معلومة

ما هو دور تريتون في العازلة لفحص لطخة ويسترن؟


ما هو دور تريتون في العازلة لفحص لطخة ويسترن؟ أفهم أن الأمر يتعلق بمنع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد.


هذا هو بالضبط. تريتون هو منظف ودمجها يجعل الأمر أكثر صعوبة بالنسبة له كل شىء لربط. إليك كيف أتخيل منع عمل المخزن المؤقت:

PBS / TBS: تخزين درجة الحموضة

الحليب / مساحة سطح الجسم: يتفاعل بشكل موحد مع البقعة بأكملها. الفكرة هي أن هذه سوف أ) تمتص أجزاء البقعة التي لا تحتوي بالفعل على الكثير من العينات (نظرًا لأن المناطق "الفارغة" من البقعة قد تمتص الأجسام المضادة / الأجسام المضادة للكشف (وهذا مصدر للربط غير المحدد ).

Triton (أو ، بشكل أكثر شيوعًا ، Tween-20): حسنًا ، فكر الآن في ما يوجد على لطختك. الجسم المضاد الخاص بك إرادة تفاعلات ضعيفة مع أي شيء هناك تقريبًا. يتفاعل المنظف مع كل ما يلمسه (الجسم المضاد والبروتينات الممتصة على البقعة) لتقليل تقارب الارتباط في الكثير من هذه التفاعلات (على الرغم من أنه يمكن العثور على بعض الأمثلة المضادة المثيرة للاهتمام هنا) ، مما يجعل الارتباط الأقل تفضيلًا أقل ملاءمة ، مما يقلل من فرص احتفاظ الجسم المضاد للكشف بهذه التفاعلات الأضعف (خارج الهدف). تشير المقالة السابقة أيضًا إلى أن استخدام المنظفات غير الأيونية يقلل من شدة الإشارة الغربية (وبدرجة مختلفة عبر البروتينات).


تحليل لطخة غربية

ليونارد جي ديفيس دكتوراه. و. جيمس اف باتي M.D.، Ph.D. ، في الطرق الأساسية في البيولوجيا الجزيئية ، 1986

ملخص الناشر

يقدم هذا الفصل نظرة عامة على طريقة تحليل اللطخة الغربية ، والتي تسمح للباحث بتحديد البروتينات المحددة التي تم حلها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام SDS بولي أكريلاميد عن طريق الارتباط بمضادات معينة. يتم نقل البروتينات التي تم حلها على هلام الأكريلاميد إلى مرشح النيتروسليلوز (NC) المحتضن بالمضاد. يتكون محلول النقل المستخدم في طريقة تحليل اللطخة الغربية من قاعدة Tris و glycine و water و methanol. يتم الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت للنقل مع حمض الهيدروكلوريك. يرتبط الجسم المضاد الأولي على وجه التحديد بحاتمة الجسم ويتم الكشف عن الجسم المضاد المرتبط بأنواع ثانوية ، مثل [125] I - البروتين A أو الماعز المضاد لـ IgG. تتضمن طريقة تحليل اللطخة الغربية تحضير هلام بولي أكريلاميد - SDS لفصل البروتينات ، ويتم الحصول على الجسم المضاد مقابل تسلسل البروتين ذي الأهمية. يتم نقل البروتين كهربائيا من هلام بولي أكريلاميد إلى مرشح NC.


الغرض من خطوات الحجب ووظيفتها

دعامات الغشاء المستخدمة في النشاف الغربي لها انجذاب كبير للبروتينات. لذلك ، بعد نقل البروتينات من الهلام ، من المهم سد السطح المتبقي من الغشاء لمنع الارتباط غير المحدد بالأجسام المضادة للكشف خلال الخطوات اللاحقة. تم استخدام مجموعة متنوعة من المحاليل المعيارية التي تتراوح من الحليب أو المصل الطبيعي إلى البروتينات عالية النقاء لمنع المواقع الحرة على الغشاء. يجب أن يحسن المخزن المؤقت للحظر حساسية الفحص عن طريق تقليل تداخل الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سوف يرتبط المخزن المؤقت للحظر المثالي بجميع المواقع المحتملة للتفاعل غير المحدد ، مما يلغي الخلفية تمامًا دون تغيير أو حجب الحاتمة لربط الجسم المضاد.

يعتمد الاختيار الصحيح للمانع لطخة معينة على المستضد نفسه وعلى نوع ملصق الكشف المستخدم. على سبيل المثال ، في التطبيقات التي يتم فيها استخدام اقترانات AP ، يجب تحديد مخزن مؤقت للحظر في TBS لأن PBS يتداخل مع الفوسفاتاز القلوي. من أجل التحسين الحقيقي لخطوة الحجب لمقايسة مناعية معينة ، فإن الاختبار التجريبي ضروري. يمكن أن تؤثر العديد من العوامل ، بما في ذلك تفاعلات البروتين البروتين المختلفة الفريدة لمجموعة معينة من كواشف المقايسة المناعية ، على الارتباط غير المحدد. المعلمة الأكثر أهمية عند اختيار مانع هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، المقاسة كإشارة تم الحصول عليها من عينة تحتوي على المادة التحليلية المستهدفة ، بالمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها من عينة بدون التحليل المستهدف. سيؤدي استخدام كميات غير كافية من المانع إلى تلطيخ الخلفية المفرط وتقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قد يؤدي استخدام التركيزات المفرطة للمانع إلى إخفاء تفاعلات الجسم المضاد مع المستضد أو تثبيط إنزيم الواسم ، مما يتسبب مرة أخرى في تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. عند تطوير أي مقايسة مناعية جديدة ، من المهم اختبار عدة حاصرات مختلفة لأعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء في الفحص. لا يوجد عامل مانع واحد مثالي لكل مناسبة لأن كل زوج من الأجسام المضادة والمستضد له خصائص فريدة.

الكتيب الفني للكشف عن البروتين

يوفر هذا الكتيب المؤلف من 84 صفحة نظرة عميقة في الخطوة الأخيرة في سير عمل اللطخة الغربية - اكتشاف البروتين. مع مجموعة متنوعة من تقنيات الكشف للاختيار من بينها (التلألؤ الكيميائي أو التألق أو الكروموجينيك) ، يمكنك تحديد تقنية تتناسب مع متطلباتك التجريبية والأدوات المتاحة لديك. سواء كان ذلك من أجل التصور السريع أو القياس الكمي الدقيق أو الاكتشاف بمسبار واحد أو مضاعفة الإرسال - تقدم Thermo Fisher Scientific مجموعة من الكواشف والمجموعات لاكتشاف اللطخة الغربية والتحليل اللاحق.


ما هو دور تريتون في العازلة لفحص لطخة ويسترن؟ - مادة الاحياء

نقدم هنا مراجعة شاملة للمنظفات المختبرية وتطبيقاتها في التجارب الطبية الحيوية. تتضمن هذه المراجعة مناقشات حول المنظفات الأيونية وغير الأيونية والزيوتريونية وخصائصها العامة بالإضافة إلى معلومات حول المنظفات الشائعة الاستخدام من كل مجموعة. أخيرًا ، نقوم بتضمين مناقشة موجزة لنتائج مسح Labome لبعض المنظفات الشائعة.

المنظفات المستخدمة في المختبرات الطبية الحيوية هي مواد خافضة للتوتر السطحي (عوامل تعمل على السطح) ، وتستخدم لتحلل الخلايا (أي تمزق أغشية الخلايا) وإطلاق المواد داخل الخلايا. إنها جزيئات برمائية ، تحتوي على مناطق محبة للماء وكارهة للماء. تسمح هذه الخاصية البرمائية للمنظفات بتكسير البروتينات والبروتينات الدهنية والجمعيات الدهنية والبروتينات غير الطبيعية والجزيئات الكبيرة الأخرى ، وتمنع الارتباط غير المحدد في المقايسات الكيميائية المناعية وتبلور البروتين.

هناك العديد من أنواع المنظفات المستخدمة في الأبحاث المعملية. يستمر تطوير مركبات برمائية جديدة ، عادة ما تكون مصممة لتطبيقات محددة (على سبيل المثال ، مالتوز نيوبينتيل جلايكول [1] وثنائي كربوكسيلات مستبدل بالجليكوزيل [2]). تستعرض هذه المقالة خصائص وتطبيقات المنظفات المختبرية الأكثر استخدامًا.

نوعمواد كيميائية
أيونيكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، ديوكسيكولات ، كوليت ، ساركوسيل
غير أيونيTriton X-100 ، DDM ، ديجيتونين ، توين 20 ، توين 80
zwitterionicالفصول
تشوتروبيكاليوريا

المنظفات عبارة عن مركبات عضوية برمائية تتكون من جزء هيدروكربوني غير قطبي كاره للماء (ذيل) ومجموعة رأس قطبية محبة للماء (الشكل 1 أ). يشبه هذا التركيب الجزيئي إلى حد كبير الفسفوليبيدات البرمائية التي تشكل أغشيتنا الخلوية ، باستثناء أن الفوسفوليبيدات تمتلك ذيول زوجية كارهة للماء مرتبطة بمجموعة الرأس المحبة للماء (الشكل 1 د). عندما تذوب في الماء بتركيزات ودرجات حرارة مناسبة ، تتجمع الجزيئات البرمائية ذاتيًا في هياكل تحافظ على مجموعات الرأس المحبة للماء في الخارج وذيولها الكارهة للماء في الداخل بعيدًا عن الماء. نظرًا لاختلافاتهم الجزيئية ، تشكل جزيئات المنظف مذيلات كروية (الشكل 1 ج) بينما من المرجح أن تتطور الدهون الفوسفورية إلى طبقة ثنائية (الشكل 1 د). يسمح التشابه في الهياكل الجزيئية للمنظف باختراق طبقات ثنائية الفسفوليبيد وبالتالي تعطيل أغشية الخلايا.

