 42

تعديلات ما بعد الترجمة.

حتى الآن ، تعد التعديلات اللاحقة للترجمة على نظام Tms إلى حد كبير مجال بحث غير مستكشَف. أكثر أشكال التعديلات اللاحقة للترجمة في الأدبيات التي تم الإبلاغ عنها هي NH2- الأستلة الطرفية والفسفرة على الرغم من أنه تم توثيق دليل على وجود نيتروزيل S و ثاني كبريتيد متشابك Tm.

لقد ثبت أن الأسيتيل يعزز بشكل كبير تقارب Tm للأكتين. Tm للهيكل العظمي غير الأسيتيلي غير قادر على ربط الأكتين في غياب التروبونين 43 ، 44 والعضلة الملساء ألفا غير الأسيتيل Tm لديها ألفة أضعف بكثير للأكتين من الشكل الأسيتيل. 45 بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الأسيتيل يزيد من التفاعلات من طرف إلى طرف بين ثنائيات Tm 9 و 44 و 46 وفي شيزوساكارومايس بومب لتعزيز قدرة Tm بشكل كبير على تنظيم نشاط الميوسين. 47 على الأقل في الخميرة ، لوحظ فصل مكاني متميز لخيوط الأكتين المحتوية على الأسيتيل وغير الأسيتيل التي تحتوي على Tm مما يشير إلى إمكانية أن أشكالًا مختلفة من Tm يمكن أن تنظم ميوسينات معينة. 17

تم العثور على فسفرة Tm في كل من عضلات القلب والهيكل العظمي للعديد من الأنواع المختلفة. 48-54 لقد ثبت أن فسفرة Tm تعزز قدرة Tm على تكوين تفاعلات من الرأس إلى الذيل وتعزيز تنشيط myosin Mg 2+ ATPase. 55 ، 56 تم أيضًا توثيق فسفرة Tms للهيكل الخلوي وافتراض أنه ضروري لإعادة تشكيل الهيكل الخلوي أكتين. 57 ، 58

أخيرًا ، تبين أن الخلايا البطانية المعرضة لتدفق القص تحتوي على أكثر من 12 بروتينًا زاد بشكل كبير من ارتباط النيتروز S فيما بينها Tm في Cys 170 الموجود في شكل كاره للماء. 59 يقترح المؤلفون أن مثل هذا التعديل قد يسمح بإعادة التشكيل مع الحفاظ على سلامة الخلايا البطانية في ظل ظروف التدفق.

تقييم خصوصية الأجسام المضادة لـ Tm.

يتم بيع العديد من الأجسام المضادة لـ Tm المتاحة تجارياً بأقل قدر من المعلومات المتعلقة بالمولد الضد المستخدم لرفع الجسم المضاد وبالتالي خصوصية الشكل الإسوي. هذا يحد بشكل كبير من استخدامها وفي بعض الحالات يؤدي إلى الارتباك في الأدبيات. وصفنا سابقًا توصيف الأجسام المضادة لـ 10 Tm. 60 هنا ، أبلغنا عن 9 أجسام مضادة إضافية Tm. الجدول 3 هي قائمة شاملة لجميع الأجسام المضادة لـ Tm التي وصفناها على نطاق واسع جنبًا إلى جنب مع خصوصية الشكل الإسوي والمراجع المنشورة والتوافر التجاري. تم إنشاء غالبية الأجسام المضادة باستخدام الببتيدات المقابلة لجزء أو كل exon معين. هناك استثناءات حيث تم تصنيع الأجسام المضادة الأولية باستخدام تروبوميوسين الأنسجة الكاملة ، على سبيل المثال قوانص الدجاج ، ولم يتم تحديد الحواتم بعد. شكل 1 يُظهر اسم الجسم المضاد الموجود أسفل exon الذي يشفر الحاتمة ويظهر الببتيد المستخدم كمناعة لهذه الأجسام المضادة في الأشكال 2-5. تشير المقارنة بين تسلسل الببتيد الذي يحتوي على الأنواع المتقاطعة الحاتمة إلى احتمال أن تكون العديد من هذه الأجسام المضادة تفاعلية عبر العديد من الأنظمة النموذجية (تين. 2-5).

تم إجراء التقييم الأولي لخصوصية الأجسام المضادة عن طريق تحليل لطخة جل البروتين على ألواح بروتينات Tm المؤتلفة. cDNAs المقابلة للجرذ (Tm1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5a ، 5b ، Br1 ، Br2 ، Br3 و Tm5NM1) والإنسان (Tm1 ، 2 ، 3 ، 4 ، NM1 ، NM2 ، NM4 ، NM5 ، NM6 ، NM7) تم استنساخها في نظام تعبير pPROEX HT بدائية النواة أو pET وتم إجراء تحريض البروتين كما هو موضح في المواد والطرق.

تم إنشاء ما مجموعه 13 جسمًا مضادًا للكشف عن الأشكال الإسوية لـ Tm من TPM1 و 2 من الجينات مع تكوين ثلاثة من هذه الأجسام المضادة لـ Tm على شكل كل من polyclonals و monoclonals. تم تعيين حلقمة الجسم المضاد TM311 المتاح تجاريًا إلى exon 1a من جين TPM1 ، وبالتالي فإنه يكتشف الشكل الإسوي للعضلة المخططة بالإضافة إلى Tms 2 و 3 و 6 و Br1 و Tm1 بالإضافة إلى الشكل الإسوي العضلي المخطط من جين TPM2 (تين. 1 و 7 أ). تم الكشف عن الأشكال الإسوية التي تحتوي على exon 1b (Tm5a و 5b و Br2 و Br3) باستخدام الجسم المضاد α / 1b (الشكل 7 ب). تشتمل الأجسام المضادة التي تحتوي على حواتم موجهة إلى إكسون الطرفية C للجين αTm على الجسم المضاد α / 9b الخاص بـ TmBr2 (الشكل 7 ج) و α / 9c (استنساخ # 554) الذي يكتشف بشكل تفضيلي TmBr1 و TmBr3 (الشكل 7 د). من الجدير بالذكر أن α / 9c لا ترى Tm5NM4 الذي يحتوي على exon 9c من جين TPM3. يتميز الجسم المضاد α / 9d المرتفع مقابل الببتيد الموجه إلى exon 9d بأكمله من جين TPM1 بدرجة عالية من الخصوصية لـ Tm1 و 2 و 3 و 5 أ و 5 ب ، ونتوقع ، Tm6 (رسم بياني 1). على الرغم من أن exons 9d من جينات TPM1 و 3 و 4 لديها درجة عالية من التشابه ، فإن الجسم المضاد α / 9d لا يظهر تفاعلًا متصالبًا مع Tm4 من جين TPM4 ولا Tm5NM1 و Tm5NM2 من جين TPM3 (الشكل 7E). تم رفع الأجسام المضادة لـ CG1 و CGβ6 في الأصل ضد قوانص الدجاج Tm. 61 CG1 لديه تفاعل قوي لكل من الفئران والبشر Tm1 ويكتشف أيضًا Tm4 (الشكل 7F). تم تعيين حاتمة الجسم المضاد CGβ6 إلى الطرف C للطرف البشري Tm2 و Tm3 62 وكما هو متوقع فإنه يكتشف كل من الإنسان والفأر Tm2 و Tm3 ويظهر أيضًا تفاعل ضعيف مع Tm5a (الشكل 7G).

