معلومة

كيف يختلف الوزن الجزيئي للوحدة الفرعية عن الوزن الجزيئي الأصلي؟

كيف يختلف الوزن الجزيئي للوحدة الفرعية عن الوزن الجزيئي الأصلي؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد لاحظت أن الوزن الجزيئي الأصلي للإنزيم يختلف عن الوزن الجزيئي للوحدة الفرعية. لماذا هم مختلفون؟ أليست الجينات اللازمة للتعبير عن الإنزيم هو نفسه في الكائن الحي الأصلي وفي نظام التعبير غير المتجانسة؟

هل يحدث أن يؤثر نظام التعبير غير المتجانسة على الوزن الجزيئي لمنتج الإنزيم النهائي؟ إذا كان الأمر كذلك ، فكيف؟


تمت الإجابة على سؤالك في الورقة ، من المحتمل أن يكون البروتين موجودًا كجهاز homodimer في الجسم الحي وتمسخ (مثل الذي تم إجراؤه باستخدام SDS PAGE -> Western Blot) يفصل الثنائيات إلى مونومرات:

"لتحديد الهيكل الرباعي ، تم إجراء كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء لاستبعاد الحجم باستخدام نظام كروماتوجرافي سائل عالي الأداء من سلسلة Agilent 1100 مع عمود Bio-Sil SEC-250 (300 × 7.8 مم) ومرحلة متنقلة تبلغ 0.1 M Na2PO4 ، 0.15 مولار كلوريد الصوديوم ، و 0.01 مولار NaN3 ، ودرجة الحموضة 6.8. تم استخدام معيار Bio-Rad لتوحيد وقت استبقاء العمود فيما يتعلق بالكتلة الجزيئية (بيانات تكميلية). تم تكرار جميع التجارب مرتين مع <0.05 دقيقة من الانحراف في الاحتفاظ مرات. تم حساب الكتلة الجزيئية لـ XR من وقت الاحتفاظ بها إلى ∼53 كيلو دالتون. يمكن تحفيز الاستمالة في وجود 15 ٪ SDS ، مما يتسبب في إزالة XR كقمة واحدة ، مع وقت الاحتفاظ المقابل للكتلة الجزيئية من ∼34 كيلو دالتون. تشير البيانات إلى أن XR الأصلي عبارة عن ثنائى غير متكافئ مرتبط. الاختلاف الكبير بين الوزن الجزيئي المحسوب للديمر ووزنه الجزيئي الظاهر ليس نادرًا بالنسبة لـ XR من الأنواع الأخرى (7 ، 21 ، 33) ، والتي توجد أيضًا عادةً على شكل ثنائيات. ومع ذلك ، للتأكد من حجم البروتين ، تم إخضاع N. crassa XR لتحليل الكتلة عن طريق التأين بالرش الكهربائي - زمن رباعي من قياس الطيف الكتلي للطيران. كانت أعلى ذروة الوفرة تبلغ 38381 م / ض ، تتوافق تمامًا مع الكتلة الجزيئية المتوقعة لـ XR ذات العلامات 6 مع إزالة N-terminal fMet (بيانات تكميلية). بالإضافة إلى ذلك ، فإن ذروة 2M + التي تبلغ وفرتها حوالي 20٪ عند 76،759 m / z تتوافق جيدًا مع الكتلة المتوقعة للشكل الخافت للإنزيم (76،762 Da). "


النشاف الغربي: لماذا تختلف الأوزان الجزيئية المرصودة والمحسوبة؟

النشاف الغربي هو طريقة معملية مستخدمة على نطاق واسع لاكتشاف جزيئات بروتينية معينة في تجانس الأنسجة أو محللة الخلية. عادةً ما يتضمن فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) ، ونقله إلى دعامة صلبة [بوليفينيلدين ثنائي فلوريد (PVDF) أو غشاء نيتروسليلوز] ، واكتشاف البروتين محل الاهتمام باستخدام الأجسام المضادة. يمكن تحديد حجم البروتين من خلال الفصل عن طريق الرحلان الكهربائي - تهاجر البروتينات الأصغر بشكل أسرع من البروتينات الأكبر حجمًا. ثم يتم تقدير حجم البروتين من معايير الوزن الجزيئي ، ويسمى & quot؛ الوزن الجزيئي المرصود & quot.

يتم تحديد الوزن الجزيئي المحسوب (أو المتوقع) للبروتين عن طريق إضافة الأوزان الجزيئية الفعلية للأحماض الأمينية الفردية في بروتين معين. يختلف الوزن الجزيئي المحسوب أحيانًا عن الوزن الذي لوحظ في البقعة الغربية. يمكن أن تساهم عدة عوامل في الاختلاف بين الأوزان الجزيئية المرصودة والمحسوبة.


خميرة بيروفات كيناز. الوزن الجزيئي الأصلي والوحدة الفرعية

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للانتباه الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.


Romling، U. & amp Galperin، M. Y. التخليق الحيوي للسليلوز البكتيري: تنوع العوامل والوحدات الفرعية والمنتجات والوظائف. اتجاهات ميكروبيول. 23, 545–557 (2015).

هولينبيك ، إي سي وآخرون. فسفويتانولامين السليلوز يعزز الالتصاق الممرض البولي الإشريكية القولونية للخلايا الظهارية في المثانة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 115, 10106–10111 (2018).

Thongsomboon، W. et al. سليلوز فسفويثانولامين: سليلوز معدّل كيميائيا طبيعيا. علم 359, 334–338 (2018).

Anderson، A.C، Burnett، A.JN، Hiscock، L.، Maly، K.E & amp Weadge، J. T. The الإشريكية القولونية الوحدة الفرعية سينثاز السليلوز G (BcsG) عبارة عن ترانسفيراز زنك 2+ يعتمد على فسفويثانولامين. J. بيول. تشيم. 295, 6225–6235 (2020).

Keegstra ، K. جدران الخلايا النباتية. نبات فيزيول. 154, 483–486 (2010).

Mélida، H.، Sandoval-Sierra، J. V.، Diéguez-Uribeondo، J. & amp Bulone، V. تكشف تحليلات الكربوهيدرات خارج الخلية في الفطريات البيض عن وجود ثلاثة أنواع مختلفة من جدار الخلية. حقيقيات النوى. زنزانة 12, 194–203 (2013).

McCrate ، O.A ، Zhou ، X. ، Reichhardt ، C. & amp Cegelski ، L. مجموع الأجزاء: تكوين وبنية المصفوفة البكتيرية خارج الخلية. جيه مول. بيول. 425, 4286–4294 (2013).

Stewart، P. & amp Costerton، J. مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية في الأغشية الحيوية. لانسيت 358, 135–138 (2001).

سنار ، ب دي وآخرون. هيدرولازات الجليكوسيد الميكروبية كعوامل مضادة للغشاء الحيوي مع نشاط عبر المملكة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114, 7124–7129 (2017).

إيغوتشي ، إم ، ياماناكا ، إس آند بوديونو ، إيه. السليلوز البكتيري تحفة فنية من فنون الطبيعة. جيه ماتر. علوم. 35, 261–270 (2000).

Morgan، J.، Strumillo، J. & amp Zimmer، J. لقطة بلورية لتخليق السليلوز وانتقال الغشاء. طبيعة سجية 493, 181–186 (2013).

McNamara ، J. T. ، Morgan ، J.L W. & amp Zimmer ، J. وصف جزيئي لتخليق السليلوز الحيوي. Annu. القس Biochem. 84, 17.11–17.27 (2015).

مورجان ، جي إل دبليو ، ماكنمارا ، جي تي وأمبير زيمر ، J. آلية تفعيل سينثيز السليلوز البكتيري بواسطة دوري GMP. نات. هيكل. مول. بيول. 21, 489–496 (2014).

Nojima، S. et al. التركيب البلوري لمجال التكرار الترادفي المرن للوحدة الفرعية لتخليق السليلوز البكتيري C. علوم. اعادة عد. 7, 13018 (2017).