علاوة على ذلك ، يمكن أن يرتبط النواة الكارهة للماء للمذيلة بمناطق البروتينات الكارهة للماء (الشكل 1 ب). يُطلق على عدد جزيئات المنظف في الميسيل رقم التجميع ، وهو عامل مهم يستخدم لتقييم قابلية ذوبان بروتين الغشاء [3]. يتناسب طول المنطقة الكارهة للماء بشكل مباشر مع درجة الكراهية للماء ، وهو ثابت تمامًا بين المنظفات ، في حين أن مجموعة الرأس المشحونة متغيرة. تعد كل من درجة الحرارة والتركيز معلمات مهمة لفصل الطور وقابلية ذوبان المنظف. يُطلق على الحد الأدنى من تركيز المنظف الذي يتم فيه ملاحظة المذيلات عند درجة حرارة معينة اسم تركيز الميسيل الحرج (CMC). في أي تركيزات أقل من CMC ، يتم ملاحظة المونومرات فقط بتركيزات أعلى من CMC يتعايش كل من المذيلات والمونومرات ، جنبًا إلى جنب مع الأطوار الأخرى غير micellar التي لا تذوب في الماء. وبالمثل ، فإن أدنى درجة حرارة تتشكل فيها المذيلات تسمى درجة حرارة Micelle الحرجة (CMT). يتأثر CMC أيضًا بدرجة شغف مجموعة الرأس. بشكل عام ، تؤدي الشخصية المنخفضة المحبة للدهون أو الكارهة للدهون إلى ارتفاع CMC.

يتم تصنيف المنظفات الشائعة إلى ثلاث مجموعات بناءً على خصائصها: أيوني (أنيوني أو كاتيوني) ، غير أيوني و zwitterionic. أدناه أناقش المنظفات الشائعة في كل فئة من هذه الفئات وأقدم معلومات مهمة حول اختيار واستخدام المنظفات المعملية.

تتكون المنظفات الأيونية من سلسلة كارهة للماء ومجموعة رأس مشحونة يمكن أن تكون أنيونية أو كاتيونية. تحتوي بشكل عام على قيم CMC أعلى من المنظفات غير الأيونية وتميل إلى أن تكون قاسية إلى حد ما. نظرًا لمجموعات الرأس المشحونة ، لا يمكن إزالة المنظفات الأيونية عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. علاوة على ذلك ، يجب اتخاذ احتياطات إضافية عند استخدام المنظفات الأيونية لأن بعض خصائصها قد تتغير في المحاليل ذات القوة الأيونية المتغيرة (على سبيل المثال ، يمكن أن ينخفض ​​CMC بشكل كبير عندما يزيد تركيز كلوريد الصوديوم من 0 إلى 500 ملي مولار).

إن الـ SDS الأنيوني هو مادة فعالة بالسطح شائعة الاستخدام وفعالة في إذابة معظم البروتينات. إنه يعطل الروابط غير التساهمية داخل وبين البروتينات ، مما يؤدي إلى تغيير طبيعتها ، ويؤدي إلى فقدان شكلها الأصلي ووظيفتها. يرتبط SDS بالبروتين بنسبة 1.4: 1 w / w (تقابل حوالي جزيء SDS واحد لكل اثنين من الأحماض الأمينية) ، مما يخفي شحنة البروتين. وهكذا تضيف SDS شحنة سالبة شاملة لجميع البروتينات في العينة بغض النظر عن نقطة تساوي الكهرباء (pI). بمجرد الارتباط بجزيئات SDS سالبة الشحنة ، يمكن فصل البروتينات بناءً على الحجم. هذا سبب كبير للاستخدام الواسع للرحلان الكهربائي للهلام SDS بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) لفصل البروتينات ودراستها. عادة ، من أجل تحلل الخلية الكامل في وجود SDS ، يجب أن تكون العينة صوتنة أو مقطوعة (على سبيل المثال ، تمريرها عبر إبرة 19G) عدة مرات لضمان تدهور الحمض النووي. لا يمكن استخدام SDS عندما تكون البروتينات النشطة مطلوبة أو عند دراسة تفاعلات البروتين والبروتين لأن كلاهما يتم تعطيله بواسطة SDS. عند العمل مع SDS ، من المهم معرفة أن SDS يترسب في درجات حرارة منخفضة ، ويزداد هذا التأثير في وجود أملاح البوتاسيوم. يمكن استغلال هذه الظاهرة أحيانًا لإزالة SDS من عينة بروتين [4].

ديوكسيكولاتي الصوديوم وكولات الصوديوم هما منظفات الأملاح الصفراوية. كلاهما منظفات أنيونية. غالبًا ما تستخدم هذه المنظفات في تعطيل الأغشية واستخراج البروتين الغشائي ، على سبيل المثال ، مستقبلات الأبلين [5]. Deoxycholate يفسد طبيعة البروتينات بينما الكوليت هو منظف غير مغيّر للطبيعة. تتمثل إحدى الفوائد المحتملة لكل من هذين المنظفين في إمكانية إزالتهما من العينات عن طريق غسيل الكلى ، مما قد يساعد في القياس الكمي و / أو التحليلات النهائية للبروتينات.

ساركوسيل ، المعروف أيضًا باسم ساركوسيل أو لوريل ساركوسينات الصوديوم ، هو عامل خافض للتوتر السطحي أنيوني. إنه برمائي بسبب سلسلة 14 كربون كاره للماء (لوريل) والكربوكسيلات المحبة للماء. الكربوكسيل مع قيمة pKa 3.6 مشحونة سلبًا في أي محلول فسيولوجي. يتم تحضير الساركوزيل من كلوريد اللورويل والساركوزين في وجود هيدروكسيد الصوديوم ويتم تنقيته عن طريق إعادة التبلور من الكحول ، أو عن طريق التحميض بحمض معدني ، وفصل الحمض الحر ، وتحييد الحمض الحر. كما تم استخدام ساركوسيل لتحسين ترطيب وتغلغل المنتجات الصيدلانية الموضعية. في صناعة المواد الغذائية ، تمت الموافقة على استخدام الساركوزيل في معالجة وتعبئة ونقل الطعام للاستهلاك البشري ، وفي المواد اللاصقة المستخدمة في تخزين الطعام أو نقله. يستخدم على نطاق واسع في التركيبات التجميلية مثل الشامبو وغسول الجسم بتركيزات حوالي 3-13٪ [6]. يستخدم Sarkosyl أيضًا في معالجة نهايات المعدن لخصائصه المعدلة للكريستال ، ومقاومة الصدأ ، ومقاومة التآكل.

يستخدم Sarkosyl على نطاق واسع في التجارب المعملية ، على سبيل المثال لإذابة تاو في أبحاث مرض الزهايمر [7] ، نظرًا لقابلية الذوبان الجيدة في الماء ، واستقرار الرغوة العالية ، وقدرته القوية على امتصاص البروتينات. يعمل ساركوسيل كمنظف لنفاذية الخلايا واستخراج البروتينات في تقنيات العزل والتنقية مثل اللطخة الغربية والاليزا غير المباشر. يمكن أن يمنع أيضًا بدء نسخ الحمض النووي.

أحد التطبيقات الرئيسية للساركوسيل هو إذابة البروتينات وإعادة تشكيلها من الأجسام المتضمنة (تجمعات البروتين داخل السيتوبلازم أو النوى). يتم التعبير عن البروتينات المؤتلفة حقيقية النواة بشكل مفرط في الإشريكية القولونية تميل إلى تشكيل مثل هذه الهيئات التضمينية. غالبًا ما يستخدم Sarkosyl لإذابة حبيبات الجسم المتضمنة لاستخراج البروتينات والسماح لها بإعادة الطي إلى شكلها الأصلي. اشتملت الأعمال السابقة على إذابة الأجسام المتضمنة بمواد مبطلة للطبيعة ، مثل اليوريا أو هيدروكلوريد الجوانيدينيوم ، وإعادة الطي عن طريق التخفيف البطيء - ومع ذلك ، تتجمع معظم البروتينات المذابة وترسب عند إزالة المنظفات القوية. Sarkosyl هو عامل ذوبان فعال يقلل من التراكم ويسمح بإعادة التشكيل عند تركيزات أعلى من البروتين (تصل إلى 10 أضعاف عند مقارنتها باستخدام هيدروكلوريد الجوانيدينيوم [8]). وجدت إحدى الدراسات أن أكثر من 95٪ من بروتينات اندماج الجسم المتضمنة تمت إذابتها باستخدام 10٪ ساركوسيل ، وأنه يمكن بعد ذلك استعادة البروتينات بمزيج من المنظفات الأخرى (مثل Triton X-100 و CHAPS) [9]. يمكن أيضًا تخزين البروتينات الموجودة في المستخلص القابل للذوبان مع ساركوسيل عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع قبل تنقية التقارب. وتجدر الإشارة ، مع ذلك ، إلى أن الساركوزيل يتداخل مع عملية الكروماتوغرافيا اللاحقة ويجب إزالته من المحلول عن طريق التخفيف أو غسيل الكلى.