تم استخدام متواليات الببتيد المقابلة للإكسونات الطرفية C المقسمة بدلاً من جين TPM3 (exons 9a و 9c و 9d) لتوليد الأجسام المضادة γ / 9a و γ / 9c و γ / 9d (الجدول 3). تم توثيق توصيف هذه الأجسام المضادة التي تربى في الأغنام سابقًا في المرجع 60. نحن هنا نقدم تقريرًا عن الأجسام المضادة التكميلية التي تم إنشاؤها باستخدام متواليات الببتيد المتطابقة ولكن يتم رفعها على هيئة الفئران أحادية النسيلة. تظهر هذه الأجسام المضادة الثلاثة خصوصية الشكل الإسوي المتوقعة (الشكل 8 أ-ج). يُظهر الجسم المضاد γ / 9d تفاعلًا متصالبًا طفيفًا مع Tm1 و 2 و 3 و 5 أ و 5 ب (الشكل 8 ج). يظهر أن الجسم المضاد LC1 يتمتع بدرجة عالية من الخصوصية للأشكال الإسوية البشرية Tm5NM1 و NM2 و NM4 و 7 مع عدم وجود تفاعل متقاطع مع الماوس Tm5NM1 (الشكل 8 د). على الرغم من أن حاتمة هذا الجسم المضاد لم يتم تعيينها بعد ، فإن بياناتنا التي أبلغ عنها Sung et al. تشير بقوة إلى أنها موجودة في أول عدد قليل من الأحماض الأمينية الطرفية N من exon البشري 1b من جين TPM3. توضح محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية أن الاختلاف الوحيد في الأحماض الأمينية بين الفأر / الجرذ والتسلسل البشري هو الحمض الأميني الرابع ، أيزوليوسين في الإنسان والسيرين في الفئران والجرذان (الشكل 4). نتوقع أن تكون هذه البقايا في حلقة LC1. يكتشف الجسم المضاد CG3 مع حاتمته المعينة للأحماض الأمينية exon 1b 29-44 64 جميع منتجات الهيكل الخلوي من هذا الجين البشري والفأر (الشكل 8E). وقد وجد أيضًا أنه يكتشف الشكل الإسوي للعضلة المخططة من هذا الجين عبر التفاعل المتقاطع مع TPM3 exons 1a أو 2b. 65

الأجسام المضادة المعروفة باكتشاف الشكل الإسوي للهيكل الخلوي Tm4 من جين TPM4 هي δ / 1b و WD4 / 9d و LC24. تم رفع الجسم المضاد δ / 1b مقابل آخر 19 من الأحماض الأمينية من exon 1b من جين TPM4. يظهر هذا الجسم المضاد للكشف عن كل من الجرذان والبشر Tm4 ولا يظهر أي تفاعل متصالب مع exon 1b الآخر الذي يحتوي على الأشكال الإسوية من جينات Tm الأخرى (Tm5a ، 5b ، Br2 ، Br3 ، NM1 ، NM2 ، NM4 ، NM7) (الشكل 9 أ). ومع ذلك ، فإنه يظهر تفاعلًا ضعيفًا مع Tm1 البشري. تم سابقًا تمييز WD4 / 9d الذي تم إنشاؤه في الأرانب باستخدام تسلسل الأحماض الأمينية الجزئية من exon 9d من جين TPM4. 60 يكتشف Tm4 ولكنه يتفاعل مع Tm1 من الجين βTm (عند التعرض الأطول ، البيانات غير معروضة) ، وكذلك Tm5NM1 و Tm5NM2 من الجين γTm (الشكل 9 ب). تم إنشاء LC24 ضد Tm4 البشري الناتج عن البكتيريا مع استخدام الطرف C فقط. 62 يكتشف هذا الجسم المضاد كلاً من الفئران و Tm4 البشري ولكنه يتفاعل أيضًا مع Tm1 من جين TPM2 (الشكل 9 ج).

استخدام الأجسام المضادة لـ Tm لتحديد ملامح التعبير الإسوي لـ Tm في خطوط الخلايا وأنسجة الماوس.