Acheson ، J.F ، Derewenda ، Z. S. & amp Zimmer ، J. هندسة قناة الغشاء الخارجي السليلوز سينثيز وارتباطها بمجال TPR المحيطي. بنية 27، 1855-1861 هـ 3 (2019).

Mazur، O. & amp Zimmer، J. J. بيول. تشيم. 286, 17601–17606 (2011).

ياسوتاكي ، واي وآخرون. التوصيف الهيكلي لـ زايلينوم أسيتوباكتر endo-β-1،4-glucanase CMCax المطلوب للتخليق الحيوي للسليلوز. البروتينات 64, 1069–1077 (2006).

Zouhir، S.، Abidi، W.، Caleechurn، M. & amp Krasteva، P. V. هيكل وتعدد المهام لمنظم إفراز السليلوز c-di-GMP-sensing BcsE. مبيو 11، e01303-20 (2020).

فانغ ، إكس وآخرون. GIL ، مجال بروتين جديد ملزم لـ c-di-GMP يشارك في تنظيم تخليق السليلوز في البكتيريا المعوية. مول. ميكروبيول. 93, 439–452 (2014).

Le Quéré، B. & amp Ghigo، J.-M. BcsQ هو عنصر أساسي في الإشريكية القولونية جهاز التخليق الحيوي للسليلوز الذي يتمركز في قطب الخلية البكتيرية. مول. ميكروبيول. 72, 724–740 (2009).

صن ، ل. وآخرون. التوصيف الهيكلي والوظيفي للوحدة الفرعية BcsG لمركب السليلوز في السالمونيلا تيفيموريوم. جيه مول. بيول. 430, 3170–3189 (2018).

كراستيفا ، ب.ف.آخرون. نظرة ثاقبة في هيكل وتجميع نظام إفراز السليلوز البكتيري. نات. كومون. 8, 2065 (2017).

Thongsomboon، W.، Werby، S. H. & amp Cegelski، L. تقييم إنتاج الفوسفويثانولامين السليلوز بين المجتمعات البكتيرية باستخدام مضان أحمر الكونغو. J. باكتيريول. 202، e00030-20 (2020).

Omadjela، O. et al. يشكل BcsA و BcsB النواة النشطة تحفيزيًا لمركب السليلوز البكتيري الكافي لتخليق السليلوز في المختبر. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 110, 17856–17861 (2013).

Du، J.، Vepachedu، V.، Cho، S.H، Kumar، M. & amp Nixon، B. T. Gluconacetobacter hansenii بدقة 23.4. بلوس واحد 11، e0155886 (2016).

Clairfeuille، T. et al. هيكل عديدات السكاريد الدهنية الأساسية للغشاء الداخلي - معقد PbgA. طبيعة سجية 584, 479–483 (2020).

Fan ، J. ، Petersen ، E. M. ، Hinds ، T. R. ، Zheng ، N. & amp Miller ، S. I. هيكل بروتين الغشاء الداخلي المطلوب للزيادات التي تنظمها PhoPQ في الغشاء الخارجي cardiolipin. مبيو 11، e03277–19 (2020).

أناندان ، إيه وآخرون. هيكل الدهون أ فوسفويثانولامين ترانسفيراز يقترح كيف أن التغييرات التوافقية تحكم ربط الركيزة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114, 2218–2223 (2017).

Ghosal، D.، Trambaiolo، D.، Amos، L.A & amp Lowe، J. تشكل بروتينات انقسام الخلايا MinCD خيوطًا متناوبة للخلايا المشتركة. نات. كومون. 5, 5341 (2014).

Lackner، L.L، Raskin، D.M & amp de Boer، P. A. الإشريكية القولونية البروتينات الدقيقة والغشاء الفسفوليبيد في المختبر. J. باكتيريول. 185, 735–749 (2003).

نيكسون ، ب ت وآخرون. يدعم التحليل الهيكلي والحاسبي المقارن ثمانية عشر مركبًا تركيبيًا من السليلوز في مجمع تخليق السليلوز النباتي. علوم. اعادة عد. 6, 28696 (2016).

روس ، ب وآخرون. تنظيم تخليق السليلوز في زايلينوم أسيتوباكتر بواسطة حمض الديجوانيليك الدوري. طبيعة سجية 325, 279–281 (1987).

أبراج ، A. J. ، Bohannon ، J. ، Gehrig ، S.M & amp Rainey ، P. B. تألق الزائفة تتطلب آلة رش التجاعيد SBW25 شكلاً من أشكال الأسيتيل من السليلوز.مول. ميكروبيول. 50, 15–27 (2003).

مارمونت ، إل إس وآخرون. يوجه البروتين الدهني قليل القسيمات PelC تصدير البيل عديد السكاريد عبر الغشاء الخارجي لـ الزائفة الزنجارية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114, 2892–2897 (2017).

Low، K. E. & amp Howell، P. L. آلات التخليق الحيوي للسكريات الخارجية المعتمدة على السينثاز سالبة الجرام. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 53, 32–44 (2018).

إصدار PYMOL Molecular Graphics System v.2.0 (Schroedinger، LLC، 2021)

بيترسن ، إي إف وآخرون. UCSF Chimera - نظام تصور للبحث والتحليل الاستكشافي. J. كومبوت. تشيم. 25, 1605–1612 (2004).

Edgar، R. C.MusCLE: محاذاة تسلسلات متعددة بدقة عالية وإنتاجية عالية. الدقة الأحماض النووية. 32, 1792–1797 (2004).

Waterhouse، A. M.، Procter، J.B، Martin، D. M.، Clamp، M. & amp Barton، G.J Jalview الإصدار 2 — محرر محاذاة تسلسل متعدد ومنضدة عمل التحليل. بيوينفورم. 25, 1189–1191 (2009).

Drozdetskiy ، A. ، Cole ، C. ، Procter ، J. & amp Barton ، G.J. JPred4: خادم تنبؤ ببنية ثانوية للبروتين. الدقة الأحماض النووية. 43، W389 – W394 (2015).


النتائج

لا تتأثر وظيفة الميتوكوندريا بانصهار العلامة الحيوية في محطة الكربوكسي

تم صنع نسختين من بروتين Cbp1-Bio: الاندماج الأول ، Bio1 ، يحتوي على موقع التعرف على رباعي الببتيد لعامل Xa protease (Nagai and Thogersen ، 1984) بين Cbp1 و Bio tag ، في حين أن الإصدار الثاني ، Bio2 ، يفتقر إلى العامل. موقع Xa. تم إدخال الاندماجات في CBP1 موقع الكروموسومات عن طريق استبدال الجينات (انظر المواد والطرق). نمت السلالات التي تحتوي على بروتينات Cbp1 الموسومة على الوسط المحتوي على الجلسرين YEPG بمعدلات مماثلة لسلالة النوع البري غير الموسومة S150 ، مما يشير إلى أن وظيفة الميتوكوندريا لم تتضرر في هذه السلالات (بياناتنا غير المنشورة).

استخلاص وقابلية الذوبان لـ Cbp1

لتحديد توطين Cbp1 داخل الميتوكوندريا ، تعطلت الميتوكوندريا من سلالة Bio1 عن طريق الصدمة التناضحية والصوتنة ، وتم فصل جزء المصفوفة القابل للذوبان عن جزء الغشاء غير القابل للذوبان عن طريق التنبيذ الفائق. تم تحليل البروتينات في كل من المادة الطافية القابلة للذوبان والحبيبات غير القابلة للذوبان بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي. باستخدام المخزن المؤقت الصوتي القياسي الذي يحتوي على 1 M KCl ، كان Cbp1 في جزء الغشاء غير القابل للذوبان. ومع ذلك ، عندما تم حذف KCl من المخزن المؤقت الصوتي ، و GT90 ٪ من Cbp1 كان في جزء المصفوفة القابلة للذوبان (الشكل 1A). كانت قابلية ذوبان Cbp1 مرتبطة عكسيًا بتركيز الملح في المخزن المؤقت الصوتي ، مما يشير إلى تفاعلات كارهة للماء بين مونومرات Cbp1 أو بين Cbp1 والبروتينات الأخرى.