تحتوي المنظفات غير الأيونية على مجموعات رأس محبة للماء غير مشحونة. وهي تعتبر من العوامل الخافضة للتوتر السطحي المعتدلة لأنها تكسر ارتباطات البروتين والدهون والدهون ، ولكنها لا تتفاعل عادةً مع تفاعلات البروتين والبروتين ، وبشكل عام ، لا تفسد طبيعة البروتينات. لذلك ، يمكن إذابة العديد من بروتينات الغشاء في شكلها الأصلي والنشط ، مع الاحتفاظ بتفاعلاتها البروتينية. ومع ذلك ، نظرًا لأن ليس كل البروتينات تتصرف بالطريقة نفسها مع المنظفات غير الأيونية المختلفة ، فقد تكون التجربة والخطأ ضروريين للعثور على أفضل منظف للبروتينات التي تهمك. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن معظم المنظفات غير الأيونية تتداخل مع القياس الطيفي فوق البنفسجي (UV). لذلك ، فإن تحديد البروتين عند 280 نانومتر في وجود المنظفات غير الأيونية عادة ما يكون غير دقيق.

جميع أفراد عائلة Triton: Triton X-100 ، Triton X-114 ، Nonidet P-40 (NP-40) ، Igepal® CA-630 ، متشابهون تمامًا ، ويختلفون قليلاً في متوسط ​​عددهم (n) من المونومرات لكل micelle (9.6 ، 8.0 ، 9.0 ، 9.5 ، على التوالي) وتوزيع حجم مجموعة الرأس القائمة على البولي إيثيلين جلايكول (PEG). قيم CMC لهذه المنظفات منخفضة ، وبالتالي لا يمكن إزالتها بسهولة عن طريق غسيل الكلى. Triton X-100 ، منظف غير أيوني نموذجي ، مشتق من البولي أوكسي إيثيلين ويحتوي على مجموعة ألكيل فينيل كارهة للماء. يستخدم Triton X-100 بشكل شائع لعزل معقدات البروتين الغشائي ، وخافض التوتر السطحي المفضل لمعظم تجارب الترسيب المناعي المشترك. يتم استخدام أعضاء آخرين من عائلة Triton لعزل البروتين الغشائي عن طريق فصل الطور بسبب نقاط السحب المنخفضة (درجة الحرارة التي تتجمع فيها المذيلات وتشكل مرحلة مميزة). في حين أن نقطة السحابة في Triton X-100 هي 64 درجة مئوية ، فإن نقطة السحابة في Triton X-114 هي 23 درجة مئوية. يسمح هذا باستخراج البروتين الغشائي وإذابه في Triton X-114 دون رفع العينات إلى درجات حرارة أكثر دفئًا مما قد يفسد العديد من البروتينات.

Brij ™ 35 هو عامل خافض للتوتر السطحي غير أيوني آخر من مادة البولي أوكسي إيثيلين ، ويشيع استخدامه كمكون لمخازن تحلل الخلايا أو المحاليل المؤقتة للمقايسة أو عامل الفاعل بالسطح في تطبيقات HPLC.

إن n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) عبارة عن مادة خافضة للتوتر السطحي جليكوسيدية ، تستخدم بشكل متزايد مع عزل البروتين الغشائي والطارد للماء عندما يلزم الحفاظ على نشاط البروتين. إنه أكثر كفاءة في إذابة البروتين للرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد من العديد من المنظفات الأخرى ، بما في ذلك CHAPS و NP-40 [10]. يخلق الجلايكوتشين في موقعه المحب للدهون ، و CMC المرتفع الذي يبلغ 0.17 ملي مولار وواجهة المذيلات بيئة مكروية شبيهة بالماء مثالية لإذابة البروتينات الغشائية والطارئة للماء والحفاظ عليها [11]. على سبيل المثال ، قام Winkler MBL وآخرون بتنقية البروتين NCR1 مع إضافة n-dodecyl-β-D-maltopyranoside [12] وكذلك فعل Li Y et al لبروتينات LptB2FG و LptB2FGC [13]. مختلط Steichen JM وآخرون معقدات البروتين في محلول DDM من Anatrace قبل Cryo-EM [14].

المالتوزيدات الأخرى ، مثل بيتا ديسيل مالتوسيد ، لها أطوال مختلفة من سلاسل الألكيل كارهة للماء. الجلوكوزيد (أوكتيل جلوكوزيد) هو بديل محتمل لمنظفات المالتوسيد لأبحاث البروتين [15].

Digitonin ، جليكوسيد ستيرويدي مشتق من نبات قفاز الثعلب الأرجواني (ديجيتال بوربوريا) ، لإذابة الأغشية الخلوية. كما هو الحال مع المنظفات غير الأيونية الأخرى التي تمت مناقشتها هنا ، كثيرًا ما يستخدم الديجيتونين في تذويب بروتينات الغشاء دون تغيير طبيعتها. على سبيل المثال ، خلايا B de Laval et al lysed مع 1 ٪ من الديجيتونين لتفاعل Tn5 transposase أثناء بروتوكول ATAC-seq [16]. أطلق Zhao Y et al مستقبلات AMPA المشبكية وخارج المشبكية من كثافة ما بعد المشبكي مع الديجيتونين [17]. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم الديجيتونين لاستخراج العضيات الخلوية. يتفاعل الديجيتونين مع الكوليسترول في الأغشية ، وبالتالي يمكن استخدامه لتنفيس غشاء البلازما الغني بالكوليسترول مع ترك أغشية العضية الفقيرة بالكوليسترول سليمة.

Tween-20 و Tween-80 عبارة عن مواد خافضة للتوتر السطحي متعددة السوربات مع جزء إستر من الأحماض الدهنية وسلسلة طويلة من البولي أوكسي إيثيلين. لديهم نسبة منخفضة من CMC ، وهي عمومًا مواد خافضة للتوتر السطحي لطيفة ، ولا تؤثر على نشاط البروتين وهي فعالة في الذوبان. لا تعتبر المراهقات مكونات شائعة للمخازن المؤقتة لتحلل الخلايا ، ومع ذلك ، يتم استخدامها بشكل روتيني كعوامل غسيل في التكتل المناعي و ELISA لتقليل الارتباط غير المحدد بالأجسام المضادة وإزالة الشقوق غير المرتبطة ، واستخدامها لنفاذية أغشية الخلايا. على سبيل المثال ، علامة FLAG داخل الخلايا يانغ جي وآخرون لديهم مناعة بعد معالجة خلايا HEK293 مع 0.2٪ توين 20 [18].

أحد الأسئلة الشائعة المتعلقة بمنظفات عائلة Tween هو الفرق بين Tween 20 و Tween 80 ، وهما العضوان الأكثر استخدامًا. يحتوي توين 20 على حمض اللوريك ، بينما يحتوي توين 80 على حمض الأوليك (الشكل 3). يلخص الجدول 2 الجوانب المختلفة بينهما. غالبًا ما يمكن استخدام هذه المنظفات بالتبادل ، ومع ذلك ، يكون الاختلاف بينهما مهمًا في بعض الأحيان ، كما هو الحال في في الجسم الحي الدراسات التي قد تتأثر بمستويات مختلفة من التأثير الانحلالي لتوين 20 وتوين 80 [19]. Greenwood DJ et al ، على سبيل المثال ، نما السل الفطري في وسط مكمل بنسبة 0.05٪ توين 80 [20]. قام Ouadah Y et al بحقن محلول ثنائي بنزازيبين مع 0.1٪ حجم / حجم توين 80 في الفئران لتثبيط إشارات الشق [21].

المرادفات صيغة كيميائية الوزن الجزيئي الغرامي الكثافة (جم / مل) مظهر خارجي التطبيقات
توين 20بولي سوربات 20 ، بولي أوكسي إيثيلين سوربيتان أحادي ، PEG (20) سوربيتان أحاديج 58 H 114 O 26 12281.1سائل شفاف ، أصفر إلى أصفر-أخضر لزجمجموعة واسعة من التطبيقات: كعامل مانع في مخازن غسل PBS أو TBS لـ ELISA ، النشاف الغربي وطرق المقايسة المناعية الأخرى لتحلل خلايا الثدييات وكعامل إذابة لبروتينات الغشاء.
توين 80بولي سوربات 80 ، بولي أوكسي إيثيلين سوربيتان أحادي ، PEG (80) سوربيتان أحاديج 64 H 124 O 26 13101.06-1.09سائل لزج كهرماني اللونكعامل استقرار للبروتينات المستخدمة في اختبارات تحديد النمط الظاهري لبعض المتفطرات المستخدمة في مستحضرات اللقاح [22]

على الرغم من أن المنظفات غير الأيونية معتدلة نسبيًا بشكل عام ، إلا أن العديد من البروتينات تفسد أو تتجمع في وجود هذه المنظفات. للتخفيف من حدة هذه المشكلة ، تم تطوير أمفيفيل غليكو-ليثوكولات جديدة غير أيونية (GLC-1 و GLC-2 و GLC-3) و glyco-diosgenin amphiphile (GDN) [23]. تم استخدام GDN لاستخراج تخليق ATP للميتوكوندريا ثنائي الأبعاد لفهم كيفية عمل البروتين بشكل أفضل [24]. يستخدم Pluronic F-68 بشكل شائع في زراعة الخلايا المعلقة بنسبة 0.1٪ لتقليل قوة قص الماء [25].