يتم تنظيم الذخيرة الانتقائية للتعبير الإسوي Tm ، بما في ذلك عدد ونوع الأشكال الإسوية المعبر عنها في أنواع مختلفة من الخلايا ، بشكل صارم من خلال آليات غير مفهومة تمامًا حتى الآن. تمت مراجعة ملفات تعريف التعبير الإسوي Tm في أنواع الخلايا المختلفة مسبقًا في المرجع 6. هنا نُبلغ عن استخدام الأجسام المضادة لـ Tm الموصوفة أعلاه لتشكيل تعبير الشكل الإسوي في ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا من ثلاثة أنواع مختلفة من الثدييات ، الإنسان والفأر والجرذ ، وكذلك تقييم خصوصية هذه الأدوات. على هلام SDS PAGE ، يكون للأشكال الإسوية HMW Tm وزن جزيئي ظاهر من 34 إلى 40 كيلو دالتون والأشكال الإسوية LMW من 28 إلى 33 كيلو دالتون. لا يمكن التنبؤ بترحيل Tms في المواد الهلامية SDS بناءً على MW وفي تجربتنا ، يتم تحقيق الدقة المثلى للأشكال الإسوية Tm بشكل أفضل على المواد الهلامية SDS-PAGE مع تركيز منخفض من بيساكريلاميد (12.5٪ أكريلاميد و 0.1٪ بيساكريلاميد). 66 تعمل الأجسام المضادة المعروفة باكتشاف الأشكال الإسوية من جينات TPM1 و TPM2 بما في ذلك TM311 و α / 9d و 1 و CGβ6 جميعها بشكل جيد على محللات البروتين الكلية المعزولة من خطوط الخلايا (الشكل 10). الملاحظة الأولية التي تم إجراؤها على لطخات البروتين الهلامية هي الاختلافات في ملامح الأشكال الإسوية والكميات الكمية التي تعبر عنها خطوط الخلايا الثلاثة. يعبر كل من خطوط الخلايا البشرية والفأرية عن Tm1 كما تم اكتشافه مع الجسم المضاد TM311 و α / 9d و CG1 (الشكل 10 أ ، ج ، د). لا تظهر خلايا الفئران B35 أي دليل على تعبير Tm1 أو Tm3 بينما تم اكتشاف Tm2 و Tm3 في كل من خلايا الإنسان والفأر وفقط Tm2 في خلايا الفئران B35 (الشكل 10 أ و هـ). يكتشف الجسم المضاد α / 1b مستويات منخفضة جدًا من Tm5a و Tm5b ولكن هناك أيضًا تفاعل مع نطاقات غير معروفة (الشكل 10 ب). كانت الأجسام المضادة الموجهة إلى الأشكال الإسوية Tm المخصبة في أنسجة المخ (TmBr1 و Br2 و Br3) والعضلات الملساء (Tm6) كما هو متوقع غائبة عن خطوط الخلايا هذه (البيانات غير معروضة).

تم العثور على جميع الأجسام المضادة TPM3 التي تم اختبارها على خطوط الخلايا للكشف عن الأشكال الإسوية LMW للهيكل الخلوي المتوقع التي تم ترميزها بواسطة الجين (الشكل 11). تم العثور على وفرة من الأشكال الإسوية المكتشفة مع الجسم المضاد γ / 9a منخفضًا حيث تم استخدام وقت التعرض الطويل جدًا لتوليد البقعة الموضحة في الشكل 11 أ. كما تم الكشف عن بعض العصابات الإضافية غير المعروفة. يكتشف الجسم المضاد γ / 9d 30 كيلو دالتون المتوقعة المقابلة لـ Tm5NM1 / NM2 في جميع خطوط الخلايا (الشكل 11 ب). كما هو متوقع ، يكتشف الجسم المضاد LC1 ، مثل CG3 ، نطاقًا في جميع خطوط الخلايا البشرية حيث أن حلقه موجود في exon 1b ، ولكن CG3 يرى أيضًا نفس النطاق في الماوس والفأر على عكس LC1 الذي يخص الإنسان (الشكل 11 ج). تم العثور على الأشكال الإسوية المحتوية على exon 9c التي تم تحديدها مع الجسم المضاد γ / 9c لم يتم اكتشافها بواسطة نشاف هلام البروتين (البيانات غير معروضة). تم اكتشاف الأشكال الإسفنجية المحتوية على إكسون 9 ج بشكل أساسي في خلايا الجهاز العصبي المركزي. 67 ، 68

يظهر تحليل التعبير عن الشكل الإسوي للهيكل الخلوي Tm4 مع الأجسام المضادة δ / 1b و WD4 / 9d و LC24 في الشكل 12. δ / 1b خاص جدًا بـ Tm4 (الشكل 9 أ). في المقابل ، يكتشف WD4 / 9d بالإضافة إلى Tm4 شكل إسوي HMW يُتوقع أن يكون Tm1 (الشكل 12 ب) وهي وفيرة نسبيًا في خلايا الإنسان والفأر ، كما يتضح من الأجسام المضادة TM311 و α / 9d (الشكل 10 أ و ج). من المثير للدهشة أن الجسم المضاد LC24 يكتشف Tm4 في الخلايا البشرية والفئران ولكن ليس في الخلايا الليفية للفأر. تم توضيح مزيد من التأكيد لفشل هذا الجسم المضاد في اكتشاف الشكل الإسوي للهيكل الخلوي للماوس Tm4 في خلايا الفئران الأخرى لاحقًا في هذا التقرير.

تم إنشاء lysates البروتين الكلي من كل من أنسجة الفئران والجرذان وتم فحصها باستخدام الأجسام المضادة Tm الموصوفة أعلاه. على الرغم من أن الأنسجة الفردية تتكون من العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، يمكن تقييم التعبير عن الأشكال الإسوية الرئيسية لـ Tm عن طريق تحليل لطخة هلام البروتين. يكتشف الجسم المضاد α / 1b نطاقًا بارزًا يبلغ حوالي 30 كيلو دالتون في الدماغ والكبد والرئة والكلى والطحال (الشكل 13 أ). نظرًا لأن الأشكال الإسوية المكتشفة بواسطة هذا الجسم المضاد لها أوزان جزيئية متشابهة أو متشابهة ، فمن الصعب التمييز بين ما إذا كانت تتوافق مع Tm5a أو 5b أو Br3. تُظهر مقارنة ملف تعريف التعبير Tm الذي تم إنشاؤه باستخدام الجسم المضاد α / 9d أن Tm5a / 5b أكثر وفرة في الكلى والكبد والرئة والطحال بينما لا يتم اكتشاف هذه الأشكال الإسوية في دماغ البالغين عند مستوى حساسية بروتين الهلام النشاف (الشكل 13 ج). ومن ثم ، يمكننا أن نستنتج أن الجسم المضاد α / 1b يكتشف TmBr3 في الدماغ. TmBr3 هو أحد الأشكال الإسوية الرئيسية المعبر عنها في الخلايا العصبية الناضجة. 69 - 71

يتم رفع الجسم المضاد أحادي النسيلة α / 2a مقابل الببتيد الذي يتوافق مع exon 2a الفريد الموجود فقط في جين TPM1. يحتوي Exon 2a على أشكال الإسفنج هي Tmsmα المعروف أيضًا باسم Tm6 بالإضافة إلى hTmsmα-1 و hTmskα1-1 المحدد في الأنسجة البشرية. 42 يتم إثراء Tmsmα (Tm6) و hTmsmα-1 في العضلات الملساء مثل المشيمة والرحم والمعدة (الشكل 13 ب). يتم إثراء التعبير عن exon 2a المحتوي على شكل (أشكال) إسوي بدرجة عالية في معدة الفأر (الشكل 13 ب). لاحظ أيضًا الحركة الأبطأ للإكسون 2 أ المحتوي على شكل إسوي في العضلات الهيكلية ربما Tmskα1-1 (تين. 1 و 13 ب).