شكل 1. استخلاص وقابلية الذوبان لـ Cbp1. (أ) تأثير الملح على استخلاص Cbp1 من الميتوكوندريا. تم تعطيل الميتوكوندريا المعزولة من سلالة Cbp1-Bio1 عن طريق الصوتنة في وجود تركيزات مختلفة من KCl. تم فصل البروتينات القابلة للذوبان (S) عن البروتينات غير القابلة للذوبان (P) عن طريق التنبيذ الفائق (انظر المواد والطرق). تم تحليل جميع الكسور بواسطة SDS-PAGE و Western blot باستخدام Neutravidin المقترن بـ HRP. العصابات تتوافق مع بروتين Cbp1-Bio1. (ب) تأثير صوتنة في غياب الملح على البروتينات الذائبة والغشاء. تم تعطيل الميتوكوندريا في المخزن المؤقت الذي يفتقر إلى الملح وتم طرده بالطرد المركزي كما هو موصوف في A. تم فحص البقع الغربية باستخدام Neutravidin للكشف عن Cbp1-Bio ، مع مضاد لـ Mdh1 ، ونزع هيدروجين مالات الميتوكوندريا ، ومع الأجسام المضادة أحادية النسيلة لـ Cox2. (ج) تأثير استخلاص الكربونات القلوية على Cbp1. تمت معالجة الميتوكوندريا بـ 100 ملي كربونات الصوديوم لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وتم فصل البروتينات القابلة للذوبان عن بروتينات الغشاء غير القابلة للذوبان عن طريق التنبيذ الفائق (انظر المواد والطرق). تم فحص البقع الغربية باستخدام Neutravidin لاكتشاف Cbp1-Bio ، مع مضاد لـ Mss51 ، وهو بروتين غشاء محيطي ، ومع الأجسام المضادة أحادية النسيلة لـ Cox2 ، وهو بروتين غشائي متكامل.

للتحقيق في كيفية ذوبان إنزيم مالات ديهيدروجينيز ، Mdh1 (Thompson and McAlister-Henn ، 1989) ، والبروتين الغشائي المتكامل السيتوكروم أوكسيديز الوحدة الفرعية II ، Cox2 (Tsukihara وآخرون. ، 1996) ، التي تم تقسيمها عند صوتنة الميتوكوندريا في غياب الملح ، تفاعلت البقع الغربية مع المصل المضاد لـ Mdh1 أو مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة لـ Cox2 (الشكل 1 ب). كما هو متوقع ، كان Mdh1 في المقام الأول في الجزء القابل للذوبان ، وكان Cox2 في المقام الأول في جزء حبيبات الغشاء.

تشير إمكانية إذابة Cbp1 عن طريق خطوة صوتنة بدون ملح إلى أن البروتين مرتبط محيطيًا بالغشاء. الطريقة التقليدية لاستخراج بروتينات الغشاء الخارجي هي معالجة أغشية الميتوكوندريا بالكربونات القلوية. بعد المعالجة بكربونات الصوديوم ، بقي Cbp1 في جزء الحبيبات غير القابل للذوبان ، بينما بروتين الغشاء الخارجي Mss51 (Decoster وآخرون. ، 1990 Siep وآخرون. ، 2000) في جزء قابل للذوبان (الشكل 1C). بقي بروتين الغشاء المتكامل Cox2 في جزء الحبيبات كما هو متوقع. على غرار النتائج مع KCl (الشكل 1A) ، عزز علاج الكربونات ، الذي يعطل التفاعلات الأيونية ، الارتباط بين Cbp1 والغشاء ، مما يشير إلى أن هذا الارتباط يتم في المقام الأول من خلال التفاعلات الكارهة للماء.

ركام Cbp1 المذاب في الملح

لفحص تأثير الملح على تراكم Cbp1 بعد الصوتنة ، تم تقسيم الجزء القابل للذوبان المحتوي على Cbp1 الذي تم الحصول عليه عن طريق الصوتنة بدون ملح بثلاث طرق ، وعولجت القسامات بدون ملح ، أو 150 ملي مولار أو 1 مولار كلوريد لمدة ساعة واحدة على الجليد . تم بعد ذلك الطرد المركزي للعينات لتكوير أي بروتينات مجمعة. في العينات المعالجة بالملح ، يتم تكوير Cbp1 بالجزء غير القابل للذوبان (الشكل 2 أ). في تجربة التحكم ، حيث تمت إضافة الماء بدلاً من KCl ، بقي Cbp1 في طاف قابل للذوبان. تدعم هذه النتيجة الفرضية القائلة بأن Cbp1 المذابة و / أو البروتينات المرتبطة بها لها رقعة كارهة للماء ، مما يتسبب في تراكم البروتينات عند إضافة الملح.

الشكل 2. الذوبان بعد صوتنة وترابط الغشاء في وجود الملح. (أ) قابلية ذوبان Cbp1 عند إضافة الملح بعد صوتنة. تم صوت الميتوكوندريا في المخزن المؤقت الذي يفتقر إلى KCl (S ، P). بعد الصوتنة والطرد المركزي الفائق ، تم تحضين قسامات الجزء القابل للذوبان (S) لمدة ساعة واحدة على الجليد باستخدام أي من H2O أو التركيزات المحددة من KCl. تم بعد ذلك طرد العينات فائقة المركزية ، وتم تحليل كل من المواد الطافية القابلة للذوبان (S) والكريات غير القابلة للذوبان (P) بواسطة SDS-PAGE و لطخة ويسترن باستخدام نيوترافيدين مقترن بـ HRP. (ب) تحليل تدرج السكروز لـ Cbp1 في جزء الحبيبات بعد صوتنة في المخزن المؤقت الذي يحتوي على الملح. تمت صوتنة الميتوكوندريا في محلول يحتوي على 1 مولار بوكل ، وتم طرده بالطرد المركزي ، وتم تعليق جزء الحبيبات وتحميله على تدرج سكروز بنسبة 40-70٪. تم جمع الكسور 1-14 وتحليلها بواسطة لطخة ويسترن. تم فحص اللطخة أولاً باستخدام Neutravidin-HRP للكشف عن Cbp1-Bio1. تم استنساخ اللطخة بمضاد مضاد لـ Mss51 ، والذي يكتشف بروتين غشاء الميتوكوندريا Mss51 (Siep وآخرون. ، 2000) والأجسام المضادة Cox2 ، التي تكشف عن بروتين الغشاء المتكامل Cox2 (المجسات الجزيئية). تم اكتشاف Cbp1-Bio1 و Mss51 و Cox2 بشكل كبير في الكسور 8 و 9 و 10.

يقترن Cbp1 بالأغشية عندما يتم سونيك الميتوكوندريا في المخزن المؤقت الذي يحتوي على الملح

Cbp1 قابل للذوبان عندما يتم صوت الميتوكوندريا في حالة عدم وجود الملح ، ولكن الشكل المذاب يتجمع عند إضافة الملح. قادنا هذا إلى التساؤل عما إذا كان بروتين Cbp1 الموجود في جزء الحبيبات بعد الصوتنة في وجود الملح مرتبطًا بالأغشية أو بكتلة غير قابلة للذوبان. لاستقصاء هذه النقطة ، تم إعادة تعليق جزء الحبيبات الميتوكوندريا الذي تم الحصول عليه بعد صوتنة في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 1 M KCl ، وغسيله ، ووضعه في طبقات على تدرج سكروز مستمر بنسبة 40-70٪. بعد الطرد المركزي ، تم تحليل الكسور المتدرجة بواسطة SDS-PAGE و Western blot. تم ربط Cbp1-Bio في موضع داخل التدرج النموذجي لأغشية الميتوكوندريا ، وتم اكتشاف Mss51 و Cox2 في نفس الكسور التي تحتوي على Cbp1-Bio (الشكل 2 ب). من المتوقع وجود تكتلات البروتين في كسور السكروز الثقيلة باتجاه قاع الأنبوب (أكرمان وتزاجولوف ، 1990). لذلك ، عندما يتم صوتنة الميتوكوندريا في وجود KCl ، يكون Cbp1-Bio في جزء الحبيبات بسبب ارتباطه بأغشية الميتوكوندريا.

