معلومة

مشاكل الواجبات المنزلية - وحدة تعلم الأدب: الربط 1 - متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة فيروس كورونا 3C الشبيه بالبروتين: مفتاح - علم الأحياء

مشاكل الواجبات المنزلية - وحدة تعلم الأدب: الربط 1 - متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة فيروس كورونا 3C الشبيه بالبروتين: مفتاح - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ورقة ابحاث: المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة لفيروس كورونا 3C-like Proteinase N Terminus لا غنى عنه للنشاط التحلل للبروتين ولكن ليس لتقليل الإنزيم: التحقيق الكيميائي الحيوي والديناميكي الحراري في الاقتران مع محاكاة الديناميات الجزيئية. شواي تشن ، ليلي تشن ، جينجي تان ، جينغ تشن ، لي دو ، تاو صن ، جيانهوا شين ، كايشيان تشن ، هواليانغ جيانغ ، وشو شين. ج 280 ، العدد 1 ، 164-173 ، 7 يناير 2005


1. قم بتفسير القرص المضغوط التالي لبروتينات S3 و S3-N. لماذا أجروا هذه التجربة؟

رسم بياني 1. تم حذف أطياف القرص المضغوط للطول الكامل والطرف N من SARS 3CLطليعةس. أ، أطياف CD ذات الأشعة فوق البنفسجية البعيدة ذات الطول الكامل () و N- محطة محذوفة () SARS 3CLطليعةق عند 25 درجة مئوية. ب، تتكشف بفعل الحرارة عند 222 نانومتر مع نطاق درجة حرارة من 30 إلى 75 اC للطول الكامل () و N- محطة محذوفة () SARS 3CLطليعةس. كانت تركيزات البروتين المستخدمة في تجارب القرص المضغوط 10 ميكرومتر ، وتم تحضير جميع عينات البروتين في 20 ملي مولار من فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم.

ANS: يوضح الشكل 1 أطياف القرص المضغوط للطول الكامل والطرف Nالبروتينات المحذوفة. تعطي أطياف الأشعة فوق البنفسجية البعيدة للبروتينينذروة موجبة عند 196 نانومتر مميزة لهيكل صفيحة ،وقمم سالبة مزدوجة عند 209 و 222 نانومتر ، على التوالي ، نموذجيةمن هيكل حلزوني β (الشكل 1أ) ، مما يدل على أن الثانويةتم حذف هيكل المحطة N من SARS 3CLطليعة مشابه لأن بروتيناز كامل الطول ، وما شابه ذلك أيضًامن TGEV و HCoV 229E 3CLطليعةس . هذا يستبعد الاحتمالمن سوء التشكيل الهيكلي الناجم عن حذف N-terminal (المخلفات1-7). كان الكشف الحراري المستحث للبروتينينيتم إجراؤها من خلال مراقبة التغييرات المستمرة لإشارات القرص المضغوطعند 222 نانومتر في درجات حرارة تتراوح من 30 إلى 75 اج ،النتائج موضحة في الشكل 1ب. كما في الشكل 1ب يشير إلى أنلا يؤثر حذف N- المحطة بشكل كبير على التمسخسلوك البروتيناز ، والبروتيناز المحذوف N- المحطةيتبنى ملف تعريف تتكشف مستحثًا حراريًا مشابهًا لذلكبروتيناز كامل الطول. درجة حرارة الانتقال (تيم)من البروتين المحذوف N-terminal تم تقديره بـ 60.5اج ،وهو قريب جدًا من بروتيناز كامل الطول ، 61.4اC. تشير كل هذه النتائج إلى أن حذف N- طرفيلم تتغير طريقة الطي والاستقرار الحراري لـبروتيناز.لقد أجروا التجربة لاستبعاد احتمال أن يكون البروتين المقطوع مطويًا بطريقة مختلفة تمامًا.