المجموعات الرئيسية من المنظفات zwitterionic محبة للماء وتحتوي على كل من الشحنات الموجبة والسالبة بأعداد متساوية ، مما ينتج عنه صافي شحنة صفرية. فهي أكثر خافض للتوتر السطحي من المنظفات غير الأيونية. المنظفات النموذجية zwitterionic هي 3 - & # 91 (3-cholamidopropyl) dimethylammonio & # 93-1-propanulfonate ، والمعروفة باسم CHAPS. يسمح CMC عالي CHAPS (6 ملم في درجة حرارة الغرفة) بالإزالة الفعالة عن طريق غسيل الكلى. إنه شائع جدًا في تحضير العينة بتركيزات 2-4٪ للتركيز الكهربي المتساوي والرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد. يختلف CHAPSO مع CHAPS من حيث أنه يحتوي على مجموعة رأس أكثر قطبية ، مما يجعلها أكثر قدرة على إذابة الجزيئات الكارهة للماء. وبالتالي ، يستخدم CHAPSO بشكل أساسي لإذابة بروتينات الغشاء المتكاملة.

العوامل المتشابهة هي مواد مشابهة للمواد الخافضة للتوتر السطحي من حيث أنها تكسر التفاعلات غير التساهمية (روابط هيدروجينية ، تفاعلات ثنائية القطب ، تفاعلات كارهة للماء) تسهل تمسخ البروتين ، والذي عادة ما يكون قابلاً للعكس في هذه الحالة. اليوريا هي عامل شائع شائع يستخدم بمفرده ، أو بالاشتراك مع الثيوريا أو المنظفات الأخرى ، في تطبيقات مثل الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد والهضم الإنزيمي للبروتينات في المحلول للتحضير أثناء سير العمل البروتيني. عند استخدام اليوريا ، يجب توخي الحذر الشديد لعدم تسخين العينة فوق 37 درجة مئوية لأن هذا سيؤدي إلى تفاعل الكرباميل بالبروتينات [26].

بالنسبة للذوبان في بروتين الغشاء ، يجب اختيار منظف يحتوي على نسبة عالية من CMC بشكل عام ، كما أن حجم وتركيز المخزن المؤقت مهمان أيضًا حيث يجب أن يكون هناك منظف كافٍ لإذابة جميع بروتينات الغشاء في العينة. في معظم الحالات ، يجب أن يكون تركيز المنظف جيدًا حول مستوى CMC (على الأقل 2X CMC) لضمان تركيز كافٍ للمذيلة لإذابة بروتينات الغشاء. وفقًا لـ Linke [3] ، هناك حاجة إلى مذيلة واحدة على الأقل لكل جزيء بروتين غشائي لتقليد البيئة الدهنية للغشاء بشكل كافٍ (الشكل 1 ب ، د).

يمكن استخدام فصل الطور لتنقية البروتينات بشكل أكبر. يتطلب ذلك تعديل درجة الحرارة وتركيزات الأملاح والمنظفات في المخزن المؤقت لإحداث تجمع المذيلات المنظف وفصلها عن الطبقة المائية. في هذه الحالة ، تتجمع بروتينات الغشاء ، المحاطة بالمذيلات ، مع المنظف. درجة الحرارة التي ينفصل عندها محلول المنظف إلى مرحلتين ، نقطة السحابة ، تتأثر بالجلسرين أو الأملاح في المخزن المؤقت (على سبيل المثال ، يحتوي Triton X-114 على نقطة سحابة تبلغ 23 درجة مئوية ، ولكن في وجود 20٪ جلسرين ، تنخفض نقطة السحابة إلى 4 درجات مئوية). هذا مهم جدًا لأن استقرار البروتين يتأثر بدرجات الحرارة المرتفعة.

يجب أن يكون المنظف الجيد قادرًا على تحليل الخلايا وإذابة البروتينات وأن يكون مناسبًا لتطبيقك (تطبيقاتك) النهائية. أيضا ، ينبغي النظر في البروتين المذاب في شكل أصلي أو مشوه. لا يوجد منظف مثالي لجميع التطبيقات ، وحتى في نفس التطبيق ، تختلف النتيجة (الجدول 3). لذلك ، بعد النظر في الخيارات ، غالبًا ما تكون التجربة والخطأ ضروريين للعثور على أفضل منظف ، وقد يكون مزيج المنظفات هو الأمثل. أيضًا ، عادةً ما يكون التحضير الجديد لمحلول عمل المنظف هو أفضل الممارسات لتجنب التحلل المائي والأكسدة.

منظفMW (دا) مونومرميغاواط (دا) ميسيلCMC (مم) 25 درجة مئويةرقم التجميعنقطة السحابة (o C)متوسط وزن ميسيلارالخضوع لقابل للتبديلالتطبيقات
SDS28918,0007-1062>10018,000صارمنعمتحلل الخلايا ، الرحلان الكهربي ، WB ، التهجين
تريتون اكس 10062590,0000.2-0.9100-1556580,000خفيفلاالمقايسات المناعية الإنزيمية ، IP ، ذوبان الغشاء
الفصول6156,150610>1006,150خفيفنعمIEF ، IP
NP-4068090,0000.059 45-50 خفيفلاIEF
ن دوديسيل- β-D- مالتوسيد511 0.1598 50,000 تبلور البروتين
توين -201228 0.06 76 خفيفلاWB ، ELISA ، المقايسات المناعية الإنزيمية
الديجيتونين122970,000<0.560 70,000خفيفلاذوبان الغشاء

غالبًا ما تتطلب تطبيقات المصب خفض تركيزات المنظفات أو إزالتها تمامًا. لهذه الأغراض ، يمكن استخدام كروماتوجرافيا الاستبعاد الحجمي أو غسيل الكلى إذا كان حجم المذيلة مختلفًا بشكل كبير عن البروتين المعني أو كانت المذيلات صغيرة بما يكفي (أي ارتفاع CMC) لتمريرها عبر أنابيب غسيل الكلى [3]. تستخدم الطرق الأخرى استخدام حبيبات أو راتنجات غير قطبية ملزمة للمنظفات ، أو مركبات تضمين السيكلودكسترين [27] ، كروماتوجرافيا التبادل الأيوني أو ترسيب البروتين. ومع ذلك ، يجب اختيار المخزن المؤقت المستخدم بعد إزالة المنظفات بعناية لتجنب ترسيب البروتين أو تراكمه.

يستعرض Labome الأدبيات الخاصة بتطبيق المنظفات. يسرد الجدول التالي الموردين الرئيسيين وعدد المواد ، مما يشير إلى أن معظم المنظفات توفرها MilliporeSigma.

منظف الموردين
تريتون اكس 100ثيرمو فيشر [28 ، 29] ، علوم المجهر الإلكتروني [30] ، أمريسكو ، جي تي بيكر
توين -20بيو راد [31] ، ميليبور سيجما [29] ، ثيرمو فيشر
SDSAmresco ، Bio-Rad ، Q.BIOgene ، MilliporeSigma
NP-40روش ، ميليبور سيغما [32]
الفصولميليبور سيغما ، جي تي بيكر
الديجيتونينميليبور سيغما ، واكو
DDMجينيرون [33] ، أناتريس [15]

تم استخدام Thermo Fisher Pierce Triton X-100 ، على سبيل المثال ، BP151 [29] أو 85111 [28] ، في تحليل عينات الخلايا والأنسجة من أجل قياس النبض المناعي [29] وكيمياء الخلايا المناعية [28]. تم استخدام MilliporeSigma Triton X-100 لتحفيز الخلايا [34] ، أو نفاذية الخلايا في الكيمياء الخلوية المناعية [35] ، وفي منع المخزن المؤقت للكيمياء المناعية [36 ، 37] ومقايسة حماية بروتيناز K [38].

يستخدم Tween-20 بشكل شائع في غسل المخازن المؤقتة ، مثل TBS-Tween (TBS-T) أو PBS-Tween (PBT-T) ، في مختلف المقايسات المناعية. MilliporeSigma Tween-20 ، على سبيل المثال ، P1379 [29] ، تم استخدامه في غسل البقع [29] ، في تجارب IHC (P1379) [39] ، في الترسيب المناعي [40] ، وفي مجموعة الموائع الدقيقة المتعددة PCR [41] وغيرها [ 42]. MilliporeSigma Tween-80 ، تم استخدامه لإذابة erlotinib (دواء العلاج الكيميائي) [43] وكمكمل للنمو مرض السل سلالات [44].

تم استخدام Lonza SDS (رقم الكتالوج 51213) في تحضير الكروماتين [39]. تم استخدام Amresco SDS في SDS-PAGE [45]. تم استخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم Bio-Rad لإعداد محلول مؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي [46]. تم استخدام SDS MilliporeSigma-Aldrich لتحضير المحاليل ، من بين أمور أخرى ، في مقايسات الأوكتانويل في المختبر ، ومخزن عينة Laemmli ، وتجارب 2D-DIGE [47].

تم استخدام Roche NP-40 في تحلل الخلايا [48 ، 49]. تم استخدام MilliporeSigma NP-40 لإعداد المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي [46] ، ومخازن تحلل الخلايا / التجانس المؤقت [50 ، 51] ومقايسة الترسيب المناعي RIPA العازلة [52].

تم استخدام MilliporeSigma CHAPS في المحاليل المنظمة لبلورة البروتين [53]. تم استخدام JT Baker CHAPS لتحليل الخلايا لدراسة التفاعل الفيروسي مع بروتين ASF1 البشري [54].

تم استخدام MilliporeSigma في تجربة الكيمياء المناعية لدراسة PI4P [55] واستخدمت لإجراء فحوصات حماية بروتيناز K [38] ، ولاستخراج الحمض النووي الريبي [56]. تم استخدام Wako digitonin في تحليل الخلايا [57] وإجراء تجارب الترسيب المناعي [58].