تتم إزالة Cbp1 من عمود استبعاد الحجم في نطاق 900000-Da

لتحليل مستخلص الميتوكوندريا الخالي من الملح القابل للذوبان ، تم تجزئة المادة الطافية الصوتية على عمود Sephacryl S300. تمت مقارنة قيمة Ve / Vo المستخلصة لـ Cbp1 مع Ve / Vo للعديد من بروتينات العلامة التي تم استخدامها لمعايرة العمود. تتوافق ذروة Cbp1 عند الكسر 46 مع وزن جزيئي قدره 900 كيلو دالتون (الشكل 3 و A و B). يشير الوزن الجزيئي العالي لكسور الترشيح الهلامية التي تحتوي على Cbp1 إلى أن Cbp1 يرتبط ببروتينات الميتوكوندريا الأخرى. لاستكشاف ما إذا كان Cbp1 جزءًا من مجمع واحد أو أكثر ، تم تحليل الجزء القابل للذوبان الذي تم الحصول عليه عن طريق صوتنة الميتوكوندريا الخالية من الملح بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي الأزرق ، والذي يفصل معقدات البروتين بناءً على الحجم وتوزيع الشحنة على أسطحها (Schägger و von Jagow ، 1991 Schägger وآخرون. ، 1994). أظهر تحليل اللطخة المناعية للبعد الأصلي الأول أن Cbp1 تم اكتشافه في نطاق عالي الوزن الجزيئي (الشكل 4). تم ترحيل مركب نازعة هيدروجين الأيزوسترات بوزن جزيئي أصلي يبلغ 320 كيلو دالتون أسرع من مركب Cbp1 (الشكل 4). عندما تمت إضافة المنظف غير الأيوني laurylmaltoside إلى تركيز نهائي بنسبة 1٪ ، تفاعل Neutravidin المقترن بـ HRP مع العديد من نطاقات الوزن الجزيئي الأصغر بين 66 و 140 كيلو دالتون بالإضافة إلى النطاق 900 كيلو دالتون ، مما يشير إلى أن المركب المحتوي على Cbp1 متواضع حساسة للمعالجة بالمنظفات.

الشكل 3. تحليل الترشيح الهلامي لـ Cbp1-Bio1. (أ) رسم الخرائط الدقيقة لحجم شطف الذروة من الكسور المحتوية على Cbp1. تم فصل أجزاء الترشيح الهلامية 43-56 (المقابلة للحجم بالملليلترات ، Ve) من سلالة Cbp1-Bio1 بالكهرباء ، وتم مسحها ، وفحصها بحثًا عن وجود بروتين Cbp1-Bio1 مع نيوترافيدين مقترن بـ HRP. (ب) حساب الوزن الجزيئي للمركب المحتوي على Cbp1-Bio1. يوضح الرسم البياني لوغاريتم الأوزان الجزيئية (المحور ص) مقابل Ve / Vo لبروتينات العلامة المستخدمة لمعايرة العمود (المحور السيني). ترد الأسماء والأوزان الجزيئية للبروتينات المستخدمة في المعايرة على اليمين. يشار إلى موضع ذروة Ve / Vo للمركب المحتوي على Cbp1 – Bio1 بواسطة سهم وخط منقط.

الشكل 4. تحليل PAGE الأصلي الأزرق لـ Cbp1-Bio1. تعرضت بروتينات الميتوكوندريا القابلة للذوبان من سلالة Cbp1-Bio1 إلى الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي الأزرق. تم وضع حارة واحدة من الجل مع Coomassie Brilliant Blue R250 لتصور مجمعات البروتين (على اليسار). تم مسح الممرات الأخرى التي تحتوي على عينات متوازية وفحصها بجسم مضاد موجه ضد نازعة هيدروجين الإيزوسيترات (IDH) أو باستخدام Neutravidin-HRP لاكتشاف Cbp1-Bio1. تمت إضافة Laurylmaltoside إلى عينة واحدة من مستخلص البروتين لتركيز نهائي قدره 1٪ قبل الرحلان الكهربائي (+ المنظفات).

تنقية Cbp1-Bio1 بواسطة كروماتوجرافيا التقارب وشطف البروتياز العامل Xa

تمت تنقية Cbp1-Bio1 عن طريق امتصاص المستخلص القابل للذوبان على حبيبات مغناطيسية مطلية بالستربتافيدين. حبات كثف العديد من البروتينات المختلفة من كل من النوع البري ومقتطفات Cbp1-Bio1 (الشكل 5A ، جزء منضم). كانت أنماط البروتين متطابقة باستثناء عدد قليل من العصابات الملطخة بالفضة ، والتي تم اكتشافها فقط في مستخلص Cbp1-Bio1. واحد من هؤلاء كان له حجم متوقع لـ Cbp1-Bio1. في لطخة غربية من هلام مكرر ، تفاعلت هذه الفرقة مع نيوترافيدين ، مؤكدة أنها Cbp1-Bio1. كل بروتين Cbp1-Bio1 في الجزء القابل للذوبان المرتبط بالخرز. تم أيضًا امتصاص نوعين من البروتينات الأخرى من 120 و 45 كيلو دالتون والتي إما أن تكون بيوتينيلات أو تحتوي على عزر بروتين مع تقارب للستربتافيدين على مصفوفة التقارب (الشكل 5 ب ، جزء منضم).

الشكل 5. تنقية Cbp1-Bio1 على حبات مغناطيسية مطلية بالستربتافيدين. (أ) تصور أنماط البروتين عن طريق تلطيخ. تم السماح لبروتينات الميتوكوندريا القابلة للذوبان من السلالة غير الموسومة (WT) أو سلالة Cbp1-Bio1 (-Bio) بالامتزاز على حبات مغناطيسية مطلية بالستربتافيدين. تم فصل البروتينات التي تم امتصاصها عن البروتينات التي لم يتم امتصاصها باستخدام المغناطيس. تم غسل الحبيبات ثم غليها في محلول تحميل جل. تم فصل الكسور المربوطة وغير المربوطة على هلام أكريلاميد مغير طبيعة بنسبة 7.5٪. العينات التي تحتوي على الجزء الأصلي القابل للذوبان (جزء قابل للذوبان) ، أو البروتينات التي لا تمتص للخرز (جزء غير منضم) ملطخة بـ Coomassie Blue. تم تلوين عينات من المادة الملتصقة بحبات الستربتافيدين (جزء مرتبط) بنترات الفضة. (ب) تحليل لطخة غربية. تم تحليل هلام مكرر لتلك الموضح في A بواسطة لطخة غربية باستخدام Neutravidin المقترن بـ HRP.

تمت إزالة Cbp1-Bio1 من الحبيبات بالمعالجة بعامل Xa البروتياز. كعنصر تحكم ، تم امتصاص المستخلص المحتوي على Cbp1-Bio2 ، الذي يفتقر إلى موقع العامل Xa ، على حبيبات نيوترافيدين ومعالجته بعامل Xa. أظهر تحليل لطخة غربية و SDS-PAGE أن Cbp1-Bio2 ظل مرتبطًا بالخرز بعد هضم البروتياز ، بينما تم إطلاق Cbp1-Bio1 بكفاءة من الخرزات عن طريق العلاج بالبروتياز (الشكل 6 أ). كشف جل مكرر ملطخ بالفضة عن 10 نطاقات بروتين على الأقل كانت موجودة في جزء عامل Xa-eluted من حبات Cbp1-Bio1 الممتزة ولكنها غائبة عن Cbp1-Bio2 وكسور من النوع البري غير الموسومة Xa (الشكل 6 ب). قدرت البروتينات الفريدة للعينة المعالجة بالبروتياز الأوزان الجزيئية النسبية بـ 110 و 85 و 68 كيلو دالتون ، وكان العديد منها في نطاق 40 إلى 50 كيلو دالتون. بروتين 68 كيلو دالتون من الحجم الصحيح ليكون Cbp1.