2. تمت دراسة النشاط الأنزيمي للبروتينين باستخدام ركيزة فلورية جديدة (متفاعلة) ، EDANS-VN_STLQSGLRK (Dabcyl) -M ، والتي تتحلل تمامًا بواسطة البروتازات الشبيهة بالباباين. هذا عبارة عن ببتيد قصير مع طرف أميني dansyl fluorophore ومجموعة C terminus Dabcyl التي لا تتألق ولكن يمكن أن تثيرها الحالة المثارة dansyl fluorophore ، والتي يمكن أن تنقل الطاقة إلى مجموعة Dabcyl في عملية غير إشعاعية ، ولكن فقط إذا إنه قريب جدًا في الفضاء من مجموعة dansyl. يظهر الرسم البياني لنشاط الإنزيم أدناه.

الشكل 2. ملامح مضان تمثيلية للتحلل المائي للركيزة الفلورية بواسطة السارس 3CLطليعةس. تم تحضين الركيزة الفلورية بتركيز 10 ميكرومتر مع 1 ميكرومتر كامل الطول () أو محذوفة N () SARS 3CLطليعة في 20 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 مم DTT ، 1 مم EDTA ، عند 25 ا تم تسجيل زيادة في كثافة الانبعاث الفلورية عند طول موجة 490 نانومتر على فترات 10 دقائق ، السابق = 340 نانومتر. تم تسجيل طيف الانبعاث لأكثر من 4 ساعات. سرعة التفاعل الأولية (0) من الجزء الخطي لمنحنى التقدم ، والذي يتوافق مع ما بين 2 و 10٪ من التحلل المائي للركيزة. نشاط كامل طول السارس 3CLطليعة تم أخذها على أنها 100٪.

أ. قدم شرحًا جزيئيًا لسبب زيادة التألق على انقسام S3 من الركيزة

ANS. عندما يتم شق الببتيد الفلوروجيني ، يتم فصل الفلوروفور ، dansyl ، في الفضاء عن مجموعة dabcyl ، وبالتالي لا يمكن نقل طاقة الحالة المثارة dansyl إلى مجموعة dabcyl. ومن ثم فإنه يفقد الطاقة من خلال التألق في غياب آلية التبريد هذه.

ب. ما هي الاستنتاجات التي يمكنك استخلاصها فيما يتعلق بالنشاط المختلف لـ S3 و S3-N تجاه الركيزة؟

ANS: التحلل المائي للركيزة الفلورية بواسطة السارس كامل الطول3CLطليعة يؤدي إلى زيادة ملحوظة في مضان الانبعاثشدة عند الطول الموجي 490 نانومتر. الملف الشخصي مضانتم توضيح التحلل المائي التالي للركيزة في الشكل 2.كعنصر تحكم ، احتضان الركيزة في المخزن المؤقت للمقايسةفي حالة عدم وجود 3CLطليعة لا يظهر أي تغيير في شدة التألقبمرور الوقت (البيانات غير معروضة). النتيجة تشير إلى أن الفلوروجينيكيمكن تحلل الركيزة بكفاءة بالطول الكاملالسارس 3 سي إلطليعة. سرعة التفاعل الأولية (v0) تم تحديده0.14 ميكرومتر / دقيقة من الجزء الخطي للتقدممنحنى.

كما هو متوقع ، يزداد التألق بعد التحلل المائيمن الركيزة بواسطة N- محطة حذف SARS 3CLطليعة أدناهحد الكشف عن مقايسة النشاط (الشكل 2) ، مما يوحيأن N- محطة حذف 3CLطليعة غير نشط تمامًا تقريبًا.توضح هذه النتيجة بقوة أنه لا غنى عنمحطة N للنشاط الأنزيمي لـ SARS 3CLطليعة


3. إحدى الطرق لتحديد ما إذا كان البروتين يمكن أن يتناقص هو إدخال روابط تساهمية بين الوحدات الفرعية للبروتينات المجاورة في الثنائيات المحتملة أو المتعددة. أحد هذه الكواشف المتقاطعة هو الجلوتارالدهي ، الذي يظهر أدناه.

أ. ارسم آلية لإظهار كيف يمكن أن تتفاعل مع بقايا Lys على بروتينين متجاورين لربطهما.

تم تشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE لكل من S3 و S3-N ، وهي موضحة أدناه.