قام Y Lee et al بإذابة بروتين GPCR مع dodecylmaltoside / DDM من Generon [33]. تم استخدام Anatrace n-decyl-beta-D-maltopyranoside لتنقية البروتين [59 ، 60] وكذلك تم استخدام n-dodecyl-beta-D-maltoside [61] و n-undecyl-beta-D-maltoside [62، 63] . تم استخدام Glycon beta-dodecyl-maltoside و beta-decyl-maltoside أيضًا في تنقية البروتين [64]. تم استخدام Anatrace n-octyl-beta-glucoside في إذابة بروتينات AQP4 [15].

استخدم Silva MC وآخرون Brij-35 كمنظف لمقايسة جهاز استشعار التداخل الحيوي للطبقة الحيوية [65]. لتنقية البروتين ، تم استخدام Affymetrix octyl glucose neopentyl glycol (OGNPG) عند 1٪ [66] ، و MilliporeSigma cholesteryl hemisuccinate عند 0.1٪ أو 0.05٪ (وزن / حجم) [11 ، 67]. للمقايسات المتعلقة بالكروماتين ، تم استخدام MilliporeSigma-Aldrich sodium deoxycholate (رقم الكتالوج D6750) و Igepal (رقم الكتالوج I8896) ، و TEKnova N-lauroylsarcosine (رقم الكتالوج S3379) [39].


اللطخة الغربية: التقنية والنظرية وحل المشاكل

النشاف الغربي هو تقنية مهمة تستخدم في البيولوجيا الخلوية والجزيئية. باستخدام لطخة غربية ، يمكن للباحثين تحديد بروتينات معينة من خليط معقد من البروتينات المستخرجة من الخلايا. تستخدم التقنية ثلاثة عناصر لإنجاز هذه المهمة: (1) الفصل حسب الحجم ، (2) النقل إلى دعامة صلبة ، و (3) تعليم البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد أولي وثانوي مناسب للتصور. ستحاول هذه الورقة شرح التقنية والنظرية وراء اللطخة الغربية ، وتقديم بعض الطرق لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

الكلمات الدالة: لطخة ويسترن بروتين للأبحاث الطبية الحيوية.

بيان تضارب المصالح

تضارب المصالح: لم يصرح بشيء.

الأرقام

رف مُجمَّع لتصلب الهلام

رف مُجمَّع لتصلب الهلام

أضف محلول جل باستخدام ماصة نقل

إضافة المخزن المؤقت قيد التشغيل إلى…

إضافة عازلة التشغيل إلى الكهربي

إضافة عينات وعلامة جزيئية ...

أضف عينات وعلامة جزيئية إلى الجل بعد إزالة الأمشاط

(أ) العينات التي تمر عبر ...

(أ) العينات التي تمر عبر هلام التراص (الجهد المنخفض). (ب): عينات تمر عبر ...


محتويات

Triton X-100 غير المخفف عبارة عن سائل لزج صافٍ (أقل لزوجة من الجلسرين غير المخفف). تبلغ لزوجة Triton X-100 غير المخففة حوالي 270 درجة مئوية عند 25 درجة مئوية والتي تنخفض إلى حوالي 80 درجة مئوية عند 50 درجة مئوية. Triton X-100 قابل للذوبان عند 25 درجة مئوية في الماء ، والتولوين ، والزيلين ، وثلاثي كلورو إيثيلين ، والإيثيلين جلايكول ، والإيثر الإيثيلي ، والكحول الإيثيلي ، وكحول الأيزوبروبيل ، وثاني كلوريد الإيثيلين. Triton X-100 غير قابل للذوبان في الكيروسين والأرواح المعدنية والنفتا ، ما لم يتم استخدام عامل اقتران مثل حمض الأوليك. [5]

Triton X-100 هو منظف شائع الاستخدام في المختبرات. [6] يستخدم Triton X-100 على نطاق واسع في تحليل الخلايا لاستخراج البروتين أو العضيات ، أو لتنفيس أغشية الخلايا الحية. [7]

بعض التطبيقات تشمل:

    للفيروسات المغلفة بالدهون (مثل HIV ، HBV ، HCV) في تصنيع المستحضرات الصيدلانية الحيوية
  • الغرض الصناعي (طلاء المعادن) ، بما في ذلك Fluzone
  • نفاذية أغشية الخلايا حقيقية النواة غير المثبتة (أو الثابتة قليلاً) [7]
  • إذابة بروتينات الغشاء في حالتها الأصلية بالتزامن مع المنظفات zwitterionic مثل CHAPS
  • جزء من المخزن المؤقت للتحلل (عادةً في محلول 5٪ في محلول قلوي للتحلل) في استخراج الحمض النووي
  • تقليل التوتر السطحي للمحاليل المائية أثناء التلوين المناعي (عادةً بتركيز 0.1-0.5٪ في TBS أو PBS Buffer)
  • تشتت المواد الكربونية للمواد المركبة اللينة
  • تقييد توسع المستعمرة في نيدولانس الرشاشيات في علم الأحياء الدقيقة
  • نزع الخلايا من الأنسجة المشتقة من الحيوانات
  • إزالة SDS من المواد الهلامية SDS-PAGE قبل إعادة البروتينات داخل الهلام
  • تعطيل الطبقات الأحادية الخلية كعنصر تحكم إيجابي لقياسات TEER
  • محفز ميسيلار

بصرف النظر عن الاستخدام المختبري ، يمكن العثور على Triton X-100 في عدة أنواع من مركبات التنظيف ، [8] بدءًا من المنتجات الصناعية شديدة التحمل إلى المنظفات اللطيفة. It is also a popular ingredient in homemade vinyl record cleaning fluids together with distilled water and isopropyl alcohol. [9]

In December 2012, the European Chemicals Agency (ECHA) included the substance group “4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, ethoxylated” – which includes Triton X-100 – in the Candidate List of substances of very high concern [10] of the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Regulation which addresses the production, import and use of chemical substances and their potential impacts on human health and the environment. [11] A Triton X-100 degradation product has indeed turned out to be ecotoxic as it possesses hormone-like (estrogeno-mimetic) activity that may act on wildlife. [12] The ECHA finally included the substance group in the Authorisation List (Annex XIV), [13] mandating the pharmaceutical and other industries to replace this detergent by the “sunset date” January 4, 2021, thereby affecting EU manufacturers, importers, and downstream users, as well as non-European manufacturers exporting their products into the EU.

Alternatives for viral inactivation Edit

Since the inclusion of Triton X-100 in the candidate list of substances of very high concern for authorization, pharmaceutical companies, as well as bioprocessing research groups, are in need of an alternative detergent which must at the same time be eco-friendly and effective. Ideally, a Triton X-100 replacement should generate minimal manufacturing process change, because only then the necessary updates of regulatory filings for medicines could be realized without additional animal experiments or even clinical studies. Therefore, an alternative virus-inactivating detergent should have physico-chemical properties similar to Triton X-100, should be soluble, easy to remove, eco-friendly, but not degrade to toxic metabolites. In a recent study, [14] two alternatives for antiviral treatment in biopharmaceutical manufacturing have been identified: Triton X-100 reduced, as well as a novel compound which was named Nereid (after the mermaids in Greek mythology). As reflected by the name, Nereid can be seen as just another relative of the Triton X-100 family, however, due to a small molecular difference, it does not degrade into phenolic compounds the way that Triton X-100 does. The virus inactivation studies comprised experiments with several relevant viruses under various conditions. It turned out that at room temperature, where most virus inactivation steps in biopharmaceutical manufacturing are conducted, both Triton X-100 reduced and Nereid showed similar virus inactivating performances as Triton X-100. In contrast, for some processes that are conducted at cold temperatures, Nereid and Triton X-100 gave better results than Triton X-100 reduced. To date, Nereid can be produced at kilogram-scale using a three-step synthesis, and a patent has been applied for. [15] Nereid is scalable and compatible with existing processes and has not shown any impact on product activity so far. In terms of performance, Nereid would be a robust “all-in-one” replacement for Triton X-100. Thus, it is currently tested in ecotoxicology and biodegradation studies to confirm that it is environmentally safe.


Chapter 13 - Co-IP assays for measuring GPCR–arrestin interactions

βarrestin1 and -2 (also known as arrestin2 and -3, respectively) are G protein-coupled receptor (GPCR) adapter proteins, performing three major functions in the cell: functional desensitization, i.e., G protein uncoupling from the receptor, GPCR internalization via clathrin-coated pits, and formation of signalosomes. The βarrestins elicit a large part of the G protein-independent signaling emanating from GPCRs. Several methodologies have been developed over the past 15 years or so to quantify the GPCR–arrestin interaction/binding, especially since the latter's roles in signal transduction were discovered. One of the simplest and most traditional of these methodologies is the assay of co-immunoprecipitation (co-IP), followed by western blotting. This assay is also one of the most reliable ones, since it does not require any chemical modification of either component in the complex (i.e., neither of the receptor nor of the arrestin). Therefore, it is the only assay that can detect and semi-quantify interactions between native GPCRs and native arrestins. The caveat of this assay is of course that its reliability depends on the quality (specificity and sensitivity) of the utilized antibodies. Here, we describe a simple protocol for performing this co-IP assay to get a measurement of the steady-state levels of agonist-elicited GPCR–arrestin interaction in cells.