الشكل 6. شطف Cbp1-Bio1 من حبات الستربتافيدين باستخدام بروتياز العامل Xa. (أ) تحليل لطخة غربية للبروتينات المزال. تمت معالجة الكسور المرتبطة بالستربتافيدين من مستخلصات الميتوكوندريا من WT و Cbp1-Bio1 و Cbp1-Bio2 باستخدام بروتياز العامل Xa. البروتينات التي بقيت على حبات الستربتافيدين تمت استخلاصها تحت ظروف تغيير طبيعة. تم تحليل البروتينات بواسطة SDS-PAGE و Western blot باستخدام Neutravidin المقترن بـ HRP. (ب) تحليل وصمة عار الفضة للبروتينات التالفة. يُظهر الجل الملون بالفضة تركيبة البروتين لكسور النتوء التي تحتوي على البروتينات التي تم قطعها من الحبيبات باستخدام بروتياز العامل Xa ، والكسور التي ظلت مرتبطة بالخرز ، وكعناصر تحكم ، تم الحصول عليها بدون إضافة البروتياز. تتم الإشارة إلى عصابات البروتين الفريدة في شطف سلالة Cbp1-Bio1 بواسطة العلامات النجمية.

يحدد تحليل MALDI أحد البروتينات على أنه حيوان أليف 309

يمكن استئصال البروتينات الثلاثة ذات الوزن الجزيئي الأعلى الفريدة لـ Cbp1-Bio1 + Xa من الشكل 6B (110 و 85 و 68 كيلو دالتون) من المواد الهلامية أحادية البعد دون المخاطرة بتضمين نطاقات ملوثة. تم جمع هذه العصابات الثلاثة من المواد الهلامية وأعدت لتحليل MALDI كما هو موضح في المواد والطرق. تم الحصول على عدد كافٍ من قمم الببتيد للسماح ببحث عام في قاعدة البيانات عن النطاق 110 كيلو دالتون فقط. خمسة من 10 ببتيدات تم تحديدها من هذه الفرقة تطابق بروتين 113 كيلو دالتون Pet309. Pet309 هو بروتين ميتوكوندريا يحمي ويعزز على وجه التحديد ترجمة كوكس 1 mRNA ، مماثل لوظيفة Cbp1 لـ البوليفيين مرنا (Manthey and McEwen ، 1995). كما هو متوقع ، تطابق اثنان من القمم التجريبية الثلاثة التي تم الحصول عليها لبروتين 68 كيلو دالتون بواسطة MALDI كتل الببتيد النظرية المحددة لبروتين Cbp1. سوف تتطلب هوية البروتينات في النطاقات الفريدة الأخرى تحقيقًا إضافيًا.

تحدد الصفحة الأصلية الزرقاء Pet309 و Cbp1 كمكونات لنفس المركب عالي الوزن الجزيئي

تم استخدام تحليل PAGE الأصلي ثنائي الأبعاد للتحقق من التفاعل المفترض بين Cbp1 و Pet 309. للكشف عن كلا البروتينين في نفس المستخلص ، تم إنشاء سلالة تحتوي على علامة HA Pet309 بالإضافة إلى Cbp1-Bio1 (انظر المواد والطرق) . أدى تعطيل الميتوكوندريا إما عن طريق الصوتنة أو باستخدام المنظفات إلى انقسام بروتين Pet309-HA إلى عدة أجزاء أصغر. ومع ذلك ، وجدنا أن المعالجة المتكررة لتعليق الميتوكوندريا عن طريق فترات التجميد والذوبان البديلة أطلقت ما يكفي من المركب عالي الوزن الجزيئي الذي يحتوي على Cbp1 (بياناتنا غير المنشورة) للسماح بالتحليل بواسطة PAGE الأصلي ثنائي الأبعاد. كما هو مبين في الشكل 7 ، احتوى هذا المستخلص على شريطين مرئيين على الأقل من الأوزان الجزيئية و gt670 كيلو دالتون (الشكل 7 أ). أدت هذه العصابات إلى ظهور نمط بروتين معقد في تغيير طبيعة هلام البعد الثاني كما تصورها تلطيخ الفضة (الشكل 7 ب). تم اكتشاف كل من Cbp1-Bio و Pet309-HA في الممرات الثانية والثالثة (0.6–0.9 سم من أعلى البعد الأول للهلام) التي تحتوي على نطاقات عالية الوزن الجزيئي ، مما يشير إلى أنها جزء من معقد واحد ( الشكل 7 ج). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن كمية كبيرة من البروتين الأحادي Pet309-HA في الممرات المقابلة لوزن جزيئي تقريبي لـ 140 كيلو دالتون (3.3-3.9 سم من أعلى البعد الأول للهلام). وبالمثل ، لوحظ في الغالب أحادي Cbp1-Bio في الممرات المقابلة لأحجام مجمع البروتين أو البروتين من 69-140 كيلو دالتون (3.9-4.5 سم من أعلى البعد الأول للهلام).

الشكل 7. تحليل ثنائي الأبعاد لمستخلص ميتوكوندريا قابل للذوبان من سلالة Cbp1-Bio1 / Pet309-HA. (أ) تم استخلاص البروتينات القابلة للذوبان من الميتوكوندريا Cbp1-Bio1 / Pet309-HA في غياب الملح عن طريق التجميد والذوبان المتكرر والفصل الكهربائي في وجود Serva Blue كما هو موضح في المواد والطرق. تم استخدام جزء من "مجموعة معايرة HMW للرحلان الكهربائي الأصلي" (Amersham Biosciences ، Piscataway ، NJ) كعلامة وزن جزيئي. يشار إلى اتجاه الرحلان الكهربائي بواسطة السهم. (ب) للتحليل اللاحق لتكوين البروتين للمجمعات بواسطة SDS-PAGE ، تم قطع هلام البعد الأول إلى شرائح 3 مم بدءًا من الأعلى. تم تعريض قطع الهلام لـ SDS-PAGE. للمقارنة ، تم أيضًا فصل مستخلص الميتوكوندريا القابل للذوبان (S) كهربائيًا. بعد الفصل ، كانت البروتينات ملطخة بنترات الفضة. على اليسار ، تظهر مواضع بروتينات علامة الوزن الجزيئي ذات البعد الثاني المحوَّل للطبيعة. أدناه ، يتم توضيح المواضع النسبية لعلامات الوزن الجزيئي ذات البعد الأول. (C) تم مسح جل مطابق للجلد الموجود في B على غشاء PVDF وتم فحصه على التوالي باستخدام مضاد HA-peroxidase (المخفف إلى 50 mU / ml) (Roche Diagnostics) للكشف عن Pet309 و Neutravidin-HRP الذي يحمل علامة HA (1: 1500 تخفيف) (بيرس كيميكال) لاكتشاف Cbp1-Bio.


محتويات

تعديل إعداد العينة

قد تكون العينات عبارة عن أي مادة تحتوي على بروتينات أو أحماض نووية. قد تكون مشتقة بيولوجيًا ، على سبيل المثال من الخلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة أو الأنسجة أو الفيروسات أو العينات البيئية أو البروتينات المنقاة. في حالة الأنسجة الصلبة أو الخلايا ، غالبًا ما يتم تقسيمها أولاً ميكانيكيًا باستخدام خلاط (لأحجام عينات أكبر) ، باستخدام الخالط (أحجام أصغر) ، عن طريق سونيكاتور أو باستخدام تدوير الضغط العالي ، ومزيج من الكيمياء الحيوية و يمكن استخدام التقنيات الميكانيكية - بما في ذلك أنواع مختلفة من الترشيح والطرد المركزي - لفصل أجزاء الخلية والعضيات المختلفة قبل الرحلان الكهربي. يمكن أيضًا استخدام الجزيئات الحيوية الاصطناعية مثل أليغنوكليوتيدات كتحليل.