تين. 3. SDS-PAGE (10 ٪ أكريلاميد) لمحات من الجلوتارالدهيد المتشابك السارس 3CLطليعةس. أ، تحليلات الربط المتقاطع لـ SARS 3CL كامل الطولطليعة. لين 1، 3CL غير المعالجةطليعة (7 مجم / مل) ؛ الممر 2 أ، 3CLطليعة (2 مجم / مل) متصالب بنسبة 0.01٪ جلوتارالدهيد ؛ حارة 2 ب ، 3CLطليعة (2 مجم / مل) متصالب بنسبة 0.1٪ جلوتارالدهيد ؛ الممرات 3 أ و 3 ب، 3CLطليعة (7 مجم / مل) متصالب بنسبة 0.01 و 0.1٪ جلوتارالدهيد ، على التوالي ؛ الممرات 4 أ و 4 ب، 3CLطليعة (1 مجم / مل) ، 0.01 و 0.1٪ جلوتارالدهيد ؛ الممر 5، معايير البروتين مجموعة SDS للوزن الجزيئي هي كما يلي: فسفوريلاز ب (97.0 كيلو دالتون) ، الألبومين (66.0 كيلو دالتون) ، الألبومين البيضاوي (45.0 كيلو دالتون) ، الأنهيدراز الكربوني (30.0 كيلو دالتون) ، مثبط التربسين (20.1 كيلو دالتون) ، -لاكتالبومين (14.4 كيلو دالتون). ب، تحليلات الربط المتبادل لمحطة السارس 3CL المحذوفة Nطليعة. لين 1، معايير البروتين. الممر 2 3CL غير المعالجةطليعة (7 مجم / مل) ؛ الممرات 3 أ و 3 ب، 3CLطليعة (1 مجم / مل) ، 0.01 و 0.1٪ جلوتارالدهيد ، على التوالي ؛ الممرات 4 أ و 4 ب، 3CLطليعة (2 مجم / مل) ، 0.01 و 0.1٪ جلوتارالدهيد ؛ الممرات 5 أ و 5 ب، 3CLطليعة (7 مجم / مل) ، 0.01 و 0.1٪ جلوتارالدهيد.

ب. ما هي الاستنتاجات التي يمكنك استخلاصها فيما يتعلق بقدرة البروتينين على تكوين الثنائيات ؟؟

ANS: عند احتضانه بنسبة 0.01٪ من الجلوتارالدهيد ،عرض بروتينيز كامل الطول بتركيز 1 مجم / ملشكل من أشكال المونومر مع نوع واحد آخر حوالي 66.0 كيلو دالتون (الشكل.3أ, الممر 4 أ) ، المقابلة لثنائي بروتين البروتين.عند تركيز أعلى من الجلوتارالدهيد (0.1٪) ، كامل الطولالسارس 3 سي إلطليعة (1 مجم / مل) أظهر نمط ربط متقاطع مشابه(الشكل 3أ, حارة 4 ب) ، مما يشير إلى أن كمية الجلوتارالدهيدكانت كافية طوال الوقت ولم يحدث أي ارتباط متقاطع اصطناعي.مع زيادة تركيز البروتين ، زاد الشكل القاتموكان مكافئًا تقريبًا لمقدار الشكل الأحاديبتركيز أعلى (7 مجم / مل) (الشكل 3أ, الممرات 2 و 3).تشير هذه النتائج إلى أن تناقص طول السارس كامل الطول3CLطليعة يعتمد على التركيز.

اللافت للنظر ، تم الحصول على نتائج مماثلة مع N-terminalبروتيناز المحذوف. تم حذف الشكل الخافت للطرف Nالسارس 3 سي إلطليعة توجد أيضًا ضمن نطاق واسع من تركيزات البروتين.عند احتضانها بـ 0.01 أو 0.1٪ جلوتارالدهيد ، فإن الطرفية Nتم حذف 3CLطليعة بتركيز 1 مجم / مل معروض أيضًاالأشكال التي تم ترحيلها كمونومر وثنائي (الشكل 3ب, الممرات 3 أو 3 ب) ، في حين كان المونومر هو النوع السائد فيتركيز بروتين منخفض نسبيًا. عند تركيز البروتينإلى 2 مجم / مل ، كانت كمية الأنواع القاتمةمحصنة (الشكل 3ب, الممرات 4 أ و 4 ب). بتركيز أعلى(7 مجم / مل) ، النطاق المقابل لمونومر طرف Nتم حذف 3CLطليعة كان فقط أثخن قليلاً من الثنائى(الشكل 3ب, الممرات 5 أ و 5 ب). تشير هذه النتائج إلى أن يبدو أن حذف N-terminal ليس له أي تأثير على المعتمد على التركيزdimerization من 3CLطليعة. من الواضح أن هذه النتيجة ليس تماما بما يتفق مع الاستنتاج الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا ، والذيمن المفترض أن تلعب المحطة N دورًا مهمًا في كليهماdimerization وتشكيل الموقع النشط لـ SARS 3CLطليعة