تم رفع الجسم المضاد أحادي النسيلة α / 9d مقابل ببتيد يتوافق مع exon 9d بأكمله من جين TPM1 مع التعرف المتوقع على الأشكال الإسوية Tm1 و 2 و 3 و 5 أ و 5 ب و 6. على لوحة من أنسجة الفئران ، يظهر التعبير عن HMW تكون الأشكال الإسوية Tm1 / 6 عالية التخصيب في الكلى والرئة والطحال والمعدة (الشكل 13 ج). تم الكشف عن مستويات كبيرة من Tm2 في الكلى والطحال والمعدة وعند التعرض لطخة أطول (البيانات غير معروضة) تم اكتشاف Tm2 أيضًا في الرئة. اقتصر التعبير عن Tm3 على عينة المعدة. تم إثراء الأشكال الإسوية LMW Tm5a / 5b في الكلى والرئة والطحال وبدرجة أقل في الدماغ والكبد والمعدة ، وتم رؤيتها فقط عند التعرض لفترة أطول (البيانات غير معروضة).

الجسم المضاد CG1 ، كما هو موضح في الشكل 7F لاكتشاف Tm1 ولكن أيضًا يتفاعل مع Tm4 ، يكتشف نطاق HMW بارز في العضلات الهيكلية على الأرجح يتوافق مع βTm (الشكل 13 د). في الكلى والرئة والطحال ، من المرجح أن يتوافق نطاق HMW البارز مع Tm1 حيث يتم التعبير عن Tm1 المكتشف مع الجسم المضاد α / 9d بشكل كبير في هذه الأنسجة (الشكل 13 د مقارنة ب ج). يُظهر الدماغ والقلب أيضًا نطاقًا خافتًا من HMW ويعبر كل من الأنسجة أيضًا عن Tm1 ولكن بمستويات أقل نسبيًا (الشكل 13 د مقارنة ب ج). تم الكشف عن عصابة LMW أيضًا في الكلى والرئة والطحال (الشكل 13 د). قد يتوافق هذا مع Tm4 ، كما هو موضح لاحقًا ، تعبر هذه الأنسجة عن مستويات عالية نسبيًا من Tm4 المكتشفة مع اثنين من الأجسام المضادة (الشكل 15 أ و ج).

هناك أربعة أجسام مضادة مصممة للتعرف على الأشكال الإسوية لـ Tm من جين TPM3. تكتشف الأجسام المضادة أحادية النسيلة γ / 9a و γ / 9c و γ / 9d الأشكال الإسوية التي تحتوي على exons C 9a و 9 c و 9 d على التوالي. يكتشف الجسم المضاد CG3 جميع الأشكال الإسوية المحتوية على exon 1b. في القلب والعضلات الهيكلية ، يكتشف الجسم المضاد γ / 9a نطاقًا بارزًا من 36 كيلو دالتون يتوافق مع exon 9a الذي يحتوي على أشكال عضلية من جينات TPM1 و 2 و 3 مع الكبد والرئة والمعدة التي تعبر عن مستويات منخفضة نسبيًا من الشكل الإسوي HMW (الشكل 14 أ). في الدماغ والرئة والطحال والمعدة ، قد يتوافق LMW ، 30 كيلو دالتون ، الهيكل الخلوي exon 9a المحتوي على الأشكال الإسوية ، إما Tm5NM5 / 11 أو NM6 / 3. تظهر المعدة ضعفًا عند 30 كيلو دالتون والذي قد يتوافق مع NM8 و / أو 9. ينتج Tm5NM8 و 9 من تضفير exon 9a إلى 9c وينتج عنه امتداد 5 أحماض أمينية إضافية مشتقة من exon 9c. 33 حتى الآن باءت محاولات تكوين جسم مضاد لهذا التسلسل بالفشل. يكتشف الجسم المضاد γ / 9c نطاق 30 كيلو دالتون في الدماغ ، إما NM4 أو 7 ويتفاعل مع نطاق HMW غير معروف في العضلات والمعدة (الشكل 14 ب). يكتشف الجسم المضاد γ / 9d الذي يتفاعل بشكل تفضيلي مع NM1 و NM2 نطاق 30 كيلو دالتون في الدماغ والكلى والكبد والرئة والطحال (الشكل 14 ج) وعند التعرض الطويل ، يمكن أيضًا اكتشاف NM1 / NM2 في القلب والعضلات الهيكلية والمعدة (البيانات غير معروضة). يكتشف الجسم المضاد لـ CG3 جميع LMW الهيكل الخلوي exon 1b الذي يحتوي على أشكال إسوية من جين TPM3 ويظهر نطاق 30 كيلو دالتون في جميع أنسجة الفأر (الشكل 14 د) باستثناء عضلة الساق المستخدمة في هذه اللوحة ، حتى عند التعرض لفترة أطول (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، فإن الجسم المضاد CG3 يكتشف نطاق 34 كيلو دالتون في خارج العين والنعل ، يتوافق مع αسTM من جين TPM3. 65