Interpretation and Use of the Western Blot Assay for Serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infections

Reported by: Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors and AIDS Program, Center for Infectious Diseases, Public Health Practice Program Office, Centers for Disease Control* The Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors (ASTPHLD) and CDC have collaborated in preparing this report. It includes a description of various interpretive criteria associated with the Western blot test for HIV-1, evaluates the sensitivity and specificity of these criteria as tools for public health practice, and provides recommendations for use of the Western blot and the manner in which to report results in order to provide clinicians and public health policy officials with useful information in their efforts to reach an accurate diagnosis for persons tested for HIV-1 infection. المقدمة

The development of sensitive and specific tests for antibody to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) progressed rapidly after this retrovirus was identified as the cause of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). These tests have been used for various purposes, including clinical diagnosis of HIV-1 infection--for symptomatic and asymptomatic patients in counseling and testing programs--for seroprevalence surveys, and for blood-donor screening.

Enzyme immunoassay (EIA) is the most widely used serologic test for detecting antibody to HIV-1. Serum samples that are repeatedly reactive in the EIA for HIV-1 antibody are then retested with a supplemental and more specific test, the most common of which is the Western blot (1-3). To date, only one commercial Western blot test (Du PontœPr) has been licensed by the Food and Drug Administration (FDA). The purpose of this report is to provide guidance for interpreting Western blot test results and their use in diagnosing HIV-1 infection. THE WESTERN BLOT ASSAY

The Western blot assay is a method in which individual proteins of an HIV-1 lysate are separated according to size by polyacrylamide gel electrophoresis. The viral proteins are then transferred onto nitrocellulose paper and reacted with the patient's serum. Any HIV antibody from the patient's serum is detected by an antihuman immunoglobulin G (IgG) antibody conjugated with an enzyme that in the presence of substrate will produce a colored band. Positive and negative control serum specimens are run simultaneously to allow identification of viral proteins.

Table 1 lists the major structural proteins coded for by the HIV genome. Antibodies to the HIV-1 major group-specific antigen (GAG) protein p24, and its precursor p55, are the earliest detected after infection by Western blot and tend to decrease or become undetectable with onset or progression of clinical symptoms (4-9). In contrast, antibodies to the envelope (ENV) precursor protein gp160 and the final ENV proteins (gp120 and gp41) can be detected in specimens from virtually all HIV-infected persons regardless of clinical stage (4-9). Antibodies to the polymerase (POL) gene products (p31, p51, and p66) are also commonly detected if these antigens are present on the Western blot strips. However, in a recent study, the protein with a mobility of 160 kilodaltons (kd) present in commercially available Western blots and in viral lysate antigen preparations was identified as a multimer of the gp41 protein (10,11). Furthermore, this study presented evidence that the reaction observed against the gp120 on certain Western blots may have resulted in part from a reaction with a multimeric form of the gp41. In fact, the true gp120 was shown to be absent from some commercial Western blot antigens. When these reagents were used, serum specimens with only gp41 antibodies produced bands at the 41-, 120-, and 160-kd positions. Interpretive Criteria

Although the overall sensitivity and specificity of the Western blot for detection of antibodies to the various viral proteins are high, there has been substantial debate regarding the interpretive criteria. The currently licensed Du Pont Western blot test specifies that the test result should be interpreted as positive only when the detected bands include p24 and p31, and gp41 or gp120/160 (12) (see Table 2). Conversely, a negative Du Pont Western blot test result requires the absence of any and all bands--not just viral-bands. All other patterns are regarded as indeterminate. This interpretation scheme maximizes the specificity of the assay and is mainly intended for use with samples from persons, such as blood donors, for whom there is usually little clinical or virologic information available. (Donated units of blood that are repeatedly reactive by EIA are discarded Western blot results are used to guide donor notification and deferral.) These criteria are not ideal for all situations, especially the testing of persons at increased risk for HIV infection, or with symptoms suggestive of this infection.

Alternative criteria have been proposed by various groups. ASTPHLD has proposed that a positive test result be defined by the presence of any two of the following bands: p24, gp41, and gp120/160 (13). The Consortium for Retrovirus Serology Standardization (CRSS) has defined a positive test result as the presence of either p24 or p31, plus a diffuse envelope band (i.e., gp41 or gp120/160) (14). The American Red Cross has defined a positive test result as greater than or equal to 1 band from each of the GAG, POL, and ENV gene-product groups (15). These three groups and DuPont all agree that an indeterminate result is the presence of any other band or bands that fail to meet the positive criteria, and that a negative result is the absence of all bands.

The criteria for a negative Western blot interpretation specify "no bands." This interpretation is essential because some observed bands may reflect the presence of antibodies to HIV regulatory proteins or may indicate partially processed or degraded viral structural proteins. Furthermore, different Western blots (commercial, as well as "in-house" preparations) and different virus-antigen preparations used to prepare Western blots may contain different numbers and concentrations of both viral-specific and contaminating cellular proteins that may have unpredictable molecular weights. Evaluation of Criteria

To compare the four sets of criteria for Western blot interpretation, CDC selected 424 serum samples on the basis of the patients' clinical status and EIA results only, and analyzed them using the licensed Du Pont Western blot test (CDC unpublished data). The samples were scored according to each of the criteria (Table 3). For all three categories with repeatedly reactive EIA test results, the Western blot results demonstrate that the ASTPHLD definition gives the highest percentage of positive and the lowest percentage of indeterminate results. The interpretive standards that require the identification of bands from each of the three groups of gene products tend to have indeterminate results for some AIDS and other symptomatic patients due to absence of antibodies to p24 (n=5) or to p31 (n=14) or absence of both types of antibodies (n=2). Since these patients clearly are infected with HIV, the three-gene-product approach to Western blot interpretation is not sensitive enough for public health or clinical practice.

The ASTPHLD/CDC criteria for a positive Western blot differ from the CRSS criteria in two ways: first, ASTPHLD/CDC deletes p31, a change that does not affect the sensitivity or specificity of the criteria (Table 3), and second, ASTPHLD/CDC adds "gp41 and gp120/160," a combination not interpreted as positive with the CRSS criteria. This latter combination of bands represents antibody to envelope glycoproteins only. In practice, this is a rare finding for asymptomatically infected persons, but it has been reported to be specific for HIV-infected persons and should be included in the positive criteria (9). However, when a Western blot test has only the multimeric form of gp41 and no true gp120 present, a serum sample would be scored as positive on the basis of the presence of antibody to a single envelope glycoprotein, gp41. HIV-1-infected persons with this profile have lost their antibodies to the GAG proteins and are usually symptomatic and do not present a diagnostic problem.

The ASTPHLD/CDC interpretive criteria for a negative result are identical to the FDA recommendation for blood-donor reentry or the Western blot interpretive criteria that are specified in the licensed Western blot kit package insert. توصيات

On the basis of the results described above, CDC concurred with the ASTPHLD criteria and recommends their use in public health and clinical practice.

Laboratories should report test results as positive, indeterminate, or negative. The Public Health Service recommends that no positive test results be given to clients/patients until a screening test has been repeatedly reactive (i.e., greater than or equal to two tests) on the same specimen and a supplemental, more specific test such as the Western blot has been used to validate those results (3). Upon request, laboratory reports may also contain a list of the bands detected and reference to the interpretive criteria the laboratory uses. Because of the variability of unlicensed reagents, laboratories using non-FDA-licensed Western blots should compare, on a routine basis, their tests with the FDA-licensed Western blot kit using well-characterized serum specimens.

Clinical diagnosis and follow-up of patients is the responsibility of the clinical practitioner. Serologic test results are but one contribution to a patient's data base, which contains medical history (including high-risk behavior or exposure to HIV), results of physical examination, and other clinical findings. Clinicians must consider the total profile for a client when attempting to make a diagnosis after indeterminate Western blot results have been obtained. Accurate diagnosis for such persons can be challenging--and the challenge can be complicated by the tendency of some clients to become distressed by the apparent "uncertainty" of their test results.

Clinical follow-up of patients with indeterminate Western blot results may require many months of observation, interviewing, and testing. Most indeterminate patterns involve p18 (also referred to as p17), p24, or p55, or any combination of these three proteins (16-18). In one study of 390 "atypical" or indeterminate samples, 53% reacted against p24, with or without p18 or p55 47% reacted against p18 (but not p24), with or without p55 (18).

Some indeterminate results may be obtained with serum samples from persons who are in the process of seroconverting. A compilation of 209 volunteer blood donors with GAG-only indeterminate Western blot results were followed for as long as 2 years (17-21). During that time, only five of 134 persons who had initially reacted to p24 developed additional bands on the Western blot test. None of the 75 persons who initially reacted against p18 (but not p24) developed additional bands. The five persons who did seroconvert had positive results when their first follow-up samples were tested. The intervals between initial and follow-up tests were 8 weeks (two persons), 20 weeks (two persons), and 32 weeks (one person). The three longest intervals reflected delays in follow-up testing and not the actual time to seroconversion. These results do not refute earlier findings that seroconversion typically occurs within 3 months of infection (5,22). The importance of careful risk assessment for persons with indeterminate Western blot patterns was reemphasized when in one study (18) two of three people who initially had indeterminate results (but later seroconverted) disclosed histories of risk behavior when they were reinterviewed during follow-up.

A person whose Western blot test results continue to be consistently indeterminate for at least 6 months--in the absence of any known risk factors, clinical symptoms, or other findings--may be considered to be negative for antibodies to HIV-1. Such persons should be reassured that they are almost certainly not infected with HIV-1. However, no large-scale studies have been done to provide virologic data to confirm independently the serologic findings from the studies of clients whose Western blot test results are consistently indeterminate. In contrast, an asymptomatic person who has an indeterminate Western blot test result and a history of possible exposure to or symptoms compatible with HIV infection requires additional diagnostic follow-up. This should include conducting serial Western blot testing, assessing the function of the individual's immune system, and eliciting the cooperation of the person's sexual and needle-sharing partners to determine whether they are infected. Individuals with a pattern of indeterminate Western blot test results should not donate blood or plasma for either transfusion or use in manufactured blood products.