4. لمزيد من الدراسة لسلوك المحلول الخاص بالبروتين ، تم إخضاعهم للترشيح الهلامي (يسمى أيضًا بالكروماتجرافي لاستبعاد الحجم) على Superdex 75. النتائج موضحة في الشكل 4 أدناه.

الشكل 4. تحليلات لتوازن مونومر ثنائي السارس لـ SARS 3CLطليعةبواسطة SEC. أ، ملامح شطف كامل طول السارس 3CLطليعة عند درجة حموضة محايدة (7.5) وتركيزات 1 () ، 2 مجم / مل () و 7 مجم / مل (). يتم أيضًا عرض ملفات تعريف الشطف لأربعة بروتينات محددة ، ريبونوكلياز أ (15.6 كيلو دالتون) ، كيموتريبسينوجين أ (22.8 كيلو دالتون) ، والألبومين (48.9 كيلو دالتون) ، والألبومين (65.4 كيلو دالتون) ، على شكل خطوط متقطعة. نسب الثنائى / المونومر لتركيزات 1 و 2 و 7 مجم / مل هى 0.68 و 0.71 و 0.84 على التوالى. ب، حذف ملامح شطف N- محطة سارس 3CLطليعة عند درجة حموضة محايدة (7.5) وتركيزات 1 (), 2 () و 7 مجم / مل (). يتم عرض ملفات تعريف شطف بروتينات العلامة على شكل خطوط متقطعة. نسب ثنائي / مونومر لتركيزات 1 و 2 و 7 ملغ / مل هي 0.65 و 0.66 و 0.80 على التوالي. في تجربة SEC-FPLC ، تم تحميل كل عينة بروتين إلى عمود HiLoad 16/60 Superdex 75 الإعدادية الذي تمت معايرته مسبقًا مع المخزن المؤقت ثم تمت التصفية منه بمعدل تدفق قدره 1 مل / دقيقة مع اكتشاف الامتصاصية عند 280 نانومتر. كان المخزن المؤقت المستخدم 20 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار من فوسفات الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA. تم استخدام منحنيات المعايرة القياسية لتحديد الكتل الجزيئية للشكل الأحادي والشكل الخافت للطول الكامل (ج) و N- محطة محذوفة (د) السارس 3 سي إلطليعةس. يشار إلى أحجام شطف من البروتينات المحذوفة كاملة الطول و N- المحطة بواسطة دوائر مفتوحة () وللبروتينات الواسمة بواسطة الدوائر المملوءة. الخامسه و الخامس0 هي ذروة حجم الشطف وحجم الفراغ العمود ، على التوالي ، و الخامسر هو الحجم الإجمالي للسرير.

أ. لماذا قاموا بتغيير تركيز كل بروتين.

الإجابة: لمعرفة ما إذا كان التباين يعتمد على التركيز ، وهو أمر متوقع إذا كان هناك توازن بسيط بين المونومر والثنائي (مع عدم وجود بوليمرات أعلى) ، يتميز بـ Kd محدد.

ب. ما هي الاستنتاجات التي يمكنك استخلاصها فيما يتعلق بقدرة البروتينين على تكوين الثنائيات؟