يعتبر جين TPM4 مع جين TPM2 أقل الجينات التي يتم تقطيعها بدلاً من ذلك ، كل منها معروف بتشفير اثنين فقط من الأشكال الإسوية. لقد أنشأنا جسمين مضادين مرفوعين ضد الببتيدات داخل الطرف N-terminal ، exon 1b والنهاية C-terminal ، exon 9d. على لوحة من أنسجة الفأر ، يتم التعبير عن الشكل الإسوي LMW Tm4 ، المحدد مع الجسم المضاد δ / 1b ، بكثرة في الكلى والرئة والطحال (الشكل 15 أ) ، عند التعرض لطخة أطول ، يمكن رؤية شريط في العضلات والمعدة (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، هناك وجود نطاق MW أعلى قليلاً عند مستويات كبيرة في الكبد. من أجل تأكيد أن هذا النطاق غير المعروف يتوافق مع Tm ، استفدنا من حقيقة أن Tm هو بروتين مستقر للحرارة. بعد إثراء Tm بتسخين الأنسجة إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (انظر المواد والطرق) وجدنا أن عصابات HMW التي شوهدت في الكلى والكبد كانت غائبة الآن (الشكل 15 ب). نستنتج أن δ / 1b يكتشف البروتينات غير Tm في أنسجة الفأر. يكتشف WD4 / 9d في الغالب الشكل الإسوي LMW Tm4 في جميع الأنسجة التي تم فحصها حتى في الدماغ والعضلات عند التعرض الطويل (غير موضح) (الشكل 15 ج). تم عرض LC24 للكشف عن كل من البروتينات المؤتلفة للبشر والفئران Tm1 و Tm4 (الشكل 9 ب) ومع ذلك ، فقد فشلت في اكتشاف Tm4 في محللات بروتين الفأر (الشكل 12 ج). وبالمثل ، في حالة أنسجة الفأر ، لا يكتشف LC24 الشكل الإسوي للهيكل الخلوي Tm4 LMW (الشكل 15 د). ومع ذلك ، يُرى نطاق HMW الذي نتوقع أن يكون في الماوس Tm بينما في الكبد والرئة والطحال قد يتوافق مع Tm1 (الشكل 15 د). بشكل مفاجئ ، في أنسجة الفئران ، يكتشف الجسم المضاد LC24 بشكل أساسي Tm4 و HMW الشكل الإسوي في العضلات (الشكل 15E).

تم استخدام بعض الأجسام المضادة لـ Tm الموصوفة أعلاه بنجاح لأداء التهابات المناعة. وتشمل هذه LC1 و WSα / 9c ، و 16 مضادًا للأغنام α / 2a و CG1 72 و TM311. 73

باختصار ، أحد القيود الرئيسية في تقييم تركيبة الشكل الإسوي Tm في أي من خطوط الخلايا أو الأنسجة هو التشابه في الأوزان الجزيئية الظاهرة عند إجراء الفصل الكهربائي للهلام 1-D. قد يسمح الرحلان الكهربي ثنائي الأبعاد بتحديد الأشكال الإسوية LMW الإضافية حيث أن بعضها يعرض قيم pI مميزة (الجدول 4). في بعض الحالات ، سيكون تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي هو أفضل منهجية لتقييم وجود وكمية الأشكال الإسوية المختلفة لـ Tm ، وإن كان ذلك على مستوى mRNA.

تميز الأشكال الإسوية Tm مجموعات خيوط أكتين متميزة.

تم حتى الآن توثيق الفرز الخلوي المتميز داخل الخلايا للأشكال الإسوية المختلفة لـ Tm في أنظمة نماذج خلوية مختلفة في المختبر وفي الجسم الحي (تمت مراجعته في المراجع 1 و 7). يشير هذا الفرز الملحوظ للأشكال الإسوية Tm إلى وجود مجموعات متميزة من خيوط الأكتين ، والتي تتميز بالأشكال الإسوية Tm ، مما يؤثر على ديناميكيات وخصائص تنظيم الخيوط. من أجل مزيد من التقييم لأداء الأجسام المضادة لـ Tm الموصوفة أعلاه ، تم إجراء تلطيخ التألق المناعي على سطرين من الخلايا ، الخلايا الطبيعية والورم ، والخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأر وخلايا الورم الأرومي العصبي B35 ، على التوالي. يعتمد اختيار الخلايا على حقيقة أن هذه الخلايا (1) تظهر في حالة الخلايا الليفية الأولية للفأر ، وهي عبارة عن هيكل خلوي أكتين منظم جيدًا ، 60 (2) تعرض هياكل محددة مثل الغشاء المتطاير والجزء الخيطي ، (3) وفقًا لـ الأشكال 10-12 التعبير عن الأشكال الإسوية Tm المختلفة و (4) تمثل نوعين من الخلايا شائعة الاستخدام. على مستوى دقة مجهر epifluorescence ، كان التوطين الواضح لـ Tm لألياف إجهاد الأكتين أكثر وضوحًا في الخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأر الطبيعي مقارنة بخلايا الورم الأرومي العصبي B35 (قارن تين. 16-18 إلى 19-21). تتكون الاختلافات الدقيقة بين الأجسام المضادة لـ Tm بشكل أساسي حول ما إذا كان تلطيخ Tms يمتد إلى محيط الخلية وشدة التلوين ، مما يعكس مستويات التعبير. Comparison of the staining patterns of the TM311 (Tm1, 2, 3, 6, Br1) with the α/1b (Tm5a, 5b, Br2, Br3) antibodies demonstrates the diminished staining of TM311 at the periphery of the cell whereas the α/1b extends and is enriched at the cell periphery, seen in both the mouse fibroblasts (Fig. 16K مقارنة ب إل, arrows) and rat B35 cells (Fig. 19K مقارنة ب إل, arrows). This observed staining strongly suggests that Tm5a/5b are peripherally enriched isoforms and this correlates with the apical enrichment of these isoforms in epithelial cells. 74 Similarly, the α/9d antibody which detects the HMW Tms, 1, 2, 3, 6 and the LMW Tm5a, 5b is also seen to extend to the cell periphery in mouse fibroblasts (Fig. 16M, arrow) and B35 cells (Fig. 19M and arrow) although not as dramatically as for the α/1b antibody. The CG1 (Tm1) antibody detects prominent stress fibers in the mouse fibroblasts (Fig. 16D and N, arrow) and staining is absent in the B35 cells (Fig. 19N). The CGβ6 (Tm2, 3) antibody is seen to detect stress fibers with a striated appearance most prominent in the B35 cells (Figs. 16E and 19E, see inset). Both the γ/9d (Tm5NM1, NM2) and CG3 (all TPM3 cytoskeletal products) antibodies detect stress fibers and no enrichment of staining is seen at the cell periphery (Fig. 17E, F and 20E and F, arrows). The WD4/9d antibody identifies stress fibers best seen in the mouse fibroblasts as compared to the B35 cells (Fig. 18E مقارنة ب 21E) and staining is reduced at the cell periphery, most apparent in the mouse fibroblasts (Fig. 18E, arrow). Finally, the LC24 antibody exhibits stress fiber staining in the human immortal fibroblasts and B35 cells (Figs. 18F and 21F) while no staining was detected in the mouse fibroblast cells (data not shown). There is a significant difference in the pattern of LC24 staining seen between the human immortal cells and the B35 cells, with a more even intensity of staining seen in the immortal cells while in the B35 cells the staining is significantly diminished at the cell periphery (Fig. 18F compare to 21F, arrows).