يتم خلط العينة المراد تحليلها اختياريًا مع مادة كيميائية مغيرة للتشبع إذا رغبت في ذلك ، وعادة ما تكون SDS للبروتينات أو اليوريا للأحماض النووية. SDS هو منظف أنيوني يعمل على تغيير طبيعة الهياكل الثلاثية الثانوية وغير المرتبطة بثنائي كبريتيد ، بالإضافة إلى تطبيق شحنة سالبة على كل بروتين بما يتناسب مع كتلته. تكسر اليوريا الروابط الهيدروجينية بين الأزواج الأساسية للحمض النووي ، مما يتسبب في تصلب الخيوط المكونة. يؤدي تسخين العينات إلى 60 درجة مئوية على الأقل إلى تعزيز التمسخ. [7] [8] [9] [10]

بالإضافة إلى SDS ، يمكن اختياريًا تسخين البروتينات لفترة وجيزة إلى ما يقرب من الغليان في وجود عامل الاختزال ، مثل dithiothreitol (DTT) أو 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol / BME) ، مما يؤدي إلى تغيير طبيعة البروتينات عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد ، وبالتالي التغلب على بعض أشكال طي البروتين العالي ، وتفتيت بنية البروتين الرباعية (الوحدات الفرعية قليلة القسيمات). يُعرف هذا بتقليل SDS-PAGE.

يمكن إضافة صبغة تتبع إلى المحلول. هذا عادة ما يكون لديه قدرة تنقل كهربي أعلى من التحليلات للسماح للمختبر بتتبع تقدم المحلول من خلال الهلام أثناء التشغيل الكهربي.

تحضير المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد

تتكون المواد الهلامية بشكل نموذجي من مادة الأكريلاميد ، والبيساكرلميد ، والمحول الاختياري (SDS أو اليوريا) ، وعازل مع درجة حموضة معدلة. يمكن تفريغ المحلول تحت فراغ لمنع تكوين فقاعات هواء أثناء البلمرة. بدلاً من ذلك ، يمكن إضافة البيوتانول إلى الجل المُحلل (للبروتينات) بعد سكبه ، حيث يزيل البيوتانول الفقاعات ويجعل السطح أملسًا. [11] تمت إضافة مصدر للجذور الحرة ومثبت ، مثل بيرسلفات الأمونيوم و TEMED لبدء البلمرة. [12] ينتج عن تفاعل البلمرة مادة هلامية بسبب إضافة بيساكريلاميد ، والتي يمكن أن تشكل روابط متقاطعة بين جزيئين من مادة الأكريلاميد. يمكن أن تتنوع نسبة بيساكريلاميد إلى مادة الأكريلاميد لأغراض خاصة ، ولكن بشكل عام تكون حوالي جزء واحد في 35. يمكن أيضًا أن يتنوع تركيز مادة الهلام من مادة الأكريلاميد ، بشكل عام في النطاق من 5٪ إلى 25٪. تعتبر المواد الهلامية ذات النسبة المنخفضة أفضل لحل الجزيئات ذات الوزن الجزيئي العالي جدًا ، بينما هناك حاجة إلى نسب أعلى بكثير من مادة الأكريلاميد لحل البروتينات الأصغر. يتم تحديد متوسط ​​قطر مسام المواد الهلامية بولي أكريلاميد من خلال التركيز الكلي لمادة الأكريلاميد (٪ T مع T = إجمالي تركيز الأكريلاميد وبيساكرلميد) وتركيز بيساكريلاميد المتصالب (٪ C مع C = تركيز بيساكريلاميد). [13] يتم تقليل حجم المسام بشكل تبادلي إلى٪ T. بالنسبة إلى٪ C ، فإن التركيز بنسبة 5٪ ينتج أصغر مسام ، حيث أن تأثير بيساكريلاميد على حجم المسام له شكل مكافئ برأس عند 5٪.

عادة ما يتم بلمرة المواد الهلامية بين لوحين زجاجيين في عجلة هلامية ، مع إدخال مشط في الأعلى لإنشاء آبار العينة. بعد بلمرة الجل ، يمكن إزالة المشط ويكون الجل جاهزًا للرحلان الكهربي.

تحرير الكهربائي

يتم استخدام أنظمة عازلة مختلفة في PAGE اعتمادًا على طبيعة العينة والهدف التجريبي. قد تكون المخازن المؤقتة المستخدمة في الأنود والكاثود هي نفسها أو مختلفة. [9] [14] [15]

يتم تطبيق مجال كهربائي عبر الهلام ، مما يتسبب في هجرة البروتينات سالبة الشحنة أو الأحماض النووية عبر الهلام بعيدًا عن القطب السالب (وهو القطب السالب الذي يشير إلى أن هذا هو التحليل الكهربائي بدلاً من الخلية الجلفانية) ونحو القطب الموجب (ال الأنود). اعتمادًا على حجمها ، يتحرك كل جزيء حيوي بشكل مختلف خلال مصفوفة الهلام: الجزيئات الصغيرة تتلاءم بسهولة أكبر من خلال المسام في الهلام ، بينما تواجه الجزيئات الأكبر صعوبة أكبر. يتم تشغيل الجل عادة لبضع ساعات ، على الرغم من أن هذا يعتمد على الجهد المطبق عبر انتقال الهلام يحدث بسرعة أكبر عند الفولتية العالية ، ولكن هذه النتائج عادة ما تكون أقل دقة من تلك الموجودة في الفولتية المنخفضة. بعد مقدار الوقت المحدد ، هاجرت الجزيئات الحيوية مسافات مختلفة بناءً على حجمها. تنتقل الجزيئات الحيوية الأصغر إلى أسفل الهلام ، بينما تظل الجزيئات الأكبر أقرب إلى نقطة المنشأ. Biomolecules may therefore be separated roughly according to size, which depends mainly on molecular weight under denaturing conditions, but also depends on higher-order conformation under native conditions. The gel mobility is defined as the rate of migration traveled with a voltage gradient of 1V/cm and has units of cm 2 /sec/V. [3] : 161–3 For analytical purposes, the relative mobility of biomolecules, صF, the ratio of the distance the molecule traveled on the gel to the total travel distance of a tracking dye is plotted versus the molecular weight of the molecule (or sometimes the log of MW, or rather the Mص, molecular radius). Such typically linear plots represent the standard markers or calibration curves that are widely used for the quantitative estimation of a variety of biomolecular sizes. [3] : 161–3

Certain glycoproteins, however, behave anomalously on SDS gels. Additionally, the analysis of larger proteins ranging from 250,000 to 600,000 Da is also reported to be problematic due to the fact that such polypeptides move improperly in the normally used gel systems. [16]

Further processing Edit

Following electrophoresis, the gel may be stained (for proteins, most commonly with Coomassie Brilliant Blue R-250 or autoradiography for nucleic acids, ethidium bromide or for either, silver stain), allowing visualization of the separated proteins, or processed further (e.g. Western blot). After staining, different species biomolecules appear as distinct bands within the gel. It is common to run molecular weight size markers of known molecular weight in a separate lane in the gel to calibrate the gel and determine the approximate molecular mass of unknown biomolecules by comparing the distance traveled relative to the marker.

For proteins, SDS-PAGE is usually the first choice as an assay of purity due to its reliability and ease. The presence of SDS and the denaturing step make proteins separate, approximately based on size, but aberrant migration of some proteins may occur. Different proteins may also stain differently, which interferes with quantification by staining. PAGE may also be used as a preparative technique for the purification of proteins. For example, quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC-PAGE) is a method for separating native metalloproteins in complex biological matrices.