من أجل الحصول على مزيد من التبصر في توازن ثنائي المونومرمن سارس 3CLطليعة في الحل وتقييم الدور بالضبطمن حذف N- محطة في 3CLطليعة dimerization ، تحليلات SECعلى عمود HiLoad 16/60 Superdex 75 الإعدادية تم حملهاخارج. النتيجةيتم تمثيله في الشكل 4. تمت معايرة العمود أولاً باستخدامأربعة بروتينات علامة لتقييم ملامح الشطفمن عينات البروتين. في تجارب الترشيح الهلامي تحتظروف مماثلة لتلك الخاصة بالربط الكيميائي SDS-PAGEجمع البيانات ، الحالات المادية المقابلة للمواطنثنائى ومونومري 3CLطليعةوقد لوحظت في نطاق واسعمن تركيز البروتين. للطول الكامل 3CLطليعة (1 مجم / مل)عند درجة حموضة محايدة (7.5) ، تمركز قمتان عند 44.57 و 62.14 مللوحظ (الشكل 4أ). حقيقة أن الذروة عند 62.14 ملبين أحجام الاحتفاظ 57.22 و 67.89 مل من أجلاثنين من بروتينات علامة الكتلة الجزيئية 48.9 و 22.8 كيلو دالتون تحتتشير ظروف مماثلة إلى أن هذه الذروة تتوافق معحالة مونومر السارس 3CLطليعة (35.8 كيلو دالتون). تركزت القمة الأخرىعند 44.57 مل أقل من حجم الاحتفاظ البالغ 51.72 مل من أجلبروتين علامة الكتلة الجزيئية 65.4 كيلو دالتون ، وهو جيديعزى إلى الأنواع القاتمة من 3CLطليعة. هذه الملاحظةوبالتالي يشير إلى أن 3CL كاملة الطولطليعةق تحت الظروفتمت دراسة كل من أشكال المونومر والثنائي. كميةيمكن قياس أشكال الثنائيات والمونومر من خلال التكاملقيمة المنطقة من قمتين متقابلتين.

ج. تعطي المناطق المتكاملة للقمم نسب دايمر / مونومر 0.68 و 0.71 و 0.84 لتركيزات بروتين 1 و 2 و 7 مجم / مل. اكتب تعبير التوازن الكيميائي والرياضي للعملية وباستخدامهما ، اشرح ما إذا كان من المتوقع حدوث اختلاف في نسبة الثنائيات / المونومر.

مونومر (م) + مونومر (م) <=> ديمر (د)

كد = [M] [M] / [D]

هذا التوازن مختلف عن M + L <=> ML البسيط الذي واجهناه من قبل. في هذه الحالة ، حصلنا على إجمالي ثابت M ، ومتنوع L ، وحدد ML تجريبيًا ، ثم استخدمنا العديد من الطرق لاستخراج Kد، بما في ذلك ملاءمة بيانات ML مقابل L (أو Y مقابل L) لتناسب غير خطي زائدي ، أو مخطط مزدوج متبادل ، أو مخطط Scatchard. في هذه الحالة ، يختلف كل من M و L (وهو في هذه الحالة M أيضًا). ومع ذلك ، لا تزال تتوقع رسمًا بيانيًا لـ D مقابل M لإظهار التشبع الأساسي ، ولكن نظرًا لأنك تضيف M باستمرار ، فسيكون M المجاني متاحًا دائمًا ، لذلك لن يكون لجزء التشبع من المنحنى ميلًا صفرًا ولكن بعض الأرقام الموجبة الصغيرة كما هو مبين أدناه.

هناك العديد من المعادلات التي يمكن استخدامها لوصف المنحنى. هنا واحد:

جيه مول. (2003) 334 ، 403-419

أين سيا = التركيز الكلي للبروتين ، و [M] هو تركيز المونومور الحر.

نعم ، بناءً على المعادلات أعلاه ، والتي ستظهر بوضوح مرة أخرى أن 3CLطليعة dimerization يعتمد على التركيز.هذا يتفق مع النتائج التي تم الحصول عليها من الجلوتارالدهيدعبر الربط بين قرارات SDS-PAGE.


5. تم بعد ذلك دراسة التفاعل بين المونومر / الثنائى بواسطة قياس حراري معايرة بالمعايرة الحرارية. في التجارب ، تتركز تم حقن البروتين (حوالي 500-600 ميكرومتر أو 16-17 مجم / مل) في محلول منظم وقياس تغيرات المحتوى الحراري. النتائج معروضة أدناه. لاحظ أن جميع حقن البروتين تعطي + قيم المحتوى الحراري التي تشير إلى أن العملية ماصة للحرارة.

5.