In conclusion, at the level of resolution of an epifluorescence microscope the major differences among the various Tm antibody staining patterns was their enrichment at the cell periphery. In addition, subtle differences among the different cell types, normal and immortal fibroblasts, were observed.

Subcellular localization of individually tagged Tm isoforms.

One of the major drawbacks of using the Tm antibodies to evaluate the subcellular localization of Tms is that the majority of antibodies do detect several isoforms. In order to investigate the intracellular localization of individual Tm isoforms, specific isoforms have been cloned into plasmids containing YFP or GFP (yellow or green fluorescence protein) or hemagglutinin (HA) tags (الجدول 5). Surprisingly, the addition of a 27 kDa YFP or GFP protein to the N-terminal end appears not to interfere with the head-to-tail association of the Tm dimers, as these tagged proteins are quite capable of forming polymer like structures that colocalize with actin filaments. 75 In addition, YFP.Tm5NM1 has been shown to have a direct role in cell migration as its expression in Tm5NM1 null cells rescued the phenotype further demonstrating the functionality of tagged Tms. 76 The concern encountered with transfection studies is the fidelity of sorting, as overexpression of these tagged isoforms may lead to the saturation of pools and hence inappropriate subcellular localization. However, recent studies in U2OS cells have shown remarkable fidelity of sorting of these tagged Tms. 21

Overexpression and targeted gene siRNA knockdown in vitro based methods to study Tm isoform specific function.

In order to evaluate the biological function of the different Tm isoforms, overexpression (الجدول 6) and siRNA knockdown (الجدول 7) methodology has been employed. The overexpression studies have shed light on the importance of Tm isoforms in defining the organizational properties and molecular composition of actin filaments ultimately influencing the overall morphology of cells. 16 , 21 , 77 – 80 In addition, overexpression studies complemented with targeted gene siRNA knockdown experiments have demonstrated the importance of specific Tm isoforms in regulating the structure and dynamic properties of focal adhesions. 76 , 81 Finally, recent siRNA knockdown experiments have played an important role in establishing the nonredundant roles of Tm isoforms in stress fiber assembly. 21

The development of mouse models to study tropomyosin.

The primary objective for the generation of Tm gene modified mice has been to study the disease process of various human myopathies. Mutations in both the TPM2 and TPM3 genes are associated with diseases of skeletal muscle such as nemaline myopathy, distal arthrogryposis and most recently “cap” disease. TPM1 gene mutations have been linked to familial hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy (reviewed in refs. 82 – 84 ). The current mouse models that recapitulated these human myopathies are listed in الجدول 8. It is noteworthy to mention that although the Tm mutations linked to human diseases are known to exhibit clinical abnormalities mostly restricted to the heart and skeletal muscle, these mutations are present in exons shared by numerous other Tm isoforms (see Tables 2 and 3). 85 All known cardiomyopathies carry mutations in Tm isoforms specific to the central nervous system including TmBr1, TmBr2 and TmBr3. In the skeletal muscle myopathies, mutations in the TPM3 gene occur in exons 3, 5 and 8 which are common to all the Tm isoforms (Tm5NM1-11) encoded by this gene. Hence, it is possible that these patients may also display uncharacterized pathologies in organs other than skeletal muscle or the heart. Unfortunately, in the case of the mouse models, it is not possible to address the impact that these Tm mutations may have in other organs since the altered Tms are expressed in a tissue-specific manner. The human skeletal muscle actin or the cardiac specific α-myosin heavy chain promoters were used to generate these transgenic mice.

Various other genetically modified mouse models have been generated primarily to dissect the functional differences among the isoforms and are listed in الجدول 9. The knockout mouse models reveal that the Tm genes are essential for life as deletion of the TPM1, 2 and 3 genes are embryonic lethal and offer further evidence for the non-redundant nature of the mammalian Tm genes. 84 , 86 – 89 To date, two transgenic mouse models exist that have overexpression of the cytoskeletal Tm isoforms, Tm3 and Tm5NM1, in major organs as the transgene is driven by the human β-actin promoter. 90 The Tm3 transgenic mice demonstrate dystrophic features perhaps due to increase sensitivity to contractile-induced stress. 65 , 91 In the case of the Tm5NM1/NM2 knockout mice, lack of these isoforms leads to T-tubule dysmorphology and altered skeletal muscle function. 92 Both the Tm3 and Tm5NM1 transgenics together with the complementary Tm5NM1 knockout mice have become valuable resources for the isolation of primary embryonic cells such as neuronal and fibroblast cells. Primary cortical neurons isolated from these mice have revealed the importance of Tm isoforms in the development and maintenance of neuronal morphogenesis, previously only inferred from subcellular localization studies. 16 , 80 , 93


نص العرض التقديمي

4 The Tissue Level of Organization

An Introduction to Tissues Tissues Structures with discrete structural and functional properties Tissues in combination form organs, such as the heart or liver Organs can be grouped into 11 organ systems

4-1 Four Types of Tissue • Tissue • Are collections of cells and cell products that perform specific, limited functions • Four types of tissue • Epithelial tissue • Connective tissue • Muscle tissue • Neural tissue

4-1 Four Types of Tissue • Epithelial Tissue • Covers exposed surfaces • Lines internal passageways • Forms glands • Connective Tissue • Fills internal spaces • Supports other tissues • Transports materials • Stores energy