Polyacrylamide gel (PAG) had been known as a potential embedding medium for sectioning tissues as early as 1964, and two independent groups employed PAG in electrophoresis in 1959. [17] [18] It possesses several electrophoretically desirable features that make it a versatile medium. It is a synthetic, thermo-stable, transparent, strong, chemically relatively inert gel, and can be prepared with a wide range of average pore sizes. [19] The pore size of a gel and the reproducibility in gel pore size are determined by three factors, the total amount of acrylamide present (%T) (T = Total concentration of acrylamide and bisacrylamide monomer), the amount of cross-linker (%C) (C = bisacrylamide concentration), and the time of polymerization of acrylamide (cf. QPNC-PAGE). Pore size decreases with increasing %T with cross-linking, 5%C gives the smallest pore size. Any increase or decrease in %C from 5% increases the pore size, as pore size with respect to %C is a parabolic function with vertex as 5%C. This appears to be because of non-homogeneous bundling of polymer strands within the gel. This gel material can also withstand high voltage gradients, is amenable to various staining and destaining procedures, and can be digested to extract separated fractions or dried for autoradiography and permanent recording.

المكونات تحرير

Polyacrylamide gels are composed of a stacking gel and separating gel. Stacking gels have a higher porosity relative to the separating gel, and allow for proteins to migrate in a concentrated area. Additionally, stacking gels usually have a pH of 6.8, since the neutral glycine molecules allow for faster protein mobility. Separating gels have a pH of 8.8, where the anionic glycine slows down the mobility of proteins. Separating gels allow for the separation of proteins and have a relatively lower porosity. Here, the proteins are separated based on size (in SDS-PAGE) and size/ charge (Native PAGE). [20]

Chemical buffer stabilizes the pH value to the desired value within the gel itself and in the electrophoresis buffer. The choice of buffer also affects the electrophoretic mobility of the buffer counterions and thereby the resolution of the gel. The buffer should also be unreactive and not modify or react with most proteins. Different buffers may be used as cathode and anode buffers, respectively, depending on the application. Multiple pH values may be used within a single gel, for example in DISC electrophoresis. Common buffers in PAGE include Tris, Bis-Tris, or imidazole.

Counterion balance the intrinsic charge of the buffer ion and also affect the electric field strength during electrophoresis. Highly charged and mobile ions are often avoided in SDS-PAGE cathode buffers, but may be included in the gel itself, where it migrates ahead of the protein. In applications such as DISC SDS-PAGE the pH values within the gel may vary to change the average charge of the counterions during the run to improve resolution. Popular counterions are glycine and tricine. Glycine has been used as the source of trailing ion or slow ion because its pKa is 9.69 and mobility of glycinate are such that the effective mobility can be set at a value below that of the slowest known proteins of net negative charge in the pH range. The minimum pH of this range is approximately 8.0.

Acrylamide ( C
3 ح
5 NO mW: 71.08) when dissolved in water, slow, spontaneous autopolymerization of acrylamide takes place, joining molecules together by head on tail fashion to form long single-chain polymers. The presence of a free radical-generating system greatly accelerates polymerization. This kind of reaction is known as vinyl addition polymerisation. A solution of these polymer chains becomes viscous but does not form a gel, because the chains simply slide over one another. Gel formation requires linking various chains together. Acrylamide is carcinogenic, [21] a neurotoxin, and a reproductive toxin. [22] It is also essential to store acrylamide in a cool dark and dry place to reduce autopolymerisation and hydrolysis.

Bisacrylamide (ن,ن′-Methylenebisacrylamide) ( C
7 H
10 N
2 O
2 mW: 154.17) is the most frequently used cross linking agent for polyacrylamide gels. Chemically it can be thought of as two acrylamide molecules coupled head to head at their non-reactive ends. Bisacrylamide can crosslink two polyacrylamide chains to one another, thereby resulting in a gel.

Sodium dodecyl sulfate (SDS) ( C
12 H
25 NaO
4 S mW: 288.38) (only used in denaturing protein gels) is a strong detergent agent used to denature native proteins to individual polypeptides. This denaturation, which is referred to as reconstructive denaturation, is not accomplished by the total linearization of the protein, but instead, through a conformational change to a combination of random coil and α helix secondary structures. [6] When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this process, the intrinsic charges of polypeptides become negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit weight. The electrophoretic mobilities of these proteins is a linear function of the logarithms of their molecular weights. Without SDS, different proteins with similar molecular weights would migrate differently due to differences in mass-charge ratio, as each protein has an isoelectric point and molecular weight particular to its primary structure. This is known as native PAGE. Adding SDS solves this problem, as it binds to and unfolds the protein, giving a near uniform negative charge along the length of the polypeptide.

Urea ( CO(NH
2 )
2 mW: 60.06) is a chaotropic agent that increases the entropy of the system by interfering with intramolecular interactions mediated by non-covalent forces such as hydrogen bonds and van der Waals forces. Macromolecular structure is dependent on the net effect of these forces, therefore it follows that an increase in chaotropic solutes denatures macromolecules,

Ammonium persulfate (APS) ( N
2 H
8 S
2 O
8 mW: 228.2) is a source of free radicals and is often used as an initiator for gel formation. An alternative source of free radicals is riboflavin, which generated free radicals in a photochemical reaction.

TEMED (ن, ن, ن′, ن′-tetramethylethylenediamine) ( C
6 H
16 N
2 mW: 116.21) stabilizes free radicals and improves polymerization. The rate of polymerisation and the properties of the resulting gel depend on the concentrations of free radicals. Increasing the amount of free radicals results in a decrease in the average polymer chain length, an increase in gel turbidity and a decrease in gel elasticity. Decreasing the amount shows the reverse effect. The lowest catalytic concentrations that allow polymerisation in a reasonable period of time should be used. APS and TEMED are typically used at approximately equimolar concentrations in the range of 1 to 10 mM.

Chemicals for processing and visualization Edit

The following chemicals and procedures are used for processing of the gel and the protein samples visualized in it.

Tracking dye as proteins and nucleic acids are mostly colorless, their progress through the gel during electrophoresis cannot be easily followed. Anionic dyes of a known electrophoretic mobility are therefore usually included in the PAGE sample buffer. A very common tracking dye is Bromophenol blue (BPB, 3',3",5',5" tetrabromophenolsulfonphthalein). This dye is coloured at alkali and neutral pH and is a small negatively charged molecule that moves towards the anode. Being a highly mobile molecule it moves ahead of most proteins. As it reaches the anodic end of the electrophoresis medium electrophoresis is stopped. It can weakly bind to some proteins and impart a blue colour. Other common tracking dyes are xylene cyanol, which has lower mobility, and Orange G, which has a higher mobility.

Loading aids most PAGE systems are loaded from the top into wells within the gel. To ensure that the sample sinks to the bottom of the gel, sample buffer is supplemented with additives that increase the density of the sample. These additives should be non-ionic and non-reactive towards proteins to avoid interfering with electrophoresis. Common additives are glycerol and sucrose.

Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB)( C
45 H
44 N
3 NaO
7 S
2 mW: 825.97) is the most popular protein stain. It is an anionic dye, which non-specifically binds to proteins. The structure of CBB is predominantly non-polar, and it is usually used in methanolic solution acidified with acetic acid. Proteins in the gel are fixed by acetic acid and simultaneously stained. The excess dye incorporated into the gel can be removed by destaining with the same solution without the dye. The proteins are detected as blue bands on a clear background. As SDS is also anionic, it may interfere with staining process. Therefore, large volume of staining solution is recommended, at least ten times the volume of the gel.