الشكل 5. بيانات التخفيف المسعرية النموذجية التي يقاسها مركز التجارة الدولية. أ، ملف التخفيف المسعرى للسارس كامل الطول 3CLطليعة ثنائيات. أحجام متتالية 10 ميكرولتر من 572.5 ميكرومتر 3CLطليعة (حوالي 17 مجم / مل) تم تخفيفه إلى 1.43 مل من 20 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 مم EDTA ، عند 25 اC (باستثناء حاقن أولي بحجم 3 ميكرولتر). لاحظ أنه تم إذابة البروتين في نفس المحلول المنظم. ب, التأثيرات الحرارية المخففة المتكاملة للسارس كامل الطول 3CLطليعة، مع النوبات النظرية من خلال نموذج بسيط أحادي ثنائي المونومر لإعطاء a كد من uM وتغير المحتوى الحراري ثنائي الأبعاد (ΔHاثنائيات) من -8.283 + 0.103 كيلو كالوري / مول. ج، ملف تعريف التخفيف المسعر لـ N- محطة محذوفة SARS 3CLطليعة. استجابات ماصة للحرارة للحقن المتتابعة 10 ماي من 544.6 ميكرومتر 3CLطليعة في المخزن المؤقت تم قياسه تحت نفس الظروف ، باستثناء الحقن الأولي 3-ul. د، التأثيرات الحرارية المخففة المتكاملة لـ N- محطة محذوفة SARS 3CLطليعة ، مع النوبات النظرية لتحقيق أ كد من 262 + 15 أوم و ΔHاديميرزيشن من -6.893 + 0.25 كيلو كالوري / مول.

أ. اكتب معادلة كيميائية توضح بوضوح العملية التي تحدث عندما يتم حقن أول بروتين S3 في خلية المسعر. احسب التركيز الأولي لـ S3 في اللحظة (t = 0) التي يتم حقنها في خلية المسعر. ما هي حالة البروتين المخفف عند t = 0 وفي نهاية الزيادة الزمنية التي تشير إليها عودة منحنى المحتوى الحراري إلى قيمة خط الأساس بعد الحقن الأول (أي عند نهاية الارتفاع في المحتوى الحراري لأول 10 ul حقن البروتين).؟

الإجابة: قاموا بحقن 3 مايكرولتر من البروتين المركز في البداية ، والذي نظرًا لتركيزه الشديد فإنه سيكون موجودًا في الغالب في شكل قاتمة. عند حقنها في 1.42 مل من المحلول المنظم ، تم تخفيف البروتين بمقدار 474 ضعفًا ، مما يجعل تركيز البروتين في الخلية بعد الحقن الأول 572.5 ميكرومتر / 474 = 1.21 ميكرومتر بروتين. إذا كانت النقطة الأولى في الرسم البياني كانت عندما تم حقن 10 ميكروليتر ، فسيكون التخفيف 1.43 / 0.01 = 1 إلى 143 وسيكون تركيز البروتين في الخلية 572.5 / 143 = 4.0 ميكرومتر بروتين = 0.004 ملي مولار ، والذي يشبه التركيز معروض للحقن الأول على الرسم البياني. إذا كان Kd هو 227 uM ، فإن أيًا من هذين البروتينين سيكون أقل بكثير من Kd. في اللحظة التي تم حقنها فيها ، t = 0 ، سيكون البروتين ثنائي الأبعاد. ومع ذلك ، فإنه سينفصل على الفور ، بالنظر إلى تركيز البروتين الكلي في الخلية ، مع تغير المحتوى الحراري المصاحب.

ومن ثم ، فإن العملية الوحيدة التي ستحدث عند التخفيف الأولي هي تفكك الثنائى ، أو

D (ديمر) -> 2 م (مونومر)

ب. لماذا يصبح تغير المحتوى الحراري أصغر وأصغر (كما هو موضح في الشكل 5 ب) حيث يتم إضافة بروتين أكثر تركيزًا إلى خلايا قياس السعرات الحرارية.