As the HIV/AIDS epidemic continues, additional tests of higher specificity will be needed to decrease the number of false-positive reactions and to permit correct diagnosis of HIV infection in a larger spectrum of clinical situations in which an indeterminate antibody profile exists. The use of new antibody tests based on antigens derived by recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) technology or the application of DNA probe technology--particularly DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR)--already shows promise in this area (23).

مراجع

Centers for Disease Control. Provisional public health service

inter-agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing acquired immunodeficiency syndrome. MMWR 198534:1-5.

2. Centers for Disease Control. Public health service guidelines for counseling and antibody testing to prevent HIV infection and AIDS. MMWR 198736:509-15.

3. Centers for Disease Control. Update: Serologic testing for antibody to human immunodeficiency virus. MMWR 198836:833-40, 845.

4. Lange JMA, Coutinho RA, Krone WJA, et al. Distinct IgG recognition patterns during progression of subclinical and clinical infection with lymphadenopathy associated virus/human T lymphotropic virus. Brit Med J 1986292:228-30.

5. Esteban JI, Shih JW, Tai CC, et al. Importance of Western blot analysis in predicting infectivity of anti-HTLV-III/LAV positive blood. Lancet 19852:1083-6.

6. Goudsmit J, Lange JMA, Paul DA, et al. 1987. Antigenemia and antibody titers to core and envelope antigens in AIDS, AIDS-related complex, and subclinical human immunodeficiency virus infection. J Infect Dis 1987155:558-60.

7. Lange JDA, Paul DA, Huisman HG, et al. Persistent HIV antigenemia and decline of HIV core antibodies associated with transition to AIDS. Brit Med J 1986293:1459-62.

8. Weber JN, Clapham PR, Weiss RA, et al. Human immunodeficiency virus infection in two cohorts of homosexual men: neutralizing sera and association of anti-gag antibody with prognosis. Lancet 1987i:119-21.


Maintain some integrity with NP-40 or Triton X-100 lysis buffer

NP-40 (Nonidet P-40) and Triton X-100 are milder, nonionic detergents. They are good at solubilizing membrane proteins and for isolating cytoplasmic proteins. Proteins retain their native state in the presence of these detergents and protein-protein interactions can be preserved. These buffers can be used for co-IPs.

NP-40 and Triton X-100 will not lyse nuclear membranes. After lysis, pellet the nuclei by centrifugation and transfer the supernatant to a new tube. If you wish to isolate both the nuclear and soluble fractions, resuspend the nuclear pellet in RIPA buffer.

NP-40 is also marketed under the name Igepal CA-630.

NP-40/Triton X-100 lysis buffer : 50 mM Tris•HCl, pH 8.5, 150 mM NaCl*, 1% detergent*

*The concentrations of salts and detergents can be altered to optimize protein recovery.


Primary antibodies and determining specificity

The principle of the WB is the detection of protein(s) through the binding and recognition of antibodies (Ab) to one or more targets this interaction should be highly specific between a portion of the antigen (protein) or epitope and the specific recognition sites found on the fragment antigen-binding (Fab) region of the antibody termed a paratope (Kurien et al., 2011 ) (Fig. 1). The 1°Ab should be thoroughly assessed and validated to be specific and sensitive enough to detect the intended target protein. It is important to check that the antibody is specific toward the native or denatured protein, as the denaturing treatment of protein samples prior to SDS-PAGE may alter the exposure and availability of the epitope, affecting antibody binding affinity. In some cases, it may be necessary to use “native-specific” monoclonal antibodies (Tino et al., 2000 ). The targeted peptide sequence may be available from the supplier to allow confirmation of specificity and region of binding however, occasionally this may be unavailable proprietary information. Traditionally 1°Ab are produced through immunization of the host using purified target proteins, whereas modern approaches utilize synthetic peptides, often producing Ab toward short denatured 8–10 amino acid sequences. Isolation and purification is generally achieved through affinity chromatography isolating antibodies and small proteins and/or anion-exchange filtration depending on the class (i.e., IgG, IgM) (Clezardin et al., 1986 ). Predicted and confirmed species cross-reactivity information is often only available through the vendor however, binding will entirely depend on the antigen region. When choosing a 1°Ab, there may be multiple forms available from different vendors, ideally each would bind to a unique antigen upon the protein of interest, allowing accurate assessment of the protein's abundance. However, this is often not the case, and assessment of the previous literature utilizing that antibody is strongly advised. Some proteins may be orthologous and contain the same or similar sequence to other species. Thus, if a 1°Ab is specific to an epitope with this sequence, it may be used to probe other species (i.e., GAPDH 1°Ab may be used on human, rat, and mouse tissue). Depending on the protein of interest, extensive testing of multiple antibodies may have already been undertaken, allowing the most suitable antibody to be selected. For example, the VDR has low expression within skeletal muscle, and in order to find a 1°Ab capable of detecting it by WB and immunofluorescence, extensive validation of a panel of multiple 1°Abs was required (Wang et al., 2010 ). The identification of a highly specific VDR 1°Ab (D-6 Santa Cruz Biotechnology, Cambridge, UK) was confirmed and is believed to be the most representative. Assessment of new antibodies for a target antigen requires even more careful testing, including the use of a variety of appropriate positive and negative controls (discussed below).

Specificity and performance of the 1°Ab antibody is also dependent on whether it is monoclonal (mAb) or polyclonal (pAb). Both have disadvantage/advantage pAb are produced from differing B-cell lineages, recognizing multiple epitope regions on an antigen. They are generally more cost-effective (Lipman et al., 2005 ) and provide more antibody molecules that can target the protein of interest, producing potentially a greater level of sensitivity upon analysis (MacPhee, 2010 ). However, their specificity can also be compromised, due to greater possibility of non-specific binding (MacPhee, 2010 ). In contrast, mAb provide highly consistent and specific binding to a specific and known epitope on an antigen, as they are produced from a single cell lineage, raised against a single specific epitope (Lipman et al., 2005 MacPhee, 2010 ). Yet binding affinities of mAb can suffer if the epitope structure is affected in any way through denaturing or electrophoresis for example (Lipman et al., 2005 ).

Depending on the primary amino acid sequence of the target protein, similar epitopes may be present within degradation products or alternate isoforms, potentially presenting additional bands. Degradation products will migrate ahead of the band of interest, due to the decreased molecular weight. 1°Ab affinities toward alternative isoforms may not interfere with data interpretation if the bands are sufficiently separated (i.e., have different molecular weights). For example, certain antibodies toward P70 S6K1 (70 kDa), a critical protein in the mRNA translational initiation pathway and one of the most probed of all in the muscle and exercise field, may bind to the isoform P80 S6K (80 kDa). P80 S6K encodes a nuclear localization signal and contains an additional 23 amino acids and would be present above P70 S6K1 when blotted (Thomas, 1993 ). Nonetheless, sufficient electrophoretic separation between the two isoforms and appropriate controls may allow correct identification. For example, insulin-treated L6 myotubes increased P70 S6K1 phosphorylation (Somwar et al., 1998 ) but not P85 S6K allowing, in this instance, identification of the correct band nonetheless, this does not guarantee specificity. However, the assessment of a bands molecular weight may not always be suitable, as some proteins may migrate to a non-predictable region. For instance, the mTOR regulator REDD1 has a predicted molecular weight of 25 kDa however, it is detectable at 35 kDa due to multiple lysine residues (increased positively charged residues) (Chang et al., 2009 ). This highlights the importance of knowing the migrating properties of the target protein, and if unexpected bands occur, literature investigation may be required.

In order to validate the specificity of a new 1°Ab, it should be tested against a positive lysate or purified protein control, giving a detectable band at the correct molecular weight and a negative sample from a tissue known not to express the intended target [The Human Atlas provides reliable protein expression data (http://www.proteinatlas.org)], resulting in no detectable band. Sometimes, it may be appropriate to include a specific knock-in/out (e.g., via shRNA or siRNA) sample to allow confirmation of a target within the same tissue type. For example, overexpression of AKT isoforms (an essential signaling protein for muscle hypertrophy/atrophy) within rat skeletal muscle following shRNA produced detectable bands at the predicted molecular weight (

40 kDa) compared with control samples (Cleasby et al., 2007 ). Conversely, knockdown of AKT, again within skeletal muscle, demonstrated a reduction in band intensity at the same molecular weight compared with control samples. Similarly protein inhibitors (e.g., LY294002, rapamycin, etc.) known to block specific phosphorylation pathways can be used. For example, the addition of LY294002 to cultured cells inhibits PI(3)K, resulting in decreased phosphorylation of down-stream intermediates (i.e., AKT/P70 S6K1) (Rommel et al., 2001 ). Thus, if probing for phosphorylated P70 S6K1, cultured L6 cells treated with/without insulin and LY294002 will provide a robust positive (greater band intensity) and negative control (reduced intensity), respectively, compared with untreated samples. In this instance, the inclusion of an untreated sample alongside an inhibited negative control will confirm the reduction in band intensity is in fact due to decreased expression, rather than a loss of detection. Despite rigorous testing of antibodies with appropriate positive/negative controls, additional bands may still be present or insufficiently separated making identification and quantitation of the correct band (if present) unreliable. Absolute confirmation of the presence of a protein in a given band may be achieved by mass spectrometry via determination of the peptide sequence (Trauger et al., 2002 ). Briefly, the band of interest is excised and the mixture of proteins digested by trypsin into small peptide sequences capable of being sequenced by liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/MS). Utilizing this approach, however, requires access to highly specific and costly equipment and technical expertise, but can provide validation of antibody specificity. Ultimately, positive and negative controls will help establish the degree of non-specific binding and potential false-positive bands, along with the confirmation of increased/decreased protein expression, giving confidence that the highlighted band is indeed the correct one.