4-1 Four Types of Tissue • Muscle Tissue • Specialized for contraction • Skeletal muscle, heart muscle, and walls of hollow organs • Neural Tissue • Carries electrical signals from one part of the body to another

4-2 Epithelial Tissue • Epithelia • Layers of cells covering internal or external surfaces • Glands • Structures that produce secretions

4-2 Epithelial Tissue • Characteristics of Epithelia • Cellularity (cell junctions) • Polarity (apical and basal surfaces) • Attachment (basement membrane or basal lamina) • Avascularity • Regeneration

Figure 4-1 The Polarity of Epithelial Cells Cilia Microvilli Apicalsurface Golgiapparatus Nucleus Mitochondria Basement membrane Basolateralsurfaces

4-2 Epithelial Tissue • Functions of Epithelial Tissue • Provide Physical Protection • Control Permeability • Provide Sensation • Produce Specialized Secretions (glandular epithelium)

4-2 Epithelial Tissue • Specializations of Epithelial Cells • Move fluids over the epithelium (protection) • Move fluids through the epithelium (permeability) • Produce secretions (protection and messengers) • Polarity • Apical surfaces • Microvilli increase absorption or secretion • Cilia (ciliated epithelium) move fluid • Basolateral surfaces

4-2 Epithelial Tissue • Maintaining the Integrity of Epithelia • Intercellular connections • Attachment to the basement membrane • Epithelial maintenance and repair

4-2 Epithelial Tissue • Intercellular Connections • Support and communication • CAMs (cell adhesion molecules) • Transmembrane proteins • Intercellular cement • Proteoglycans • Hyaluronan (hyaluronic acid) • Glycosaminoglycans

4-2 Epithelial Tissue • Intercellular Connections • Cell junctions • Form bonds with other cells or extracellular material • Tight junctions • Gap junctions • Desmosomes

4-2 Epithelial Tissue • Tight Junctions • Between two plasma membranes • Adhesion belt attaches to terminal web • Prevents passage of water and solutes • Isolates wastes in the lumen

4-2 Epithelial Tissue • Gap Junctions • Allow rapid communication • Are held together by channel proteins (junctional proteins, connexons) • Allow ions to pass • Coordinate contractions in heart muscle

4-2 Epithelial Tissue • Desmosomes • CAMs, dense areas, and intercellular cement • Spot desmosomes • Tie cells together • Allow bending and twisting • Hemidesmosomes • Attach cells to the basal lamina

4-2 Epithelial Tissue • Attachment to the Basement Membrane • Clear layer (lamina lucida) • Thin layer • Secreted by epithelia • Barrier to proteins • Dense layer (lamina densa) • Thick fibers • Produced by connective tissue • Strength and filtration

Figure 4-2 Cell Junctions Interlockingjunctionalproteins Tight junction Tight junction Adhesion belt Terminal web Spotdesmosome Adhesion belt Gapjunctions Hemidesmosome Embedded proteins(connexons) Intermediatefilaments Clearlayer Basementmembrane Denselayer Dense area Cell adhesionmolecules (CAMs) Proteoglycans

Figure 4-2a Cell Junctions Tight junction Adhesion belt Terminal web Spotdesmosome Gapjunctions Hemidesmosome This is a diagrammatic view of an epithelial cell,showing the major types of intercellularconnections.

Figure 4-2b Cell Junctions Interlockingjunctionalproteins Tight junction Terminal web Adhesion belt A tight junction is formed by the fusion of the outer layers of two plasma membranes. Tight junctions prevent the diffusion of fluids and solutes betweenthe cells. A continuous adhesion belt lies deep to the tight junction. This belt is tied to the microfilaments of the terminal web.

Figure 4-2c Cell Junctions Embedded proteins(connexons) Gap junctions permit the free diffusion of ions and small molecules between two cells.

Figure 4-2d Cell Junctions Intermediatefilaments Cell adhesionmolecules (CAMs) Dense area Proteoglycans A spot desmosome tiesadjacent cells together.

Figure 4-2e Cell Junctions Clearlayer Basementmembrane Denselayer Hemidesmosomes attach a cell to extracellular structures, such as the protein fibers in the basement membrane.

4-2 Epithelial Tissue • Epithelial Maintenance and Repair • Epithelia are replaced by division of germinative cells (stem cells) • Near basement membrane

4-3 Classification of Epithelia • Singular = Epithelium Plural = Epithelia • Classes of Epithelia • Based on shape • Squamous epithelia — thin and flat • Cuboidal epithelia — square shaped • Columnar epithelia — tall, slender rectangles • Based on layers • Simple epithelium — single layer of cells • Stratified epithelium — several layers of cells

4-3 Classification of Epithelia • Squamous Epithelia • Simple squamous epithelium • Absorption and diffusion • Mesothelium • Lines body cavities • Endothelium • Lines heart and blood vessels

Figure 4-3a Squamous Epithelia Simple Squamous Epithelium LOCATIONS: Mesothelia lining ventral body cavities endothelia lining heartand blood vessels portions of kidney tubules (thin sections of nephron loops) inner lining of cornea alveoli of lungs FUNCTIONS: Reduces friction controls vessel permeability performsabsorption and secretion Cytoplasm Nucleus Connective tissue LM  238 Lining of peritoneal cavity

4-3 Classification of Epithelia • Squamous Epithelia • Stratified squamous epithelium • Protects against attacks • Keratin protein adds strength and water resistance

Figure 4-3b Squamous Epithelia Stratified Squamous Epithelium LOCATIONS: Surface of skin lining of mouth, throat, esophagus, rectum, anus, and vagina FUNCTIONS: Provides physical protection against abrasion, pathogens, and chemical attack Squamoussuperficial cells Stem cells Basementmembrane Connectivetissue Surface of tongue LM  310

4-3 Classification of Epithelia • Cuboidal Epithelia • Simple cuboidal epithelium • Secretion and absorption • Stratified cuboidal epithelia • Sweat ducts and mammary ducts

Figure 4-4a Cuboidal and Transitional Epithelia Simple Cuboidal Epithelium LOCATIONS: Glands ductsportions of kidney tubules thyroidgland Connectivetissue FUNCTIONS: Limited protection,secretion, absorption Nucleus Cuboidalcells Basementmembrane Kidney tubule LM  650