الإجابة: كلما تم حقن المزيد والمزيد من البروتين في المحلول في الحالة الأحادية ، فإن التوازن في الحقن اللاحقة يتم إرجاعه مرة أخرى إلى تكوين ثنائي (حيث يتجاوز تركيز المونومر Kd). في نهاية المطاف ، لن ينفصل الشكل القاتم ولن يؤدي أي تغيير في المحتوى الحراري إلى التخفيف. سيرتفع التركيز الفعال للمونومر. في الرسم البياني ، يحدث تغيير المحتوى الحراري عندما ينفصل الثنائيات. تظهر الإشارة العظيمة في البداية. كلما تمت إضافة المزيد والمزيد من 10 ماي قسامات ، يتراكم المونومر وينفصل ثنائى أقل

ج. احسب ΔG0 و ΔS0 لتوازن dimerization لـ S3.

الإجابة: إذا كنت تعرف Kd و ΔH0، يمكنك تحديد المعلمات الديناميكية الحرارية المذكورة أعلاه ، منذ ذلك الحين ،

ΔG0 = -RTlnKeq = + RTlnKd = H0 -T ΔS0 .

ذكرت الورقة أن Kd = 227 مم و ΔH0 = -8.28 كيلو كالوري / مول. :

ΔG0 = -5.0 كيلو كالوري / مول ؛ ΔS0 = -11 كال / مول درجة كلفن

د. ما هي الاستنتاجات التي يمكنك استخلاصها فيما يتعلق بقدرة البروتينين على تكوين الثنائيات؟

الإجابة: المقياس الحراري النموذجيملف التخفيف من 3CL كامل الطولطليعة يظهر في الشكل.5أ، مما يدل على أن عملية التخفيف ماصة للحرارة.هذا يتفق مع الظاهرة المشتقة من المادة الكيميائيةتحلل SDS-PAGE و SEC المتشابكة للربط أن 3CLطليعة ديميرزيشنيعتمد على التركيز (الشكلان 3 و 4). تسلسلتنتج حقن التخفيف سلسلة من النبضات الحرارية الماصة للحرارةوالتي ، بعد الدمج والتصحيح للتحكم في الخلط المؤقتالتجارب ، يعطي امتصاص الحرارة المطلق لكل حقنة. فيمثل سلسلة التخفيف ، تصبح الحقن المتتالية تدريجيًاأقل ماص للحرارة مثل 3CLطليعة يزيد التركيز فيعينة خلية. ملف التخفيف الحراري الناتج متسقمع نموذج بسيط لتفكك ثنائي المونومر. في مماثل الطريقة ، تم حذف ملف التخفيف المسعر للطرف N3CLطليعة تم الحصول عليها ، وهو موضح في الشكل 5 ، ج و د، مشيراأن dimerization من البروتين المحذوف N- محطة أيضا ماص للحرارة وتعتمد على التركيز. فيما يلي القيم المجدولة الفعلية:


الجدول الأول
المعلمات الديناميكية الحرارية لـ SARS 3CLطليعة dimerization في 25 اC و pH 7.5

السارس 3 سي إلطليعة
كدأ
ΔH0قاتمةΔG0قاتمة
ΔS0قاتمة
امكيلو كالوري / مولكيلو كالوري / مولكال / مول ك
مكتمل الطول227 + 34-8.283 + 0.103-4.968 + 0.083-11.124 + 0.163
تم حذف محطة N

262 +15

-6.893 + 0.250

-4.879 + 0.033

-6.758 + 0.729


6. تم إجراء عمليات محاكاة الديناميات الجزيئية من ملف pdb لـ S3 (حيث تحتوي خلية الوحدة على ثنائيات) والنماذج التي تستند إليها لـ S3-N. تظهر النمذجة أن S3-N يشكل ثنائيات ولكن بجيب ربط منخفض للركيزة. لتأكيد ذلك ، تم تصنيع ركيزة صغيرة من الببتيد ، TSAVLQ. يمثل هذا التسلسل الطرفي N لأفضل ركيزة ببتيد تم الإبلاغ عنها للإنزيم. تم تحديد ألفة ربط الببتيد لـ S3 و S3-N بواسطة مستشعرات الرنين الحيوي السطحية. تم تجميد S3 أو S3-N في الخلايا لشريحة الاستشعار من Biacore. تم تدفق العازلة بشكل مستمر على الشريحة المشتقة. تم تخفيف الببتيد في محلول منظم وحقن بتركيزات متزايدة من 20-500 ميكرومتر. تم تسجيل الاستجابات الملزمة بشكل مستمر في وحدات الرنين (RU) كأجهزة استشعار. النتائج معروضة أدناه.