Western blot protocol

Reviewed December 14 2020

Western blotting is a technique that uses specific antibodies to identify proteins that have been separated based on size by gel electrophoresis. The immunoassay uses a membrane made of nitrocellulose or PVDF (polyvinylidene fluoride). The gel is placed next to the membrane and the application of an electrical current induces the proteins to migrate from the gel to the membrane. The membrane can then be further processed with antibodies specific for the target of interest and visualized using secondary antibodies and detection reagents.

محتويات

View our western blot protocol video below.

For other video protocols please visit our video protocols library here.

​​If you are looking to build up your skills in western blot analysis, check out our free on-demand western blot training.

​Solutions and reagents: lysis buffers

These buffers may be stored at 4°C for several weeks or aliquoted and stored at -20°C for up to a year.

NP-40 buffer

  • 150 mM NaCl
  • 1.0% NP-40 (possible to substitute with 0.1% Triton X-100)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • مثبطات الأنزيم البروتيني

RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)

  • 150 mM NaCl
  • 1% IGEPAL CA-630
  • 0.5% sodium deoxycholate
  • 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • مثبطات الأنزيم البروتيني

Tris-HCl

​ Solutions and reagents: running, transfer, and blocking buffers

​Laemmli 2X buffer/loading buffer

  • 4% SDS
  • 10% 2-mercaptoethanol
  • 20% glycerol
  • 0.004% bromophenol blue
  • 0.125 M Tris-HCl

Check the pH and adjust to 6.8

Running buffer (Tris-Glycine/SDS)

Check the pH and adjust to 8.3

Transfer buffer (wet)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • 20% methanol
  • Check the pH and adjust to 8.3

For proteins larger than 80 kDa, we recommend that SDS is included at a final concentration of 0.1%.

Transfer buffer (semi-dry)

  • 48 mM Tris
  • 39 mM glycine
  • 20% methanol
  • 0.04% SDS

Blocking buffer

3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)

Add to TBST buffer. Mix well and filter. Failure to filter can lead to spotting, where tiny dark grains will contaminate the blot during color development.

​Sample lysis

​Preparation of lysate from cell culture

  1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice-cold PBS.
  2. Aspirate the PBS, then add ice-cold lysis buffer (1 mL per 10 7 cells/100 mm dish/150 cm 2 flask 0.5 mL per 5x10 6 cells/60 mm dish/75 cm 2 flask).
  3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper, then gently transfer the cell suspension into a pre-cooled microcentrifuge tube. Alternatively, cells can be trypsinized and washed with PBS prior to resuspension in lysis buffer in a microcentrifuge tube.
  4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.
  5. Centrifuge in a microcentrifuge at 4°C. You may have to vary the centrifugation force and time depending on the cell type a guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined for your experiment (leukocytes need very light centrifugation).
  6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

​Preparation of lysate from tissues

  1. تشريح الأنسجة ذات الأهمية بأدوات نظيفة ، ويفضل أن يكون على الجليد ، وبأسرع ما يمكن لمنع التحلل بواسطة البروتياز.
  2. Place the tissue in round-bottom microcentrifuge tubes or Eppendorf tubes and immerse in liquid nitrogen to snap freeze. تخزين العينات في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا أو الاحتفاظ بها على الجليد من أجل التجانس الفوري. ل

Sample preparation

  1. Remove a small volume of lysate to perform a protein quantification assay. Determine the protein concentration for each cell lysate.
  2. Determine how much protein to load and add an equal volume 2X Laemmli sample buffer.​

​Loading and running the gel

  1. Load equal amounts of protein into the wells of the SDS-PAGE gel, along with a molecular weight marker. Load 20–30 μg of total protein from cell lysate or tissue homogenate, or 10–100 ng of purified protein.
  2. Run the gel for 1–2 h at 100 V.

تيhe time and voltage may require optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. A reducing gel should be used unless non-reducing conditions are recommended on the antibody datasheet.

The gel percentage required is dependent on the size of your protein of interest:

Protein size

Gel percentage

Gradient gels can also be used.

​Transferring the protein from the gel to the membrane

The membrane can be either nitrocellulose or PVDF. Activate PVDF with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer before preparing the stack. The time and voltage of transfer may require some optimization. We recommend following the manufacturer’s instructions. Transfer of proteins to the membrane can be checked using Ponceau S staining before the blocking step.

Prepare the stack as follows:

Figure 1. Example of prepared stack.

تلطيخ الجسم المضاد

  1. Block the membrane for 1 h at room temperature or overnight at 4°C using blocking buffer.
  2. Incubate the membrane with appropriate dilutions of primary antibody in blocking buffer. We recommend overnight incubation at 4°C other conditions can be optimized.
  3. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  4. Incubate the membrane with the recommended dilution of conjugated secondary antibody in blocking buffer at room temperature for 1 h.
  5. Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.
  6. For signal development, follow the kit manufacturer’s recommendations. Remove excess reagent and cover the membrane in transparent plastic wrap.
  7. Acquire image using darkroom development techniques for chemiluminescence, or normal image scanning methods for colorimetric detection.

Useful links

All lanes: beta Actin antibody - loading control (ab8227) at 1/5000 dilution

Lane 1: HeLa whole cell extract
Lane 2: Yeast cell extract
Lane 3: Mouse brain tissue lysate

Protocols are provided by Abcam “AS-IS” based on experimentation in Abcam’s labs using Abcam’s reagents and products your results from using protocols outside of these conditions may vary.

Webinar transcript​

The purpose of western blotting is to separate proteins on a gel according to the molecular weight. The proteins are then transferred onto a membrane where they can be detected using antibodies. Heat the samples and 95 degrees C for five to 10 minutes in a sample buffer containing a reducing agent such as beta-mercaptoethanol. This results in linearized proteins with a negative charge proportional to their size.

Place a gel into the electrophoresis tank and add in buffer, ensuring the tops of the wells are covered. Acrylamide percentage of the gel being used depends on the molecular weight of the target protein. Node a molecular weight market into the first lane then load the samples into adjacent wells. All the samples which contained equal amounts of protein. Once all the samples are loaded, ad running buffer, place the lid onto the electrophoresis tank. Turn on the power supply and set the voltage recommended by the manufacturer of the gels in the gel tank. You should be able to see bubbles rising through the tank. Run the gel until the die front has moved sufficiently down the gel.

The next stage is to transfer the proteins from the gel onto a membrane. Membranes are usually made from nitrocellulose or PVDF. Remove the gel from the tank and carefully release it from its plastic case. Cut up the wells and the gel foot and place the gel into transfer buffer. Prepare the transfer stack by sandwiching the membrane and gel between filter paper and sponges. The membrane should be traced to the positive electrode and the gel closest to the negative electrode. Use a small roller to remove any bubbles between the gel and the membrane. Cap the transfer case closed and submerge into a transfer tank containing transfer buffer. Add water to the outer chamber to keep the system cool and put on the lid. Turn on the power supply to begin protein transfer. Time and voltage require optimization, so check the manufacturer's instructions for guidance.

Now that the proteins have migrated from the gel onto the nitro cellulose membrane, the protein of interest can be detected as an antibody. The membrane can be removed from the cassette and the molecular weight market should now be visible. If required, the transfer of proteins can be confirmed by staining the membrane with [inaudible 00:04:40] solution. To prevent nonspecific binding of the antibody, the membrane needs to be blocked. Pour blocking buffer onto the membrane and agitate gently on a rocker. Typically, this is done using a solution of five percent milk or bovine serum albumin, BSA, for two hours at room temperature or overnight at four degrees. The time and type of blocking buffer should be optimized, so check the data sheet of the primary antibody you intend to use for details.

After the membrane is blocked, remove the blocking buffer and add the diluted primary antibody in the same solution. Incubate on the rocker as before. Typically primary antibody incubations are for one hour at room temperature or overnight at four degrees C. Antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Refer to the antibody datasheet for guidance. Pour off the primary antibody and rinse the membrane twice in wash buffer. Follow with one 15 minute wash and three 10 minute washes on a rocker. The wash buffer is usually Trys buffered saline, TBS, or phosphate buffered, saline, PBS, with 0.1 percent tween 20.

Pour off the wash buffer and incubate the membrane in conjugating secondary antibody which has been diluted in blocking buffer. Usually this is done for one hour at room temperature, but antibody concentration and incubation time will need to be optimized. Pull off the secondary antibody and wash the membrane has shown previously.

There are several different systems for detection. If the secondary antibodies conjugate into an enzyme, incubate the membrane in the appropriate substrate before imaging. If the secondary antibodies are fluorescent counjugates then you can move directly onto the imaging step. Imaging can be carried out with x Ray film or with a digital imaging system. Place the membrane into an imaging tray. Place the imaging tray into imaging system. Exposure times will most likely need to be optimized in order to clearly detect the bands relating to the proteins of interest.


شاهد الفيديو: شرح مبسط عن Systems Tracts واستخدامها فى تحديد خزانات البترول. (كانون الثاني 2022).