Ethidium bromide (EtBr) is a popular nucleic acid stain. EtBr allows one to easily visualize DNA or RNA on a gel as EtBr fluoresces an orange color under UV light. [23] Ethidium bromide binds nucleic acid chains through the process of Intercalation. [3] While Ethidium bromide is a popular stain it is important to exercise caution when using EtBr as it is a known carcinogen. Because of this fact, many researchers opt to use stains such as SYBR Green and SYBR Safe which are safer alternatives to EtBr. [24] EtBr is used by simply adding it to the gel mixture. Once the gel has run, the gel may be viewed through the use of a photo-documentation system. [3]

Silver staining is used when more sensitive method for detection is needed, as classical Coomassie Brilliant Blue staining can usually detect a 50 ng protein band, Silver staining increases the sensitivity typically 10-100 fold more. This is based on the chemistry of photographic development. The proteins are fixed to the gel with a dilute methanol solution, then incubated with an acidic silver nitrate solution. Silver ions are reduced to their metallic form by formaldehyde at alkaline pH. An acidic solution, such as acetic acid stops development. [25] Silver staining was introduced by Kerenyi and Gallyas as a sensitive procedure to detect trace amounts of proteins in gels. [26] The technique has been extended to the study of other biological macromolecules that have been separated in a variety of supports. [27] Many variables can influence the colour intensity and every protein has its own staining characteristics clean glassware, pure reagents and water of highest purity are the key points to successful staining. [28] Silver staining was developed in the 14th century for colouring the surface of glass. It has been used extensively for this purpose since the 16th century. The colour produced by the early silver stains ranged between light yellow and an orange-red. Camillo Golgi perfected the silver staining for the study of the nervous system. Golgi's method stains a limited number of cells at random in their entirety. [29]

Autoradiography, also used for protein band detection post gel electrophoresis, uses radioactive isotopes to label proteins, which are then detected by using X-ray film. [30]

Western blotting is a process by which proteins separated in the acrylamide gel are electrophoretically transferred to a stable, manipulable membrane such as a nitrocellulose, nylon, or PVDF membrane. It is then possible to apply immunochemical techniques to visualise the transferred proteins, as well as accurately identify relative increases or decreases of the protein of interest.


استنتاج

In conclusion, a storage protein was isolated from the aerial tuber of Dioscorea bulbifera لأول مرة. The storage protein has similar functional properties and structural homology with the storage proteins of other Dioscorea محيط. The storage protein is heat stable and exhibited carbonic anhydrase, dehydroascorbate reductase and trypsin inhibitory activities. It is also a good source of essential amino acids thus, the protein may be suitable for development as functional food.


Native molecular weight determination - using restricted SDS in PAGE (Oct/10/2010 )

I wish to determine molecular weight of the native protein (without dissociating the subunits). My protein will remain and migrate in intact form during the PAGE in the absence of SDS, but since there will be no uniform charge on the molecules, the separation will not occur only on the basis of size, hence I will not be able to determine the exact molecular weight. I am aware of other techniques such as gel filtration, blue-native PAGE which are more commonly used for this purpose. But since they require specialized chemicals and/or equipments, I was looking for a simpler method. While doing so, I came to know from here, that PAGE with restricted SDS can be used for native and subunit molecular weight determination simultaneously . I did one experiment and both native and denatured forms of my two test protein migrated the same distance which I did not expect. My next experiment will be doing the PAGE in the complete absence of SDS, where I wont be able to see the exact weight, but I can at least get an idea of what is happening. Meanwhile, does anybody has the experience with native molecular mass determination with this/similar method?
Thanks for your time

Hi Ram,
If you want to look for a native protein marker,
try look for NativeMark LC0725 from invitrogen
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/LC0725?ICID=search-product

p/s: can you send me (pm) the article that you mentioned? I didn't subscribe to it. شكرا

adrian kohsf on Mon Oct 11 02:58:09 2010 said:

Hi Ram,
If you want to look for a native protein marker,
try look for NativeMark LC0725 from invitrogen
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/LC0725?ICID=search-product

p/s: can you send me (pm) the article that you mentioned? I didn't subscribe to it. شكرا

Thanks for the reply Adrian. I am already using the same marker. Find attached paper in the PM


How Molecular Weight Is Determined

Empirical data on the molecular weight of a compound depends on the size of the molecule in question. Mass spectrometry is commonly used to find the molecular mass of small to medium-sized molecules. The weight of larger molecules and macromolecules (e.g., DNA, proteins) is found using light scattering and viscosity. Specifically, the Zimm method of light scattering and the hydrodynamic methods dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography (SEC), diffusion-ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy (DOSY), and viscometry may be used.


Ribosome: Types, Structure and Functions

The ribosome is one of the essential membrane-bound organelles of the cells. It is a minute spherical structure that contains RNA and protein and serves as the site of protein synthesis. It occurs either freely in the cytoplasm or in the matrix of mitochondria and chloroplast or attached on the outer membranes of the endoplasmic reticulum (ER) and nucleus. The word ribosome comes from ‘ribo’ meaning ribonucleic acid and Greek ‘soma’, meaning body.

Albert Claude first observed the tiny particles or granules of ribonucleoprotein and lipid under an electron microscope and he called them as microsomes in 1943. But Romanian born American Cell Biologist George E. Palade discovered it as dense particles or granules of the cytoplasm in 1955. In 1958, Richard B. Roberts proposed the name “Ribosome”. George E. Palade and other scientists discovered that ribosomes are the protein synthesizer in the cells and for this reason, in 1974 Palade was awarded the Nobel Prize for his great job.

Ribosomes are remarkably plentiful in cells. A mammalian cell contains about 10 billion protein molecules and most of them are produced from the ribosomes. One active eukaryotic cell contains about 10 million ribosomes while the prokaryotic cell (Escherichia coli) contain about 15000-20000 ribosomes which are equal about 25% of the total cell mass. The size of the ribosomes varies within cells which depend on the cell types. The average size of the ribosomes of the Escherichia coli is 200 Å in diameter.

Types of Ribosome

Ribosomes are of two types on the basis of the size and sedimentation coefficient (S) such as the 70S and 80S. Here, ‘S’ refers to Svedberg unit. This is a sedimentation coefficient which shows how fast a cell organelle sediments in an ultracentrifuge.

70S Ribosome: This type of ribosome is comparatively smaller and has sedimentation coefficient 70S which consists of two subunits such as large 50S subunit and small 30S subunit and they are linked together. The molecular weight is 2.7×106 Daltons. They are found in all prokaryotic cells, in mitochondria and chloroplast of eukaryotic cells.

80S Ribosome: This type of ribosome is comparatively larger and has sedimentation coefficient 80S which consists of large circular 60S subunit and small elliptical 40S subunit. The molecular weight is 40×106 Daltons. They are found in all eukaryotic cells.

Physical Structures of Ribosome

Each ribosome contains two subunits, such as a larger one and a smaller one. Ribosomal subunits are made in the nucleolus from the proteins and nucleic acids. Then, through the nuclear pores, they are exported into the cytoplasm. The sizes of the two subunits are unequal and exist in this state until required for use. The larger sub-unit is about two times larger than smaller one

The 40S and 60S are the small and large subunits of eukaryotic cells, respectively, while 30S and 50S are the small and large subunit, respectively of prokaryotic cells. The smaller subunit occurs above the larger subunit-like a cap. The ribosomal subunits occur individually when ribosomes are not involved in protein synthesis. The two subunits join together when protein synthesis starts and undergo dissociation when protein synthesis stops. During protein synthesis, two subunits are grouped and form polyribosome or polysome.

Chemical Structure of Ribosome

Chemically, ribosomes consist of ribosomal proteins and rRNA(ribosomal RNA). In the prokaryotic cells, ribosomes have 40% protein and 60% rRNA while in eukaryotic cells, ribosomes are made up of about 50% protein and 50% rRNA. Besides these, ribosomes also contain trace amounts of Magnesium (Mg), Calcium(Ca) and manganese(Mn).


شاهد الفيديو: محاضرة الوزن الجزيئي للبوليمرات (أغسطس 2022).