الشكل 7. تم حذف التقارب الملزم لببتيد الأحماض الأمينية 6 (TSAVLQ) بالطول الكامل والطرف N المحذوف SARS 3CLطليعةs التي يحددها SPR. قياسات تقارب ملزمة في الوقت الحقيقي للببتيد مع SARS 3CL كامل الطولطليعة (أ) والبروتيناز المحذوف N- طرفي (ب) باستخدام Biacore 3000. تم الحصول على مجسات تمثيلية من حقن الببتيد بتركيزات 500 و 250 و 100 و 50 و 20 ميكرومتر (منحنيات من أعلى إلى قاع). تم حقن الببتيدات لمدة 60 ثانية (120-180 ثانية) ، وتمت مراقبة التفكك لأكثر من 120 ثانية (من 180 إلى 300 ثانية).

أ. اكتب تعبير التوازن الكيميائي لتفاعل البروتين والببتيد موضحًا ثوابت المعدل المناسب. ما هو ثابت (Kd، kإلى الأمام، أو كيعكس يمكن تحديدها من البيانات في النطاق 120-180s؟ 180-300؟

ANS: في النطاق 120-180 كإلى الأمام (أو كتشغيل) ، بينما بعد 180 ثانية ، عند عدم إضافة المزيد من الببتيد ، kيعكس (أو كإيقاف) يقاس

ب. من كإلى الأمام و كيعكسكيف يمكنك تحديد Kd؟

ANS: يتم إعطاء رد الفعل الأمامي بواسطة M + L -> ML ، ومعادلة السرعة هي: vF = كإلى الأمام[م] [ل].

يتم إعطاء رد الفعل العكسي بواسطة ML -> M + L ، ومعادلة السرعة هي: vص = كيعكس[ML].

عند التوازن ، vF = كإلى الأمام[M] [L] = vص = كيعكس[ML]. بالتالي

كيعكسإلى الأمام = [M] [L] / [ML] = كد.

ج. قارن وفسر الرسمين البيانيين. هل البيانات متوافقة مع التجارب الأخرى؟

لبروتيناز كامل الطول (الشكل 7أ) ، نتج عن الببتيدزيادة كبيرة وتعتمد على الجرعة في وحدات استجابة SPRوقدمت خاصية الارتباط السريع والتفكك البطيءمنحنيات ، مما يشير إلى تكوين بروتين-ببتيد سريع ومستقر نسبيًامركب. تم تركيب سلسلة تركيز الببتيد في حالة مستقرة نموذج ملزم مشفر في برنامج التقييم Biacore 3000لتحديد تقارب ملزم. ثابت التفكك(كد القيمة) بين الركيزة الببتيد والطول الكاملتم تحديد بروتيناز بحوالي 152 ميكرومتر. لمحطة Nالبروتيناز المحذوف ، وهو بروتين ضئيل ومستقل عن التركيز تم الحصول على زيادة RU (الشكل 7ب) ، مشيرا إلى أن تقريبا لا يوجد ارتباط بين الركيزة الببتيد والطرف N بروتيناز المحذوف. هذه النتيجة تتفق مع النتائجمن محاكاة MD أعلاه ..


شاهد الفيديو: كوفيد-19 فيروس كورونا المستجد و مضاعفات الجهاز التنفسي و الرئتين COVID-19 SARS-CoV2 Lung Pathology (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Calix

    أعتقد أن الأخطاء ارتكبت. دعونا نحاول مناقشة هذا. اكتب لي في رئيس الوزراء ، تحدث.

  2. Cuinn

    أعتقد أنه خطأ. اكتب لي في PM ، ناقشها.

  3. Sully

    انت لست على حق. أدعوك للمناقشة. اكتب في رئيس الوزراء ، سوف نتواصل.

  4. Bagar

    أنا آسف ، لكن لا يمكنني مساعدتك. أعلم أنك ستجد الحل الصحيح. لا تيأس.

  5. Prometheus

    كان هناك الكثير من الحديث عن ذلك. لكنني أعتقد أنها هراء.

  6. Ceallach

    هذه فكرة جيدة. انا مستعد لدعمك



اكتب رسالة