Figure 4-4b Cuboidal and Transitional Epithelia Stratified Cuboidal Epithelium LOCATIONS: Lining of some ducts(rare) FUNCTIONS: Protection, secretion,absorption Lumenof duct Stratifiedcuboidalcells Basementmembrane Nuclei Connectivetissue Sweat gland duct LM  500

4-3 Classification of Epithelia • Transitional Epithelium • Tolerates repeated cycles of stretching and recoiling and returns to its previous shape without damage • Appearance changes as stretching occurs • Situated in regions of the urinary system (e.g., urinary bladder)

Figure 4-4c Cuboidal and Transitional Epithelia Transitional Epithelium LOCATIONS: Urinarybladder renal pelvisureters FUNCTIONS: Permitsexpansion and recoilafter stretching Epithelium(relaxed) Basement membrane Connective tissue andsmooth muscle layers LM  400 Empty bladder Epithelium(stretched) Basement membrane LM  400 Connective tissue andsmooth muscle layers LM  400 Full bladder Urinary bladder

4-3 Classification of Epithelia • Columnar Epithelia • Simple columnar epithelium • Absorption and secretion • Pseudostratified columnar epithelium • Cilia movement • Stratified columnar epithelium • Protection

Figure 4-5a Columnar Epithelia Simple Columnar Epithelium LOCATIONS: Lining ofstomach, intestine, gallbladder,uterine tubes, and collectingducts of kidneys Microvilli Cytoplasm FUNCTIONS: Protection,secretion, absorption Nucleus Basementmembrane Looseconnective tissue LM  350 Intestinal lining

Figure 4-5b Columnar Epithelia Pseudostratified Ciliated Columnar Epithelium LOCATIONS: Lining ofnasal cavity, trachea, andbronchi portions of malereproductive tract Cilia Cytoplasm FUNCTIONS: Protection,secretion, move mucuswith cilia Nuclei Basementmembrane Looseconnective tissue Trachea LM  350

Figure 4-5c Columnar Epithelia Stratified Columnar Epithelium LOCATIONS: Small areas ofthe pharynx, epiglottis, anus,mammary glands, salivarygland ducts, and urethra Looseconnective tissue Deeper basalcells FUNCTION: Protection Superficialcolumnar cells Lumen Lumen Cytoplasm Nuclei Basementmembrane Salivary gland duct LM  175

4-3 Classification of Epithelia • Glandular Epithelia • Endocrine glands • Release hormones • Into interstitial fluid • No ducts • Exocrine glands • Produce secretions • Onto epithelial surfaces • Through ducts

4-3 Classification of Epithelia • Glandular Epithelia • Modes of Secretion • Merocrine secretion • Apocrine secretion • Holocrine secretion

4-3 Classification of Epithelia Merocrine Secretion Produced in Golgi apparatus Released by vesicles (exocytosis) For example, sweat glands Apocrine Secretion Produced in Golgi apparatus Released by shedding cytoplasm For example, mammary glands

4-3 Classification of Epithelia Holocrine Secretion Released by cells bursting, killing gland cells Gland cells replaced by stem cells For example, sebaceous glands

Figure 4-6 Modes of Glandular Secretion Secretoryvesicle Golgiapparatus Nucleus TEM  3039 Salivary gland Breaksdown Mammary gland Golgi apparatus Secretion Regrowth Hair Sebaceousgland Cells burst, releasingcytoplasmic contents Hair follicle Cells produce secretion,increasing in size Cell division replaceslost cells Stem cell

Figure 4-6a Modes of Glandular Secretion Secretoryvesicle Salivary gland Golgiapparatus Nucleus Mammary gland TEM  3039 Merocrine. In merocrine secretion, secretory vesicles are discharged at the apical surface of the gland cell by exocytosis. Hair Sebaceousgland Hair follicle

Figure 4-6b Modes of Glandular Secretion Salivary gland Breaksdown Mammary gland Golgi apparatus Secretion Regrowth Apocrine. Apocrine secretion involves the loss of apical cytoplasm. Inclusions, secretory vesicles, and other cytoplasmiccomponents are shed in the process. The gland cell then undergoes growth and repair before it releases additional secretions. Hair Sebaceousgland Hair follicle

Figure 4-6c Modes of Glandular Secretion Salivary gland Cells burst, releasingcytoplasmic contents Mammary gland Cells produce secretion,increasing in size Cell division replaceslost cells Stem cell Hair Holocrine. Holocrine secretion occurs as superficial gland cells burst. Continued secretion involves the replacement of these cells through the mitotic division of underlying stem cells. Sebaceousgland Hair follicle

4-3 Classification of Epithelia • Glandular Epithelia • Types of Secretions • Serous glands • Watery secretions • Mucous glands • Secrete mucins • Mixed exocrine glands • Both serous and mucous

4-3 Classification of Epithelia • Glandular Epithelia • Gland Structure • Unicellularglands • Mucous (goblet) cells are the only unicellular exocrine glands • Scattered among epithelia • For example, in intestinal lining


Kinesin and mitosis

In recent years, it has been found that microtubule-based molecular motors (including a number of kinesins) have a role in mitosis (cell division). Kinesins are important for proper spindle length and are involved in sliding microtubules apart within the spindle during prometaphase and metaphase, as well as depolymerizing microtubule minus ends at centrosomes during anaphase. [ 28 ] Specifically, Kinesin-5 family proteins act within the spindle to slide microtubules apart, while the Kinesin 13 family act to depolymerize microtubules.


شاهد الفيديو: علم الاحياء الدقيقة-عملي acid fast stain and Gram stain المعمل عبد اللطيف (قد 2022).


تعليقات:

  1. Radmund

    فكرت وحذفت الرسالة

  2. Gurr

    أعتقد أنك ستسمح بالخطأ. أدخل سنناقش. اكتب لي في PM.

  3. Devron

    لقد ضربت المكان. انا اعتقد انها فكرة جيدة. أنا أتفق معك.

  4. Birkey

    من الصعب القول.

  5. Koby

    هذه الجملة الرائعة هي فقط عن

  6. Darcell

    أنت تسمح بالخطأ.



اكتب رسالة